圖五、兩階段發酵法之菌液製備流程
Fig. 5. Preparation of Acetobacter xylinum stock culture for a two-stage fermentation process.
(Sheu, 1996)
Coconut water/milk
¾
Add sugar to 10oBrix
¾
Add glacial acetic acid to pH4.0
¾
Add 0.5% NH4H2PO4
¾
Coconut water medium
¾
Sterilize the medium
¾ Cool
¾
Inoculate Acetobacter xylinum stock culture to the medium (2:5 v/v)
¾
Preculture in an air-lift fermenter (0.25 v/v/min aeration at 30oC for 2 days)
¾
圖六、生產那塔二階段發酵法之第一階段流程
Fig. 6. The first stage of a two-stage fermentation process developed for industrial production of nata de coco.
(Sheu, 1996) Preculture broth
Coconut water/milk
¾
Add sugar to 10oBrix
¾
Add glacial acetic acid to pH4.0
¾
Add 0.5% NH4H2PO4
¾
Coconut water medium
¾
Sterilize the medium
¾ Cool
¾
Mix the medium with preculture broth (10:1 v/v) aseptically
¾
Distribute to plastic trays, cover with sterilized newspaper
¾
Let stand undisturbed at 30oC for 7 days
¾
Harvest nata layer on the surface
¾
圖七、生產那塔二階段發酵法之第二階段流程
Fig. 7. The second stage of a two-stage fermentation process developed for industrial production of nata de coco.
(Sheu, 1996) Nata de coco
Ross 等人 (1991)提出醋酸菌合成纖維素之可能代謝途徑分為四 個步驟；
(1) 葡萄糖經葡萄糖激酶 (glucokinase)作用進行磷酸化反應，生成葡 萄糖-6-磷酸鹽 (glucose-6-phosphate)。
(2) 生成葡萄糖-6-磷酸鹽經磷酸葡萄糖變位酶 (phosphoglucomutase) 作用進行異構化反應，生成葡萄糖-1-磷酸鹽 (glucose-1-phosphate)。
(3) 葡萄糖-1-磷酸鹽經尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDPG-pyroph -osphorylase)作用生成尿苷二磷酸葡萄糖 (UDP-glucose)。
(4) 尿苷二磷酸葡萄糖經纖維素合成酶 (cellulose synthase)作用將葡 萄糖接至纖維素多醣鏈上。
Glucose Gluconic acid
細胞質膜
Glucose Gluconic acid
Glucokinase
G-6-P
Phosphoglucomutase 6-phosphogluconic acid G-1-P
UDPG pyrophosphorylase
UDP-glucose
Cellulose synthetase
Cellulose
圖八、纖維素的生合成途徑
Fig. 8. Pathway of cellulose synthesis by Acetobacter.
(深谷和川村，1994)
PDE synthetase
pGpG pGpG
Fig. 9. Model of cellulose formation by Acetobacter.
(深谷和川村，1994)
Mannitol Fructose ~P
Hexose-P
Glycerol F-1,6-P
DHA ~P Triose-P
PGA
Modified G-P + UDP UDPG + P UDPG + Cellodextrin
Cellulose + UDP
(by transglucosidase) 6-P-G
~P Glucose
Reactions which have been experimentally demonstrated Reactions which are presumed to take place
~P Gluconate
圖十、Acetobacter aceti subsp. xylinum 合成纖維素之可能代謝途徑 Fig. 10. Presumable pathways of cellulose synthesis by Acetobacter aceti subsp. xylinum.
