蘋果調理醋加工過程中生成那塔對醋液化學組成之影響

國立臺灣大學生物資源暨農學院園藝學研究所 碩士論文

Graduate Institute of Horticulture College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

蘋果調理醋加工過程中生成那塔 對醋液化學組成之影響

Effect of Nata Formation on Chemical Constituents of Apple Infused Vinegar During Maceration

紀亘倫 Hsuan-Lun Chi

指導教授：許明仁 博士

Advisor: Ming-Jen Sheu, Ph.D.

摘要

醋是一種酸性的天然加工食品，食用消化吸收後可改變人體成為 弱鹼性體質，由生理的角度來看可視為一種鹼性食品。本研究之目的 在探討新鮮蘋果及濃縮果汁還原後之蘋果汁加工製成蘋果浸漬醋中 之成分差異，並與生成那塔 (nata)之新鮮蘋果浸漬醋中醋液之成分與 香氣做比較，此外，本研究亦進一步分析蘋果浸漬醋加工過程中生成 那塔的菌種及醋液中菌相，並探討蔗糖濃度對還原蘋果汁浸漬醋中抑 制菌種生長的影響。

實驗結果顯示蘋果浸漬醋與生成那塔之蘋果浸漬醋經過 30 天的 浸泡，生成那塔的蘋果浸漬醋所含可溶性固形物平均下降 0.5^oBrix；

氨態氮含量降低 0.2 % (g/g)；甲醛態氮增加 0.7 mg/100g；醋酸含量下 降約 2700 mg/kg、蘋果酸與葡萄糖酸則增加約 320 mg/kg與 2910 mg/kg；揮發性香氣成分中醋酸所佔相對百分比下降 20.5%；而揮發 性的氨類化合物所佔相對百分比則上升 7%。還原蘋果汁浸漬醋所含 成分與蘋果切片浸漬醋比較，差異在於氨態氮多與甲醛態氮分別高出 0.16 % (g/g)與 0.19 mg/100g；醋酸含量多 867 mg/kg，蘋果酸與葡萄 糖酸含量較蘋果切片浸漬醋分別少 435 mg/kg與 1180 mg /kg，主要的 揮發性香氣成分則十分相似。還原蘋果汁浸漬醋添加蔗糖至可溶性固 形物含量達到 30^oBrix以上，即可抑制木質醋酸菌代謝營養源生成那 塔。商用糯米醋中並未發現活菌存在，新鮮蘋果經過表面清洗後之浸 醋與濃縮還原蘋果汁浸漬醋依然有那塔生成的情況可能來自加工過 程的污染。蘋果浸漬醋中生成那塔之細菌經証實為葡萄糖醋桿菌

Abstract

Vinegar is a natural acidic food, however, it is generally considered as a physiological alkaline food because it will metabolize into a nalka -line environment in the human body after digestion. The objectives of this study are to investigate the characteristic differences of apple vinegar made from fresh apple slice maceration (ASV)and reconstituted apple juice blending (RAJV); to compare the chemical composition and flavor volatiles of the nata-forming apple slice vinegars (NASV) and ASV; to identify the microflora in NASV and ASV; and to investigate the effect of sucrose concentration on the inhibition of nata-forming bacteria in RAJV.

The results of this study showed that the total soluble solids, ammo -nia nitrogen, and acetic acid contents in NASV decreased 0.5^oBrix, 0.2

% (g/g), and 2700 mg/kg, respectively, as compared to ASV after 30 days of maceration, however, the formaldehyde nitrogen, malic acid, and gluconic acid content increase 0.7 mg/100g, 320 mg/kg, and 2910 mg/kg, respectively. In the results of flavor analyses showed that, acetic acid decrease 20.5 %, and ammonia compound increase 7 % in NASV, as compared to ASV.

Compare the chemical compositions of RAJV and ASV indicate that, ammonia nitrogen, formaldehyde nitrogen, and acetic acid contents increased 0.16 % (g/g), 0.19 mg/100g, and 867 mg/kg, respectively in

bacteria is found in commercial rice vinegar and washed apples, which indicated the nata-forming bacteria found in NASV and nata-forming reconstituted apple juice blending vinegars (NRAJV) may come from contamination. The nata-forming bacteria in NASV was identified as

Gluconacetobacter xylinus.

目錄

中文摘要 ...I 英文摘要 ...II 目錄 ...IV 圖目錄 ...VI 表目錄 ...VIII

壹、前言 ...1

貳、文獻整理...2

一、食用醋簡介 ...2

二、那塔簡介 ...9

参、材料方法...37

一、試驗材料 ...37

二、儀器設備 ...38

三、實驗方法 ...39

四、試驗設計 ...42

五、實驗流程 ...43

六、分析項目 ...44

四、不同原料與不同處理方法浸漬醋之成分比較與統計分析 ...77 伍、結論...86 陸、參考文獻...87

圖目錄

圖一、米醋之製造流程 ...6

圖二、那塔之電子顯微鏡圖...11

圖三、細菌纖維素與植物纖維素之保水量比較 ...12

圖四、菲律賓之那塔傳統製法流程 ...13

圖五、兩階段發酵法之菌液製備流程 ...15

圖六、生產那塔二階段發酵法之第一階段流程 ...16

圖七、生產那塔二階段發酵法之第二階段流程 ...17

圖八、纖維素的生合成途徑...19

圖九、醋酸菌合成纖維素之概念圖 ...20

圖十、Acetobacter aceti subsp. xylinum 合成纖維素之可能代謝途 徑 ...21

圖十一、原纖維分叉之形成機制 ...23

圖十二、不同 pH 值下之那塔生產速率...26

圖十三、那塔罐頭製造流程...32

圖十四、膳食纖維的防癌機制及攝取不足之毛病 ...33

圖十五、那塔在工業上之應用...36

圖二十、樣品酸鹼值在常溫下浸漬 60 天之變化 ...55

圖二十一、樣品在常溫下浸漬 30 天之酸鹼值 ...56

圖二十二、樣品在常溫下浸漬 30 天之甲醛態氮之含量...57

圖二十三、樣品在常溫下浸漬 30 天之氨態氮含量 ...59

圖二十四、商用糯米醋之 HPLC 圖譜 ...60

圖二十五、浸漬 30 天後 ASV 與 NASV 之 HPLC 圖譜...62

圖二十六、浸漬 30 天後 APV 與 NAPV 之 HPLC 圖譜...63

圖二十七、浸漬 30 天後 RAJV 與 NRAJV 之 HPLC 圖譜...64

圖二十八、不同浸漬醋所含揮發性氨類化合物所佔香氣相對百分 比...73

圖二十九、葡萄糖醋桿菌屬之親緣性樹狀圖 ...77

圖三十、ASV 與 ASVCl 之成分比較...81

表目錄

表一、食用醋之分類 ...3

表二、食用醋之成分要求 ...4

表三、不同原料發酵之食用醋有機酸含量...7

表四、細菌纖維素之生產菌株...24

表五、添加單一碳源或混合碳源所得之纖維素產量 ...27

表六、添加不同碳源所得之纖維素產量...28

表七、添加不同氮源所得之纖維素產量...30

表八、那塔在食品工業上之應用 ...35

表九、浸漬 30 天後浸漬醋之不同有機酸含量 ...65

表十、ASV 與 NASV 相同之香氣成分...66

表十一、ASV 與 RAJV 相同之香氣成分...67

表十二、ASV 與其他浸漬醋相異之香氣成分 ...68

表十三、RAJV 與其他浸漬醋相異之香氣成分 ...69

表十四、NASV 與其他浸漬醋相異之香氣成分 ...70

表十五、浸漬醋之主要香氣成分相對百分比 ...72 表十六、不同可溶性固形物濃度之還原蘋果汁浸漬醋添加醋酸菌

...80

表二十、浸漬醋與生成那塔浸漬醋所含成分之比較 ...82

表二十一、ASV 與 ASVCl 所含成分之比較 ...83

表二十二、ASV, APV 與 RAJV 所含成分之比較...85

壹、前言

隨著生活水準的提高，消費者對於食品不僅要求美味，對於安 全、衛生、營養等方面的要求也日漸提高，因此具有保健性及機能性 的食品，在未來市場更具有潛力。

目前台灣的食品產業中，以冷凍食品及飲料在產業中有較為突出 的好表現，調理食品、機能性飲料與保健食品則最具有潛力，其中新 型機能性飲料能增進身體健康，保持體態和補充能量，例如天然果 汁、高維他命飲料、茶類等，因此消費者對此類飲料的需求不斷的上 升 (王，2000)。