(Banzon et al., 1990)
Yamanaka 等人 (1989)以掃描式電子顯微鏡觀察醋酸菌時發現，
醋酸菌形成之纖維是三向分叉狀 (three-way branching )。此結果被認 為是菌體分裂時，菌體母細胞將微纖維分配至子細胞，子細胞又持續 合成纖維所致，圖十一為分叉之形成機制 (Yamanaka et al., 1989)。而 此分叉又會在下一次分裂的時候產生，最終形成了網狀構造。
(四) 影響那塔生產之因子 1. 那塔生產菌株
生產那塔的菌株種類很多， Jesus 等人 (1971)從各種水果表面分 離出菌種，再以相同條件培養觀察其那塔的生長狀況。結果顯示不同 的來源的菌，產量也有明顯的差異。生產那塔的時候，通常會選擇生 產效率較好的菌，可有效縮短生產的時間，施予不同加工條件時，差 異也比較顯著 (Jesus et al., 1971)。
Cannon 等人 (1991)的研究指出，目前有多種菌屬如 Acetobacter,
Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, Sarcina 等都有可以生成纖維
素的菌種，表四為可生成那塔的菌屬。而諸多菌種中以木質醋酸菌 (Acetobacter xylinum)所生產的量最多 (Ross et al., 1991)。2. 溫度
Lapuz 等人 (1967)以木質醋酸菌生產那塔的研究發現，菌株生產 那塔的溫度範圍是15-35oC，而有最大產量的溫度則是在室溫 28-31oC 之間，此溫度即為那塔發源地菲律賓日常之氣候溫度。且在那塔生成 的實驗組當中，也發現在28-31oC 之下醋酸菌生成的速率最快，在 72 小時就可以觀察到那塔的生成，其他兩組有生成那塔的實驗組則是要 等到七天之後。
圖十一、原纖維分叉之形成機制
Fig. 11. The formation mechanism of branches in fibrils.
(Yamanaka et al., 1989) cell
cell cell Division Branch
Fibri
表四、細菌纖維素之生產菌株
Table 4. Survey of bacterial cellulose producer.
Organism(genera) Cellulose produced Cellulose assay Biological role
Acetobacter
Extracellular pellicle Cellulose synthase To Hold aerobicCellulose ribbons X-ray diffraction environment Alkali insolubility To colonize natural
Fluorescent substrates
brightener
Degradation by
cellulase
Agrobacterium
Short extracellular X-ray diffraction Attach to plantfibrils Alkali insolubility tissue
Fluorescent
brightener
Degradation by
cellulase
Rhizobium
Short extracellular X-ray diffraction Attach to hostfibrils Alkali insolubility tissue
Fluorescent
brightener
Degradation by
cellulase
Pseudomonas
No distinct fibrils Alkali insolubility Flocculation inDegradation by wastewater
cellulase
Sarcina
Amorphous cellulose Alkali insolubility Unknow(Cannon et al., 1991)
3. pH 值
Masaoka 等人(1993)將木質醋酸菌放在不同 pH 值的培養基培 養，觀察那塔生成的情況之實驗發現，不同起始 pH 值所得到的合成 速率也有差異。在最適合的 pH 值範圍有較高的合成速率。實驗並沒 有提到最終產量，但是從速率上來看， pH 值影響的結果已經非常的 明顯。生產那塔若可維持在適當的 pH 值範圍，不但可在單位時間內 得到最大的產值，也縮短了加工時間。 Embuscado 等人 (1994a)提出，
pH 值在 4.5-5.0 的範圍內細菌纖維素產量最高。Masaoka 等人 (1993) 研究不同 pH 值下之那塔生產速率如圖十二。
4. 碳源
Embuscado 等人 (1994a)研究發現以木質醋酸菌為發酵菌種，在 7%的添加糖濃度之下，單一種糖當作碳源時，果糖與蔗糖的產量明 顯較高，其中又以果糖為最佳的碳源。 Ebuscado 等人 (1994a)指出 果糖是醋酸菌合成那塔的最佳受質，而蔗糖則因為是雙糖，所以使用 蔗糖當為碳源時的速率會比較慢，因而造成兩者之間產量的微些差 異。此外木質醋酸菌也因其會利用成本較低的蔗糖且產量差異不大，
因此被選為加工用菌種。 Embuscado 等人 (1994a)將兩種以上的糖混 合添加時，也是含有果糖或蔗糖的混合碳源，會有較好的產量，但有 葡萄糖的碳源，產量明顯降低，結果如表五。 Son 等人 (2001)的研 究指出，添加不同種類的糖與有機酸作為碳源時，在2%的添加濃度
圖十二、不同 pH 值下之那塔生產速率
Fig. 12. Nata formation rate of different pH value.