醋含有揮發性物質，能促進食慾，其所含醋酸另有殺菌之作用，

可達到防腐的功效，並有美容、健身、醫藥之效果 (王，2000)。因此，

醋的飲用對人體健康上的功效逐漸被世人所重視。此外，在眾多種類 的醋之中，釀造醋的風味及品質較好，並具有預防感冒、降低膽固醇，

平衡人體血液酸鹼度、消除疲勞、增加食慾與幫助消化等醫療保健的 功能，所以醋也算是一種保健食品 (吳，1999)。

本研究源起於加工製作蘋果浸漬醋時發現部分樣品在醋液表面 生成了細菌纖維素 (那塔)，由於國人近來對於水果醋的飲用逐漸普 及，加上那塔本身所具有的機能性，因此除了研究蘋果浸漬醋生成那 塔之後的成分變化與菌種來源，並試驗以還原蘋果汁調配蘋果醋的可

貳、文獻整理

一、食用醋簡介

食用醋 (Edible vinegar)最早始於將含有酒精物質放置在空氣中 而發現的。在西元前1450 年，《舊約聖經》中即有酒醋 (wine vinegar) 之記載，而明朝李時珍《本草綱目》中記載，「醋有數種，惟米醋二、

三年者入藥，製米醋法，三伏時，用倉米一斗淘淨，蒸飯攤冷，俞黃，

簽淋淨，別以倉米兩斗蒸飯和勻入甕，以水淹過，密封三七日成 矣！」。食用醋是一種以醋酸菌 (acetic acid bacteria)為發酵主體之酸 性調味料，除了醋酸外尚有各種揮發性與不揮發性的有機酸、醣類、

胺基酸類、酯類等，共同構成食醋之風味 (李，1995)。

(一) 食用醋之釀造

食用醋可以由固體或液體原料發酵而得，更有以工業製造的冰醋 酸經過稀釋混合調味料配製而成。食用醋在中國國家標準 (CNS, 2004)分為釀造食醋與合成食醋二類，詳細分類定義及成分要求如表 一及表二所示 (CNS, 2004)。

李 (1995)指出，釀造食用醋的原料可分為糖質原料及澱粉質原 料，以糖質原料釀造食用醋時，可直接添加酵母菌進行酒精發酵，發 酵完成後再添加醋酸菌進行醋酸發酵；以澱粉質原料釀造食用醋時，

則需另外添加糖化菌或糖化酵素，先將澱粉質原料轉化為酵母菌發酵 時可利用的糖。

食用醋的釀造方法分為三個階段，第一階段是由糖化菌將澱粉轉 化為糖；第二階段是添加酵母菌利用糖化後之產物進行酒精發酵產生 酒精；第三階段是添加醋酸菌到酒精發酵後所產酒精發酵液進行醋酸

表一、食用醋之分類

Table 1. The classification of edible vinegar.

(CNS, 2004)

分類 定義

1.釀造食醋 以穀物類、果實、酒精、酒粕及糖蜜等為原

料之酒醪或此類酒醪添加食用酒精後或以食 用酒精經醋酸發酵而成之調液，但不可添加 醋酸、冰醋酸或其他酸味劑。

(1) 穀物醋 以一種或二種以上之穀類為原料釀造而成，

惟其成品每公升之製造原料須使用穀物 40g (以乾重計)以上。

(2) 果實醋 以一種或二種以上之果實為原料釀造而成，

惟成品每公升之製造原料須使用水果原汁 300g 以上。

(3) 其他釀造醋 除上述穀物醋、果實醋之外，以其他原料釀 造而成。

(4) 高酸度醋(含 酒精醋)

釀造食醋中，酸度高於9%以上 (以醋酸計，

w/v)之產品。

(5) 調理食醋 以釀造食醋為主原料，添加各種配料 (如糖、

鹽、食用油脂、蔬菜、果實及果汁等)而成之 製品，但不得添加合成食醋或其他酸味劑。

2.合成食醋 以冰醋酸或醋酸之稀釋液，添加糖類、酸味

劑、調味劑 (如胺基酸)及食鹽等製成之調味 液或以此調味液中添加釀造食醋混合而成 者。

表二、食用醋之成分標準

Table 2. Edible vinegar standards.

分類 酸度 (%,

以醋酸計)

無鹽可溶固 形物 (%)

不揮發酸 (%)

全氮量 (%)

穀物醋 4.2 以上 1.3 以上 － －

1. 釀造食醋

果實醋 4.5 以上 1.2 以上 － －

其他釀造食醋 4.0 以上 1.2 以上 － － 高酸度醋 9.0 以上 1.5 以上 － － 調理食醋 1.0 以上 6.0 以上 1.0 以下 0.2 以下 2. 合成食醋 4.0 以上 1.2 以上 1.0 以下 0.2 以下 (CNS, 2004)

發酵產生醋酸。醋酸菌是好氧性細菌，需有充足的氧氣促進菌體生長 代謝，利用酒精進行發酵產生醋酸。以下就國內最常見的糯米醋為 例，介紹食用醋之釀造。

釀造時先將精白米蒸煮，接著添加米麴 (Aspergillus oryzae)與水 在高溫環境進行糖化，在高溫下除了可以加速糖化作用的效率，也可 以避免雜菌的汙染。糖化完成後添加酵母菌 (Saccharomyces sake)進 行酒精發酵，當酒精發酵完成之後以酒精發酵液作為醋酸發酵之原 料。先將酒精發酵液稀釋至5%後再加入醋酸菌 (Acetobacter aceti)在 30^oC 下進行一至二個月的醋酸發酵，釀造流程如圖一 (吳，1999)。

糯米醋釀造完成後須經過一至三個月的熟成，目的在使其香味平 衡調和，同時使尚未分解之蛋白質、殘存菌體、果膠質等沉澱。最後 輔以矽藻土過濾，經 60~66^oC，30 min 殺菌後裝瓶，即可得到成品 (李，1995)。

(二) 食用醋之組成分

食用醋之組成中包含糖、有機酸、胺基酸、無機鹽、香氣成分與 多酚類 (polyphenol)等物質，每一種物質的含量會隨著發酵原料的不 同而有差異 (Natera et al.,2003)。而多酚類之存在則是因為水果原料 的關係，例如蘋果醋提供了蘋果多酚。

1. 食用醋之有機酸成分

Natera 等人 (2003)的研究指出，不同原料來源發酵的食用醋，其

圖一、米醋之製造流程

Fig. 1. A flow diagram for rice vinegar.

(吳，1999) 麴菌

精白米 蒸煮 水

糖化 (55-60^oC,

4-5hr)

酒精發酵 (25^oC, 4 days)

清酒酵母 (Saccharomyces sake) k k )

壓榨 澄清汁液 稀釋

5%酒精液

醋酸發酵 (30^oC, 1-2 month) 種醋 (Acetobacter aceti)

熟成 (30^oC, 2-3 month)

過濾 殺菌 (60^oC) 米醋

表三、不同原料發酵之食用醋有機酸含量

Table 3. Organic acid content of edible vinegar which was fermented by different materials.

Compd 白酒 (熟成) 白酒 (未熟成) 葡萄酒 (熟成) 紅酒 (熟成)

Succinic acid 0.263 0.200 0.356 0.398 Malic acid 0.107 0.066 0.722 0.337 Tartaric acid 1.02 0.537 1.37 2.20 Acetic acid 84.9 79.6 51.1 82.6 Lactic acid 0.623 0.488 0.832 0.476 Citric acid 0.124 0.275 0.657 0.402

Compd 紅酒 (未熟成) 蜂蜜 酒精 蘋果

Succinic acid 0.393 0.273 nd 0.135

Malic acid nd 0.515 nd 0.086

Tartaric acid 0.098 0.212 nd nd

Acetic acid 86.8 67.6 66,6 56.7 Lactic acid 1.03 1.11 nd 2.02

Citric acid nd nd nd 0.157

nd: not determined. 單位:g/L

(Natera et al., 2003)

2. 食用醋之胺基酸及無機鹽成分

小泉等人 (1987)指出其分析市面上販售之米醋中，胺基酸組成有 Lys、His、Arg、Thr、Ser、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、

Tyr、Phe 等，而其中之總胺基酸量依照醋的製造廠商不同而有所差 異。而無機鹽類組成方面，小泉等人 (1987)亦指出醋中之無機鹽類包 括有Na、Ca、K、Mg、Cu、Fe 等常見礦物質。

3. 食用醋之香氣成分

由 Natera 等人 (2003)的研究發現，以不同原料發酵而得之釀造 醋，較為共通的香氣成分為酯類、醇類、酮類及揮發性有機酸等。實 際上食用醋的香氣成分複雜性更高，除了不同原料的差異性之外，同 一種原料所發酵的醋也可能因為原料產地不同，受天候、土壤及溫度 等原因而有所差異。

(三) 食用醋之機能性

米醋在我們的生活中不但可當為調味品，更可去除水產品的腥味 以及增加食品的風味。前人研究 (田尻等，1989； Kishi et., al 1999；

Xu et., al 2007； Shimoji, 2002； Sakanaka et., al 2008)發現食用醋尚 具備了降血糖、幫助鈣質吸收以及抗氧化等機能性。

1. 降低血糖

田尻等人 (1989)從米醋渣裡萃取出有機酸進行含量分析，結果發 現米醋渣中所含的有機酸，醋酸所佔的比例為79.8%，乳酸為 17.7%。

以添加有機酸之飼料，餵食因原發性高血壓及藥物傷害而患有糖尿病 的大鼠及小鼠後，發現可降低其血糖值，並維持在正常的範圍內。實 驗中並發現，餵以含有4mg/kg 有機酸之飼料與餵以 200mg/kg 的降血

糖藥物氨磺 (tolbutamide)的兩個實驗組，皆具有相同的降血糖效果。

2. 幫助鈣質吸收

Kishi 等學者 (1999)發現在飼料內添加醋酸餵食的雞，其所產的 雞蛋鈣質含量，比對照組的雞所產的雞蛋高。而改以大鼠做實驗也發 現，飼料中添加醋酸的實驗組，可提高大鼠對鈣質的吸收。這是由於 鈣質與醋酸形成更有利於小腸吸收的醋酸鈣。

3. 抗氧化

Xu 等人 (2007)與 Shimoji (2002)等學者發現，米醋在製造過程 中所產生的梅納反應產物 (melanoidin)有良好之清除 DPPH (1,1-disp -henyl-2-picryl-hydrazyl)能力。 Sakanaka 等 (2008)進一步實驗將柿子 醋添加到金槍魚肉產品內，可以有效抑止油脂氧化的發生。

二、那塔簡介

那塔，英名為「nata」，源自於拉丁文字的 nature。 Nata 是將木 質醋酸菌培養於含有有機酸與糖的椰水或果汁中，經發酵培養在培養 液表面形成不溶於水、堅韌的纖維狀產物。國內亦有研究以震盪發酵 培養生成球形纖維素之研究 (蔡，1997)。那塔水分含量隨發酵基質 不同而有差異，但都在 90%以上 (Alaban, 1962)。 Nata 依據發酵基 質的不同而有不同的名稱，若以椰乳或椰水為主要基質則稱為「nata

生一種黏滑的物質，此即為 nata de piña 之始，一般推測那塔產業源 自於家庭式的製造。

(一) 那塔之組成分

Guzman 等人 (1982)指出，那塔的水分含量隨發酵基質不同而有 差異，但至少都佔 90%以上。戴 (1997)的研究則指出，那塔的化學 成分主要是水分與粗纖維，其中水分高達 98.9%，粗纖維含量為 1.13%，此外另含微量之灰分。那塔的結構是由高密度之纖維交錯構 成的不規則網目狀組織，其纖維直徑在 20-100nm 之間，為目前所有 天然纖維中最細者，纖維層中的孔徑大小約為直徑 500-1000nm (Okiyama et al., 1992b；深谷與川村，1994)，圖二為那塔之電子顯微 鏡圖 (Whitney et al., 2006)。

那塔是由微纖維 (microfibrils)所構成，而植物纖維則是由原纖維 (fibrils)或微纖維束 (bundles of microfibrils)所構成；前者的微細結構 使其表面積比同體積原纖維高出許多，可吸附之水比本身重量一百倍 以上的水，具有極高之親水性 (hydrophilicity) ，圖三為細菌纖維素 與植物纖維素保水能力之比較 (戶田等，1994)。

構成那塔的細菌纖維素 (bacterial cellulose)與植物纖維素另一重 要差別為，細菌纖維素由純粹的纖維素所構成，而植物纖維素則參雜 如半纖維素及木質素等多醣類，因此那塔的加工過程較為容易，可以 避免因分離純化時之副產物所導致的環境污染 (深谷與川村, 1994；

Embuscado, 1994a)。

(二) 那塔之生產方法 1. 傳統製法

那塔的傳統製法如圖四 (Mendoza, 1961)所示。椰水或椰乳經過

圖二、那塔之電子顯微鏡圖

0 10 20 30 40 50 60

DBC1 DBC2 PC

Water-holding capcity (mL/g cellulose)

圖三、細菌纖維素與植物纖維素之保水量比較

DBC:dried bacterial cellulose PC:plant cellulose

Fig. 3. Water-holding capacity of bacterial cellulose and plant cellulose.

(戶田等，1994)

Coconut water/milk

¾

Strain through clean white cloth

¾

Add glacial acetic acid (20mL/L) and sucrose (150g/L)

¾

Mix and inoculate with nata (1-10%, v/v)

¾

Place substrate in 7.5cm layers in gallon pickle jars

¾

Inoculate 10-14 days at 28-31^oC

¾

Harvest nata layer on surface

¾

Soak and wash to remove excess acid

¾

Boil with sucrose (sucrose:nata=1:2, w/w)

¾

Nata de Coco 圖四、菲律賓之那塔傳統製法流程

Fig. 4. Traditioal method for nata de coco production in Philippine.