(Masaoka et al., 1993)
表五、添加單一碳源或混合碳源所得之纖維素產量 Table 5. Cellulose yield of add single or mix carbon source.
Sugar Cellulose (g/l) Final pH Fructose 7.38 ± 0.38 4.40 Glucose 1.00 ± 0.05 3.01 Sucrose 5.25 ± 0.28 4.77 Lactose 1.62 ± 0.07 5.00 Fructose + glucose 1.00 ± 0.03 3.09 Fructose + sucrose 6.38 ± 0.32 4.42 Fructose + lactose 5.44 ± 0.32 4.50 Glucose + sucrose 1.50 ± 0.04 3.04 Glucose + lactose 0.75 ± 0.03 3.08 Sucrose + lactose 2.50 ± 0.06 4.88
(Embuscado et al., 1994a)
表六、添加不同碳源所得之纖維素產量
Table 6. Cellulose yield of add different carbon source.
Cells were cultivated in the standard medium with an carbon-source concentration of 2% (w/v or v/v).
Carbon source Cellulose yield (g/l)
Fructose 2.53
Glucose 2.7
Maltose 0.62
Sucrose 0.83
Trehalose 2.57
Mannitol 0.64
Arabitol 0.85
Acetic acid 0.38
Lactic acid 2.1
Succinic acid 0.3
(Son et al., 2001)
利用葡萄糖時產生的葡萄糖酸 (gluconic acid)會使得 pH 值下降較 快，反而有礙那塔的生成。但 Lapuz (1967)及 Embuscado (1994a)等 人提出蔗糖含量在5-15%時，木質醋酸菌會有較高的那塔產量。
5. 氮源
Embuscado (1994a)等人以有機氮源和無機氮源以單一或混合添 加到培養基中，觀察對生成那塔產量的影響，使用的氮源濃度維持在 0.08%再加上 7%的蔗糖。結果發現以有機氮源 peptone 的培養基生成 那塔有最好的產量，依次是 tryptone, yeast extract 等。以表七的數據 可推論，有機氮源比無機氮源更有利於木質醋酸菌生成那塔。不過 Embuscado (1994a)等人也提到， peptone 不是一個良好的氮源，因為 peptone 會影響木質醋酸菌產生交錯結構較為鬆散的纖維素膜。至於 混合氮源與單一氮原的差異並不顯著。 Son 等人 (2001)的研究則指 出，最好的氮源是 0.5%的玉米浸漬液 (corn steep liquor)，玉米浸漬 液是浸漬去皮玉米的水再經過蒸發後所殘留的液體，浸漬液內含有 2.7-4.5%的粗蛋白、 1.0-1.8%的胺基態氮、 0.1-11%的還原糖、5-15%
的乳酸與 9-10%的灰份 (Liggett, 1948)。 Lapuz (1967)等人的研究 指出，氮源濃度過高或過低於 0.5%時，皆不利於那塔生產菌株的生 長，而添加 0.5% NH4H2PO4 當為氮源時，那塔的產量最高。
6. 有機酸
表七、添加不同氮源所得之纖維素產量
Table 7. Cellulose yield of add different nitrogen source.