(Mendoza, 1961)

調糖及調酸之後，接種菌酛並倒入一加侖的醃漬廣口瓶內，使發酵液 達 7.5 公分高，在 28-31^oC 靜置培養兩週之後，在表面形成 2-3 公分 厚的那塔纖維層即可取出。剩餘的培養液可作為下次生產時的菌酛。

在發酵生產那塔時，液面的任何動搖都可能導致那塔下沉，會造成液 面另一層那塔的合成而無法累積厚度 (吳等，1994)。

除了椰水和椰乳可作為生產那塔的原料外，另一主要原料為鳳梨 或 鳳 梨 加 工 廢 棄 物 ， 除 了 原 料 處 理 相 異 外 ， 其 餘 流 程 完 全 相 同 (Mendoza, 1961)。而近來國內研究也有利用柑橘果汁、甘蔗果汁、蓮 霧果汁及柑橘果渣所生產的二次果汁等為原料，為生產過剩、格外品 及田間落果的園藝作物及加工廢棄物開發新用途 (何，1996；劉，

1998；楊，1998)。國外亦有利用番茄為原料生產那塔的研究 (Lacadin

et al., 1980)。

2. 兩階段製法

兩階段製法亦稱做「兩階段發酵法」。許 (1996)的研究指出，兩 階段製法之菌液需要事先震盪培養，流程如圖五；培養後之菌液以 2:5 之體積比接種至已殺菌的培養液，流程如圖六；經過通氣震盪培 養後之發酵液與培養液再以 1:10 之體積比，與已殺菌之培養液混合 均勻，然後分裝至平盤靜置培養，流程如圖七。 Okiyama 等人 (1992a) 研究發現，經過震盪培養後所得培養液，菌體數量是傳統製法的一百 倍；與傳統方法比較生產速率的結果發現，達到相同之那塔總產量 時，二階段製法可以縮短一半以上的發酵時間。

(三) 那塔生成之機制 1. 纖維合成機制

Coconut water/milk

¾

Add sugar to 10^oBrix

¾

Add glacial acetic acid to pH4.0

¾

Add 0.5% NH4H2PO4

¾

Coconut water medium

¾

Sterilize the medium

¾ Cool

¾

Add medium to selected

Acetobacter xylinum agar slants

¾

Preculture agar slants at 30^oC for 4 days

¾

Mix agar slant precultures with sterilized

¾

Culture flasks at 30^oC for 2 days with 200 rpm constant shaking

¾

Acetobacter xylinum

圖五、兩階段發酵法之菌液製備流程

Fig. 5. Preparation of Acetobacter xylinum stock culture for a two-stage fermentation process.

(Sheu, 1996)

Coconut water/milk

¾

Add sugar to 10^oBrix

¾

Add glacial acetic acid to pH4.0

¾

Add 0.5% NH4H2PO4

¾

Coconut water medium

¾

Sterilize the medium

¾ Cool

¾

Inoculate Acetobacter xylinum stock culture to the medium (2:5 v/v)

¾

Preculture in an air-lift fermenter (0.25 v/v/min aeration at 30^oC for 2 days)

¾

圖六、生產那塔二階段發酵法之第一階段流程

Fig. 6. The first stage of a two-stage fermentation process developed for industrial production of nata de coco.

(Sheu, 1996) Preculture broth

Coconut water/milk

¾

Add sugar to 10^oBrix

¾

Add glacial acetic acid to pH4.0

¾

Add 0.5% NH4H2PO4

¾

Coconut water medium

¾

Sterilize the medium

¾ Cool

¾

Mix the medium with preculture broth (10:1 v/v) aseptically

¾

Distribute to plastic trays, cover with sterilized newspaper

¾

Let stand undisturbed at 30^oC for 7 days

¾

Harvest nata layer on the surface

¾

圖七、生產那塔二階段發酵法之第二階段流程

Fig. 7. The second stage of a two-stage fermentation process developed for industrial production of nata de coco.

(Sheu, 1996) Nata de coco

Ross 等人 (1991)提出醋酸菌合成纖維素之可能代謝途徑分為四 個步驟；

(1) 葡萄糖經葡萄糖激酶 (glucokinase)作用進行磷酸化反應，生成葡 萄糖-6-磷酸鹽 (glucose-6-phosphate)。

(2) 生成葡萄糖-6-磷酸鹽經磷酸葡萄糖變位酶 (phosphoglucomutase) 作用進行異構化反應，生成葡萄糖-1-磷酸鹽 (glucose-1-phosphate)。

(3) 葡萄糖-1-磷酸鹽經尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDPG-pyroph -osphorylase)作用生成尿苷二磷酸葡萄糖 (UDP-glucose)。

(4) 尿苷二磷酸葡萄糖經纖維素合成酶 (cellulose synthase)作用將葡 萄糖接至纖維素多醣鏈上。

圖八 (深谷和川村，1994)為纖維素的生合成途徑，圖九 (深谷和 川村，1994)則顯示纖維素合成酶將尿苷二磷酸葡萄糖去掉尿苷二磷 酸的反應。此外，醋酸菌對於營養源的利用如乙醇、醋酸與丙酮酸等，

則可能經由檸檬酸循環 (citric acid cycle)代謝，圖十 (Banzon et al., 1990)為木質醋酸菌生成纖維素之可能代謝途徑。

2. 那塔結構三階段

Okiyama 等人 (1992a)指出，那塔是醋酸菌利用糖及有機酸發 酵，將葡萄糖以 β-1,4 糖苷鍵結聚合而成的纖維素。醋酸菌生長代謝 生成那塔可分為三個階段：

第一階段：Polymerization：此階段是將葡萄糖聚合成 β-1,4-聚葡 萄糖 (glucan)。

第二階段：Crystallization：此階段β-1,4-聚葡萄糖會形成微纖維 構造之纖維素。

第三階段：Structuralization：此階段微纖維糾結纏繞形成纖維層。

Glucose Gluconic acid

細胞質膜

Glucose Gluconic acid

Glucokinase

G-6-P

Phosphoglucomutase 6-phosphogluconic acid G-1-P

UDPG pyrophosphorylase

UDP-glucose

Cellulose synthetase

Cellulose

圖八、纖維素的生合成途徑

Fig. 8. Pathway of cellulose synthesis by Acetobacter.

(深谷和川村，1994)

PDE B PDE

A

activated cellulose synthetase diguanylate

cyclase unactivated

cellulose synthetase

pGpG pGpG

c-di-GMP

pGpG pppGpG

UDP UDP

Mg²⁺

Mg²⁺

Mg²⁺

2 GTP 2Pi PPi

2Pi PPi

active site

2 5' -GMP Ca²⁺

UDP-glucose cellulose

membrane

圖九、醋酸菌合成纖維素之概念圖

PDE：phosphodiesterase

Fig. 9. Model of cellulose formation by Acetobacter.

(深谷和川村，1994)

Mannitol Fructose ~P

Hexose-P

Glycerol F-1,6-P

DHA ~P Triose-P

PGA 3 phosphoglycerate

Pyruvate

Acetate TCA Cycle

Cellulose Pentose-P

Ethanol

Modified G-P + UDP UDPG + P UDPG + Cellodextrin

Cellulose + UDP

(by transglucosidase) 6-P-G

~P Glucose

Reactions which have been experimentally demonstrated Reactions which are presumed to take place

~P Gluconate

圖十、Acetobacter aceti subsp. xylinum 合成纖維素之可能代謝途徑 Fig. 10. Presumable pathways of cellulose synthesis by Acetobacter aceti subsp. xylinum.

(Banzon et al., 1990)

Yamanaka 等人 (1989)以掃描式電子顯微鏡觀察醋酸菌時發現，

醋酸菌形成之纖維是三向分叉狀 (three-way branching )。此結果被認 為是菌體分裂時，菌體母細胞將微纖維分配至子細胞，子細胞又持續 合成纖維所致，圖十一為分叉之形成機制 (Yamanaka et al., 1989)。而 此分叉又會在下一次分裂的時候產生，最終形成了網狀構造。

(四) 影響那塔生產之因子 1. 那塔生產菌株

生產那塔的菌株種類很多， Jesus 等人 (1971)從各種水果表面分 離出菌種，再以相同條件培養觀察其那塔的生長狀況。結果顯示不同 的來源的菌，產量也有明顯的差異。生產那塔的時候，通常會選擇生 產效率較好的菌，可有效縮短生產的時間，施予不同加工條件時，差 異也比較顯著 (Jesus et al., 1971)。

Cannon 等人 (1991)的研究指出，目前有多種菌屬如 Acetobacter,

Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, Sarcina 等都有可以生成纖維

2. 溫度

Lapuz 等人 (1967)以木質醋酸菌生產那塔的研究發現，菌株生產 那塔的溫度範圍是15-35^oC，而有最大產量的溫度則是在室溫 28-31^oC 之間，此溫度即為那塔發源地菲律賓日常之氣候溫度。且在那塔生成 的實驗組當中，也發現在28-31^oC 之下醋酸菌生成的速率最快，在 72 小時就可以觀察到那塔的生成，其他兩組有生成那塔的實驗組則是要 等到七天之後。

圖十一、原纖維分叉之形成機制

Fig. 11. The formation mechanism of branches in fibrils.

(Yamanaka et al., 1989) cell

cell cell Division Branch

Fibri

表四、細菌纖維素之生產菌株

Table 4. Survey of bacterial cellulose producer.

Organism(genera) Cellulose produced Cellulose assay Biological role

Acetobacter

Cellulose ribbons X-ray diffraction environment Alkali insolubility To colonize natural

Fluorescent substrates

brightener

Degradation by

cellulase

Agrobacterium

fibrils Alkali insolubility tissue

Fluorescent

brightener

Degradation by

cellulase

Rhizobium

fibrils Alkali insolubility tissue

Fluorescent

brightener

Degradation by

cellulase

Pseudomonas

Degradation by wastewater

cellulase

Sarcina

(Cannon et al., 1991)

3. pH 值

Masaoka 等人(1993)將木質醋酸菌放在不同 pH 值的培養基培 養，觀察那塔生成的情況之實驗發現，不同起始 pH 值所得到的合成 速率也有差異。在最適合的 pH 值範圍有較高的合成速率。實驗並沒 有提到最終產量，但是從速率上來看， pH 值影響的結果已經非常的 明顯。生產那塔若可維持在適當的 pH 值範圍，不但可在單位時間內 得到最大的產值，也縮短了加工時間。 Embuscado 等人 (1994a)提出，

pH 值在 4.5-5.0 的範圍內細菌纖維素產量最高。Masaoka 等人 (1993) 研究不同 pH 值下之那塔生產速率如圖十二。

4. 碳源

Embuscado 等人 (1994a)研究發現以木質醋酸菌為發酵菌種，在 7%的添加糖濃度之下，單一種糖當作碳源時，果糖與蔗糖的產量明 顯較高，其中又以果糖為最佳的碳源。 Ebuscado 等人 (1994a)指出 果糖是醋酸菌合成那塔的最佳受質，而蔗糖則因為是雙糖，所以使用 蔗糖當為碳源時的速率會比較慢，因而造成兩者之間產量的微些差 異。此外木質醋酸菌也因其會利用成本較低的蔗糖且產量差異不大，

因此被選為加工用菌種。 Embuscado 等人 (1994a)將兩種以上的糖混 合添加時，也是含有果糖或蔗糖的混合碳源，會有較好的產量，但有 葡萄糖的碳源，產量明顯降低，結果如表五。 Son 等人 (2001)的研 究指出，添加不同種類的糖與有機酸作為碳源時，在2%的添加濃度

圖十二、不同 pH 值下之那塔生產速率

Fig. 12. Nata formation rate of different pH value.

(Masaoka et al., 1993)

表五、添加單一碳源或混合碳源所得之纖維素產量 Table 5. Cellulose yield of add single or mix carbon source.

Sugar Cellulose (g/l) Final pH Fructose 7.38 ± 0.38 4.40 Glucose 1.00 ± 0.05 3.01 Sucrose 5.25 ± 0.28 4.77 Lactose 1.62 ± 0.07 5.00 Fructose + glucose 1.00 ± 0.03 3.09 Fructose + sucrose 6.38 ± 0.32 4.42 Fructose + lactose 5.44 ± 0.32 4.50 Glucose + sucrose 1.50 ± 0.04 3.04 Glucose + lactose 0.75 ± 0.03 3.08 Sucrose + lactose 2.50 ± 0.06 4.88

(Embuscado et al., 1994a)

表六、添加不同碳源所得之纖維素產量

Table 6. Cellulose yield of add different carbon source.

Cells were cultivated in the standard medium with an carbon-source concentration of 2% (w/v or v/v).

Carbon source Cellulose yield (g/l)

Fructose 2.53

Glucose 2.7

Maltose 0.62

Sucrose 0.83

Trehalose 2.57

Mannitol 0.64

Arabitol 0.85

Acetic acid 0.38

Lactic acid 2.1

Succinic acid 0.3

(Son et al., 2001)

利用葡萄糖時產生的葡萄糖酸 (gluconic acid)會使得 pH 值下降較 快，反而有礙那塔的生成。但 Lapuz (1967)及 Embuscado (1994a)等 人提出蔗糖含量在5-15%時，木質醋酸菌會有較高的那塔產量。

5. 氮源

Embuscado (1994a)等人以有機氮源和無機氮源以單一或混合添 加到培養基中，觀察對生成那塔產量的影響，使用的氮源濃度維持在 0.08%再加上 7%的蔗糖。結果發現以有機氮源 peptone 的培養基生成 那塔有最好的產量，依次是 tryptone, yeast extract 等。以表七的數據 可推論，有機氮源比無機氮源更有利於木質醋酸菌生成那塔。不過 Embuscado (1994a)等人也提到， peptone 不是一個良好的氮源，因為 peptone 會影響木質醋酸菌產生交錯結構較為鬆散的纖維素膜。至於 混合氮源與單一氮原的差異並不顯著。 Son 等人 (2001)的研究則指 出，最好的氮源是 0.5%的玉米浸漬液 (corn steep liquor)，玉米浸漬 液是浸漬去皮玉米的水再經過蒸發後所殘留的液體，浸漬液內含有 2.7-4.5%的粗蛋白、 1.0-1.8%的胺基態氮、 0.1-11%的還原糖、5-15%

的乳酸與 9-10%的灰份 (Liggett, 1948)。 Lapuz (1967)等人的研究 指出，氮源濃度過高或過低於 0.5%時，皆不利於那塔生產菌株的生 長，而添加 0.5% NH₄H₂PO₄ 當為氮源時，那塔的產量最高。

6. 有機酸

表七、添加不同氮源所得之纖維素產量

Table 7. Cellulose yield of add different nitrogen source.

氮源 纖維素產量 (g/l)

A. 無機

(NH4)2SO4 2.38 ± 0.10 (NH⁴)H²PO⁴ 2.44 ± 0.11

KNO³ 0.38 ± 0.09

B. 無機 + 無機

(NH⁴)²SO⁴ + (NH⁴)H²PO⁴ 2.38 ± 0.20 (NH⁴)²SO⁴ + KNO³ 1.12 ± 0.18 (NH⁴)H²PO⁴ + KNO³ 1.75 ± 0.08 C. 有機

蛋白腖 5.12 ± 1.01

胰化蛋白腖 3.88 ± 0.18

酵母抽出物 3.88 ± 0.20

尿素 1.25 ± 0.05

D. 有機 + 有機

蛋白腖 + 酵母抽出物 5.25 ± 0.30 蛋白腖 + 胰化蛋白腖 4.75 ± 0.32

尿素 + 胰化蛋白腖 2.25 ± 0.15

尿素 + 蛋白腖 2.12 ± 0.20

(Embuscado et al., 1994a)

與琥珀酸 (succinic acid)可增加產量，但醋酸與檸檬酸超過 0.4%或是 琥珀酸超過 1.6%時則會降低產量。若培養基僅含有機酸而沒有葡萄 糖存在時，菌體則不會生長。 Alaban (1967)等人的研究則指出，以 椰水進行發酵時，最理想的有機酸及添加量為2-4%的冰醋酸。