氮源 纖維素產量 (g/l)
A. 無機
(NH4)2SO4 2.38 ± 0.10 (NH4)H2PO4 2.44 ± 0.11
KNO3 0.38 ± 0.09
B. 無機 + 無機
(NH4)2SO4 + (NH4)H2PO4 2.38 ± 0.20 (NH4)2SO4 + KNO3 1.12 ± 0.18 (NH4)H2PO4 + KNO3 1.75 ± 0.08 C. 有機
蛋白腖 5.12 ± 1.01
胰化蛋白腖 3.88 ± 0.18
酵母抽出物 3.88 ± 0.20
尿素 1.25 ± 0.05
D. 有機 + 有機
蛋白腖 + 酵母抽出物 5.25 ± 0.30 蛋白腖 + 胰化蛋白腖 4.75 ± 0.32
尿素 + 胰化蛋白腖 2.25 ± 0.15
尿素 + 蛋白腖 2.12 ± 0.20
(Embuscado et al., 1994a)
與琥珀酸 (succinic acid)可增加產量，但醋酸與檸檬酸超過 0.4%或是 琥珀酸超過 1.6%時則會降低產量。若培養基僅含有機酸而沒有葡萄 糖存在時，菌體則不會生長。 Alaban (1967)等人的研究則指出，以 椰水進行發酵時，最理想的有機酸及添加量為2-4%的冰醋酸。
7. 氧氣
Guzman (1982)利用沉降式發酵法 (submerged process)培養生成 那塔時，利用幫浦將空氣打入培養液中提高氣體含量後發現，此一方 法大量提高了培養液中菌體的數量，也加速了那塔的合成。此方法那 塔總產值比傳統方法高 49.05%，且於第九天時，產量即達到實驗結 束時總產量的 71.52%，生產效率極高。但是由於培養液處於攪拌狀 態，因此那塔無法形成薄膜，而是在培養液中形成棉絮狀產物。
(五) 那塔之應用與機能性
那塔具有堅韌的質地，工業上也利用此一特性將那塔製成多項產 品。食用之那塔通常以切丁裝罐做成罐頭產品，製作流程如圖十三 (許，1996)。由於那塔由纖維素與水組成，而纖維素不為人體所消化 吸收，因此可視為膳食纖維，且食用後具有飽足感，可用為製作低熱 量的減重食品；同時纖維可以增加腸胃道的蠕動，可促進排便並防止 便秘，減少大腸癌的發生；而且攝取膳食纖維，也可預防腸胃道及內 分泌方面的疾病，圖十四為膳食纖維的防癌機制及攝取不足之毛病
Coconut water/milk
¾
Cut nata layer into dices
¾
Soak and wash to remove excess acid (over-night)
¾
Blanch at boiling water for 10min
¾
Pack in bottles, cans, or plastic bags with water, sucrose solution, or
acetic acid solution
¾
Commercial sterilization at boiling water for 10min
¾ Cooling
¾
Canned nata de coco dices
圖十三、那塔罐頭製造流程
Figure 13. A flow diagram for canned nata de coco product dices.
(Sheu, 1996)
圖十四、膳食纖維的防癌機制及攝取不足之毛病
Fig. 14. Mechanism of prevent cancer and condition of dietary dearth of dietary fiber.
(1) 果凍：這是國內最常見的產品型態。調過糖液的那塔加入果汁中，
再添加膠類物質予以凝膠成果凍產品。
(2) 罐頭：將那塔切丁，加入白木耳、蒟蒻及鳳梨等原料，調製成什 錦罐頭產品
(3) 軟糖：加入不同果汁調配所製成的產品，由於那塔本身的彈性及 咀嚼感，在風味及口感上類似水果軟糖。
(4) 飲料：將那塔打碎並加入果膠等增稠劑，作為高纖飲料產品，此 產品常見於日本地區。
2. 食品添加物方面之應用
Okiyama 等人 (1993)將那塔破碎均質後，添加於冰淇淋、美乃滋 等需要乳化的產品中。發現其具有平滑的質地、高度的保水性 (water -holding capacity)及低黏度 (viscosity)等特性，可作為食品添加物使 用。且那塔經過毒性試驗後證實對人體無不良影響，是公認的無毒性 添加劑 (Kent et al., 1991)戶田等 (1994)的報告則指出，市面上已有 將那塔添加到飲料、糊狀食品、煉製品與膠狀食品中的產品，應用之 食品種類與功能如表八。
3. 其他工業之應用
那塔的應用性極高，除了食用之外，可加工製成多項加工產品，
包括醫療材料、造紙、玻璃纖維濾片、音箱震動膜及紡織品等，圖十 五為那塔在工業上之應用 (深谷與川村，1994)。
表八、那塔在食品工業上之應用
Table 8. Application of nata in food industry.
功 能
圖十五、那塔在工業上之應用
Fig. 15. Application of nata in industry.
(深谷與川村，1994)