7. 氧氣

Guzman (1982)利用沉降式發酵法 (submerged process)培養生成 那塔時，利用幫浦將空氣打入培養液中提高氣體含量後發現，此一方 法大量提高了培養液中菌體的數量，也加速了那塔的合成。此方法那 塔總產值比傳統方法高 49.05%，且於第九天時，產量即達到實驗結 束時總產量的 71.52%，生產效率極高。但是由於培養液處於攪拌狀 態，因此那塔無法形成薄膜，而是在培養液中形成棉絮狀產物。

(五) 那塔之應用與機能性

那塔具有堅韌的質地，工業上也利用此一特性將那塔製成多項產 品。食用之那塔通常以切丁裝罐做成罐頭產品，製作流程如圖十三 (許，1996)。由於那塔由纖維素與水組成，而纖維素不為人體所消化 吸收，因此可視為膳食纖維，且食用後具有飽足感，可用為製作低熱 量的減重食品；同時纖維可以增加腸胃道的蠕動，可促進排便並防止 便秘，減少大腸癌的發生；而且攝取膳食纖維，也可預防腸胃道及內 分泌方面的疾病，圖十四為膳食纖維的防癌機制及攝取不足之毛病

Coconut water/milk

¾

Cut nata layer into dices

¾

Soak and wash to remove excess acid (over-night)

¾

Blanch at boiling water for 10min

¾

Pack in bottles, cans, or plastic bags with water, sucrose solution, or

acetic acid solution

¾

Commercial sterilization at boiling water for 10min

¾ Cooling

¾

Canned nata de coco dices

圖十三、那塔罐頭製造流程

Figure 13. A flow diagram for canned nata de coco product dices.

(Sheu, 1996)

圖十四、膳食纖維的防癌機制及攝取不足之毛病

Fig. 14. Mechanism of prevent cancer and condition of dietary dearth of dietary fiber.

(戶田等, 1994) 1. 水の吸収‧保持作用

2. 有機物の吸着作用 3. 金屬イオンの吸着作用 4. ゲル形成作用

1.消化管の動きを活癹にする。

2.便容積を增加させる。

3.食物の消化管通過時間を短縮させる。

4.腸內壓を低下させる。

5.食事成分の消化吸収および胆汁酸の陽 肝循環に影響する。

6.腸內細菌に影響する。

食物纖維不足

便 秘

虫 垂 炎

憩 室 症

橫 膈 膜 へ ル 二 ア 靜 脈 異 常 大 腸 か ン 腸 ボ リ 一 ブ

肥 滿

糖 尿 病

虛 血 性 心 疾 患

胆 石

管腸內壓上升

腸 壓 上 升

发かン物質の增加

胆汁塩酸 コレスチロ ル TG の代謝 便の停滯

腸管內の 代謝変化

栄養素吸 収の增加

小腸消化と代 謝 の 変 化

(1) 果凍：這是國內最常見的產品型態。調過糖液的那塔加入果汁中，

再添加膠類物質予以凝膠成果凍產品。

(2) 罐頭：將那塔切丁，加入白木耳、蒟蒻及鳳梨等原料，調製成什 錦罐頭產品

(3) 軟糖：加入不同果汁調配所製成的產品，由於那塔本身的彈性及 咀嚼感，在風味及口感上類似水果軟糖。

(4) 飲料：將那塔打碎並加入果膠等增稠劑，作為高纖飲料產品，此 產品常見於日本地區。

2. 食品添加物方面之應用

Okiyama 等人 (1993)將那塔破碎均質後，添加於冰淇淋、美乃滋 等需要乳化的產品中。發現其具有平滑的質地、高度的保水性 (water -holding capacity)及低黏度 (viscosity)等特性，可作為食品添加物使 用。且那塔經過毒性試驗後證實對人體無不良影響，是公認的無毒性 添加劑 (Kent et al., 1991)戶田等 (1994)的報告則指出，市面上已有 將那塔添加到飲料、糊狀食品、煉製品與膠狀食品中的產品，應用之 食品種類與功能如表八。

3. 其他工業之應用

那塔的應用性極高，除了食用之外，可加工製成多項加工產品，

包括醫療材料、造紙、玻璃纖維濾片、音箱震動膜及紡織品等，圖十 五為那塔在工業上之應用 (深谷與川村，1994)。

表八、那塔在食品工業上之應用

Table 8. Application of nata in food industry.

功 能

食品種類

保 水 性

填 充 性

增 彈 力

增 黏 性

結 著 性

保 形 性

分 散 性

防 老 化 冰淇淋

冰果子露

酸酪乳 ● ● ● ●

甜點

果凍 果汁飲料

碳酸飲料 ● ●

飲料

機能性飲料

麵條 ● ● ●

麵

蕎麥麵

烘培食品 麵包 ● ●

蛋黃醬 ● ● ●

調味醬

沙拉醬

魚板 ● ● ●

魚肉煉製品

竹輪

日本點心 羊羹 ● ● ● ● ●

人造奶油

果醬 ● ● ● ●

表面裝飾

發泡奶油

圖十五、那塔在工業上之應用

Fig. 15. Application of nata in industry.

(深谷與川村，1994)

Nata 醫療

食品

工業 化妝品

休閒性食品 機能性食品 食品添加物

◎創傷敷料

◎人工皮膚

◎動物細胞培養基

◎保濕性

◎增稠劑

◎甜點

◎飲料

◎過濾膜

◎音響震動膜

◎高強度材料

◎可分解性材料

◎增加紙張強度

◎減肥食品

◎保健食品

(降低血中膽固醇) (促進腸道蠕動)

◎食品安定劑

◎乳化劑

◎增稠劑

参、材料與方法

一、試驗材料 (一) 發酵菌種

本實驗菌種是在台灣大學園藝學系加工館第三研究室 (以下簡 稱本實驗室)在蘋果切片浸漬醋的加工製作過程中，發現部分樣品有 那塔的生成，為了探討造成蘋果切片浸漬醋生成那塔的原因，因此由 生成那塔的蘋果浸漬醋作為取樣樣本，再經過集殖培養與分離純化後 所得之菌體，為發酵菌酛。

(二) 樣品原料

1. 商用糯米醋：4^oBrix 之糯米醋，可滴定酸含量 3.7%；購自大安工 研食品工廠股份有限公司。

2. 濃縮蘋果汁：70.2^oBrix 之凍藏濃縮蘋果汁，可滴定酸含量 1.3%；

購自佳美食品工業股份有限公司。

3. 新鮮蘋果：浸漬 30 天的蘋果，是 11.4^oBrix 之新鮮蘋果，品種為紐 西蘭 ROYAL GALA 蘋果，可滴定酸含量 0.25%；購自 水源果菜市場。

浸漬60 天的蘋果，是 13.8^oBrix 之新鮮蘋果，品種為青 津、富士與德國，來自台灣大學山地農場。

2. 磷酸二氫銨 (Ammonium dihydrogen phosphoate)：日本林純公司出 品。

3. 氫氧化鈉 (Sodium hydroxide)：日本林純公司出品。

4. 洋菜 (Agar)：美國 Becton Drive 公司出品。

5. 酵母萃取物 (Yeast extract)：美國 Becton Drive 公司出品。

6. 蛋白腖 (Peptone)：美國 Becton Drive 公司出品。

7. 醋酸 (Acetic acid)：日本片山試藥株式會社出品。

8. 蘋果酸 (Malic acid)：Sigma 公司出品。

9. 葡萄糖酸 (Gluconic acid)：Merck 公司出品。

10. 硫酸 (Sulfuric acid)：日本 Nacalai tesque 公司出品。

11. 磷酸 (Phosphoric acid)：日本 Nacalai tesque 公司出品。

12. 甲醛 (Formaldehyde 37% solution)：美國 J. T. Baker 公司出品。

13. 甲醇 (Methanol)：美國 J. T. Baker 公司出品。

14. 次氯酸鈉 (Sodium hypochlorite)：台灣鴻益化工原料公司出品。

(四) 培養容器

1. 血清瓶 (Serum Bottles)：1000mL，德國 Schoot 公司出品。

2. 有桶蓋之透明 PET 桶 (直徑：15.5 cm；高度：22.1 cm)。

二、儀器設備

(一) 酸鹼度計 ( pH meter)：PHEP2 型，美國 HANNA 公司出品。

(二) 糖度曲折計： Abbe-3L 型，美國 Baush & Lomb 公司出品。

(三) 高效率液相層析儀 HPLC：日本 JASCO 公司出品。

(四) 氣相層析儀 (GC)：Model 6890 GC，美國 Angilent 公司出品。

(五) 氣相層析質譜儀 (GC/MS)：Model 5973N 四極桿式質譜儀 (MS

D)，美國 Angilent 公司出品。

(六) 培養箱： Eectric incubator KS31， Kwang Shen 公司出品。

三、實驗方法

(一) 蘋果浸漬醋之製備 1. 蘋果浸漬醋

參考林 (2007)的研究結果，以及本實驗室製作蘋果切片浸漬醋時 所使用之條件，清洗蘋果時分為蘋果十倍重量之自來水浸泡 10 分 鐘，與蘋果十倍重量之 100ppm (mg/kg)次氯酸水浸泡 10 分鐘二組別。

蘋果清洗後分為切片 (以切片機切成厚度 3 mm )與打漿 (以果汁機打 碎至果肉顆粒直徑小於 1 mm)兩組，與商用糯米醋以重量比，3：7 (0.6kg：1.4kg )的比例置於有桶蓋之透明 PET 圓桶 (直徑：15.5 cm；

高度：22.1 cm)內浸泡 30 天。分為兩種清洗方法之目的，為欲鑑定造 成蘋果浸漬醋生成那塔之菌種，是否來自於蘋果表皮；蘋果以切片處 理之目的，為模擬製作時之條件；蘋果以打漿處理則是為了與還原蘋 果汁浸漬醋做比較，觀察同重量的還原果汁與新鮮蘋果經過 30 天的 浸漬之後，成分上的差異。

2. 還原蘋果汁浸漬醋

將濃縮蘋果汁加蒸餾水稀釋至 14 ^oBrix，與商用糯米醋以重量 比，3：7 (0.6kg：1.4kg )的比例置於有桶蓋之透明 PET 桶內浸泡 30

培養那塔生成所添加於蘋果浸漬醋液之菌酛，是將分離純化自生 成那塔的浸漬醋所得之純菌種，預先接種在蘋果浸漬醋與還原蘋果汁 內，在30^oC 下靜置培養 5 天而得，內含菌數為( 1.38 × 10⁶ CFU/ mL)。

菌種培養於浸漬醋內之目的，為縮小菌酛添加至浸漬醋時對浸漬醋成 分造成的影響。

1. 以蘋果浸漬醋生產那塔試驗

將切片與打漿之蘋果浸漬醋，分別加入總體積 10%的菌酛混合後 置於有桶蓋之透明 PET 桶內，並模擬本實驗室自行加工生產浸漬醋 時之條件，置於工廠中在室溫下30 天培養。

2. 以還原蘋果汁浸漬醋生產那塔試驗

將濃縮蘋果汁加浸漬醋加入總體積 10%的菌酛混合後置於有桶 蓋之透明PET 桶內，並模擬本實驗室自行加工生產浸漬醋時之條件，

置於工廠中在室溫下30 天培養。

經過上述的處理之後可得到的樣品如下表：

代號 名稱

ASV 水洗蘋果切片浸漬醋 Apple slice infused vinegar APV 水洗蘋果漿浸漬醋

Apple puree infused vinegar

ASVCl 100ppm 次氯酸水洗蘋果切片浸漬醋

100ppm HClO3 washed apple slice infused vinegar APVCl 100ppm 次氯酸水洗蘋果漿浸漬醋

100ppm HClO3 washed apple puree infused vinegar RAJV 還原蘋果汁浸漬醋

Reconstituted apple juice infused vinegar NASV 生成那塔之水洗蘋果切片浸漬醋

(三) 調整糖度之抑菌試驗

將濃縮蘋果汁以蒸餾水稀釋至 14 ^oBrix，與商用糯米醋以重量 比，3：7 (1.5kg：3.5kg )的比例調配完成後，分置於血清瓶內並加入 10% (v/v)比例的菌液，再添加蔗糖調整至不同可溶性固形物濃度後，

在培養箱內以30^oC 靜置培養 30 天。

(四) 微生物之鑑定

取商用糯米醋、ASV 與 NASV，以醋酸菌選擇性培養基進行分 離純化，再次培養活化之後進行菌種鑑定。並以 LA (Luria –Bertani agar)與 NA (Nutrient agar)培養基培養，鑑定其生成菌落。

LA 的成分： NA 的成分：

Tryptone 10g Beef extract 5g Yeast extract 5g Peptone 10g

NaCl 10g NaCl 2g

Agar 15g Distilled water 1.0L Nata formation apple slice infused vinegar NAPV 生成那塔之水洗蘋果漿浸漬醋

Nata formation apple puree infused vinegar NRAJV 生成那塔之還原蘋果汁浸漬醋

Nata formation reconstituted apple juice infused vinegar CRV 商用糯米醋

Commercial rice vinegar

四、試驗設計

實驗架構

原料確定

加工條件決定

製作流程之建立

一般成分之分析 抑菌條件之測定 菌相之鑑定

結果分析

香氣分析

有機酸含量之變化

氨態氮含量

甲醛態氮含量

可滴定酸含量

值

可溶性固形物

pH 不同糖度之還原蘋果汁 浸漬醋添加菌液試驗 生成那塔菌種鑑定 菌相鑑定

五、實驗流程

新鮮蘋果 濃縮蘋果汁

水洗 次氯酸水洗

稀釋至14^oBrix

切片 打漿

蘋果原料：商用糯米醋 3：7

取樣分析

添加10%醋酸菌液

蘋果原料：商用糯米醋 3：7

添加10%醋酸菌液 ( 浸泡

天) ( 培養

天)

( 浸泡 天)

( 培養 天) 30

30 30

30 添加蔗糖調整 可溶性固形物 濃度後培養

30

天

六、分析項目 (一) 一般成分分析

1. 可溶性固形物 (total soluble solids)

比較浸漬醋與生成那塔的浸漬醋在可溶性固形物上的差異，觀察 生成那塔的菌種對糖的利用情形。此分析項目以不同來源的原料分為 兩組進行浸漬，浸漬 30 天的浸漬醋使用 ROYAL GALA 種蘋果，並 比較其浸漬30 天後之含量；浸漬 60 天的浸漬醋使用青津、富士與德 國種的蘋果，切片並混合之後進行浸漬，觀察其浸漬期間含量的變化。

樣品離心 (3500 ×g，10min)後，以屈折計 (Abbe-3L, Baush &

Lomb, U.S.A)在 20^o C 下測定之，結果以 ^oBrix 表示。

2. 酸鹼 (pH)值 (pH value)

觀察各樣品間的酸鹼值差異及生成那塔菌種的生長環境。此分析 項目也以不同來源的原料分為兩組進行浸漬，用於比較含量與觀察變 化情形。

以 pH meter (Model 6171, JENCO, U.S.A)在室溫下測定之。

3. 可滴定酸 (titratable acidity)

比較各樣品間的可滴定酸含量差異，瞭解生成那塔的蘋果浸漬醋 可滴定酸的變化情形。此分析項目也以不同來源的原料分為兩組進行 浸漬，用於比較含量與觀察變化情形。

參考李等 (1976)的方法，取 2 克樣品，置於 100 毫升燒杯中，以 0.1N 氫氧化鈉溶液滴定至 pH 8.1 並記錄 0.1N 氫氧化鈉之滴定數。

計算方式：

0.1N 氫氧化鈉之滴定數 (mL)× F × b

可滴定酸度 (%, w/w) = ×100 樣品重量 (g)

F：0.1N 氫氧化鈉之力價。

b：相當於 0.1N 氫氧化鈉標準溶液 1mL 的有機酸量 (g)。

4. 甲醛態氮 (formaldehyde nitrogen)

生成那塔的浸漬醋產生氨的味道，因此比較各樣品間甲醛態氮的 含量與變化情形，以及其所利用的氮源類型。此分析項目也以不同來 源的原料分為兩組進行浸漬，用於比較含量與觀察變化情形。

參考李等 (1976)的方法，取 2 克樣品於燒杯中，以高濃度之 NaOH (3N)調整 pH 值至 7.0，再以低濃度之 NaOH (0.1N)滴定至 pH8.1 後，

加入5 毫升甲醛溶液 (37.5%；事先以 3N 之 NaOH 調整為 pH8.1)，攪 拌3 分鐘，再以 0.1N 氫氧化鈉滴定至 pH8.1。

計算方式：

14×0.1×F ×100×T

甲醛態氮 (mg/100g)=

樣品重量 (g) F：0.1N 氫氧化鈉之力價。

T：0.1N 氫氧化鈉標準溶液滴定毫升數。

參考李等 (1976)的方法，取 2 克樣品加入 2mL NaOH (1N)，使 樣品於鹼性環境中 ( pH 9.2)解離出 NH₃，再加入 20mL 過量試劑 H₂SO₄反應，最後以NaOH 滴定至 pH 6.2。

計算方式：

[2（C₁×V₁）－(C₂×V₂)]×10^－3×M（NH₃） 氨態氮 ( %, w/w)=

樣品重 (g) C₁：H₂SO₄濃度 V₁： H₂SO₄毫升數

C₂：NaOH 濃度 V2： NaOH 毫升數 M(NH₃)：NH₃ 莫耳質量

6. 有機酸 (organic acid)含量之變化

比較各樣品間不同有機酸含量的變化，並可瞭解生成那塔的菌種 對有機酸的代謝及其代謝物。

參考孔等 (2004)、黃 (2007)與朱 (2006)的方法，以 HPLC 系統 分析。使用的 Pump 為 JASCO Model PU580、溫度控制器為 JASCO Model TU100，管柱為 Thermo C18 (250 × 4.6 mm)。移動相為經過 0.45 μm 濾膜與超音波震盪脫氣處理並含有 0.5 % (NH4)H2PO4與1%甲醇 的水溶液，以磷酸調整 pH 值為 3 的溶液，流速為 1mL/ min，溫度 則定溫在30^oC。樣品以 0.45 μm 濾膜處理，注射量為 20 μl。使用之 檢測器為 JASCO Model 870 UV detector。

7. 香氣 (aroma)成分

比較 ASV、RAJV 與 NASV 三者之間香氣的組成分與差異。

參考陳 (2006)的方法，樣品以 SPME 法萃取， SPME 膜厚度 50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex/SS (1 cm)，樣品置入 500 mL 三角瓶 中並密封，直接固定 SPME 後插入該密閉三角瓶，在室溫下萃取 20 min。

以 GC/ MS 系統分析，使用 J&W Model DB-1(60m × 0.23mm i.d.) 管柱。注射方式 Splitless；升溫條件：初溫 40^oC，維持 1 min，以 5^oC/min 升溫至150 ^oC，維持 1 min，再以 10 ^oC/min 升溫至 200 ^oC，並在 200 ^oC 維持11 min。注入口溫度為 250 ^oC，檢測器溫度為 300^oC，使用之檢 測器為火焰離子化檢測器 (FID)。移動相為氮氣，流速為 1mL/min。

樣品以 SPME 方式注入，注入口設不分流。MSD 之離子源溫度為 230^oC，四極桿溫度為 150^oC。檢測之結果與 Wiley7n 之質譜資料圖庫 做比對判定。

8. 統計分析

本實驗使用 Statistical Analysis System (SAS)軟體進行統計分 析，以變方分析 (ANOVA)程序作差異性分析，並以 Duncan's Multiple Range tests 作顯著性差異分析。部分數據則做相關性分析比較。

(二) 抑菌能力觀察

以蔗糖調整不同可溶性固形物濃度之 RAJV，分析生成那塔的菌 種可生長的最高糖度，可列為加工生產浸漬醋時的加工條件。此方法

(三) 微生物的鑑定

瞭解浸漬醋所含的微生物菌相，可列為判斷生成那塔之菌種來源 的參考條件。並鑑定生成那塔的菌種。

1. 純化之產那塔菌株鑑定

取 RASV 作為樣品，使用醋酸菌選擇性培養基劃線分離後在 30^oC 下培養3 天，取單一菌落進行 DNA 片段放大及核酸定序後再與資料 庫進行比對。醋酸菌選擇性培養基成分為：

醋酸菌選擇性培養基 Yeast extract 5.0g Peptone 3.0g Agar 15.0g

Distilled water 1.0L

2. 菌相之鑑定

取商用糯米醋、ASV、NASV 以 LA 與 NA 培養基進行培養，再 挑選單一菌落劃線分離培養。分離後取單一菌落進行DNA 片段放大 及核酸定序後再與資料庫進行比對。

3. 鑑定方法

菌落經過第一次劃線分離，在 30^oC 下培養 3 天，待菌落生成後 挑選單一菌落進行第二次劃線分離，同條件下培養。再挑選單一菌落 培養於相同成分之液態培養基，觀察其是否生成那塔。確認為純菌種 後，再培養於醋酸菌選擇性培養基，生成菌落後挑選單一菌落以PCR (polymerase chain reaction)放大 DNA 片段，使用的引子為(BSF/BSR)。

放大之DNA 經電泳確認為單一片段 (band)之後，進行核酸定序。定 序之結果再與NCBI 資料庫作序列比對。

肆、結果與討論

一、 一般成分分析

(一) 浸漬醋浸漬期間可溶性固形物含量之變化與比較

可溶性固形物在浸漬期間之變化以 ASV 及 NASV 作觀察，並以 商用糯米醋做對照。結果發現 NASV 在浸漬期間，可溶性固形物有 逐漸下降的趨勢 (圖十六)，ASV 與商用糯米醋則沒有明顯的變化，

而蘋果切片所含的可溶性固形物則在浸漬 24 小時之後，即溶出於商 用糯米醋而達到平衡的狀態。浸漬醋做比較結果發現生成那塔的浸漬 醋所含可溶性固形物含量均較低 (圖十七)。這說明浸漬醋所含可溶性 固形物在生成那塔的時候可能被菌種做為營養源利用，因而有下降的 現象，此與前人研究 (Son et al., 2001)之結果相符合。而 RAJV 與 NRAJV 可溶性固形物含量較高的原因，則是因為調配的還原果汁其 可溶性固形物含量較切片高，製成浸漬醋之後所含的可溶性固形物含 量也較高。

(二) 浸漬醋浸漬期間可滴定酸含量變化與比較

可滴定酸在浸漬期間之變化以 ASV 及 NASV 作觀察，並以商用 糯米醋做對照。結果發現 NASV 在浸漬期間，可滴定酸有逐漸下降 的趨勢 (圖十八)，ASV 與商用糯米醋則沒有明顯的變化，而蘋果切

圖十六、樣品所含可溶性固形物在常溫下浸漬60 天之變化 Fig. 16. Change of total soluble solids contents of vinegars stored at ambient temperature for 60 days.

ASV: Apple slice infused vinegar

NASV: Nata formation apple slice infused vinegar CRV: Commercial rice vinegar