第二章 研究背景與理論
2.1 反微胞萃取蛋白質
界 面 活 性 劑 的 結 構 中( 圖 2-1) ， 分 子 的 兩 端 由 疏 水 基 團 (hydrophobic group)以及親水性基團(hydrophilic group)所組成，由於一 端親水、一端親油的特性，可減低兩相間的界面張力。界面活性劑主 要依照兩種方法分類：(1)根據親水基的帶電性，可分為陽離子型、
陰離子型，兩性型與非離子型界面活性劑(表 2-1)。(2)根據界面活性 劑的溶解性，為了描述界面活性劑分子的疏水親水程度，可藉由觀測 各種親水以及疏水基團，區分為較為親水或較為疏水的界面活性劑，
或是將其表示成 HLB 數值(hydrophile-lipophile balance)做為參考(表 2-2)，HLB 值越大，代表界面活性劑親水程度越大。
2.1.2 微胞與反微胞 (1) 微胞(Micelle)
在水溶液中，界面活性劑的疏水基團顯然是不喜歡極性的水，因 此界面活性劑分子的疏水端會盡可能逃離水。當水中的界面活性劑分 子濃度升高到一個程度，溶液的物理性質如表面張力、滲透壓、電導 度等會發生明顯的改變(圖 2-2)，這是由於數十至數百個界面活性劑 分子在水中聚集在一起，親水基朝外與水分子水合，並將疏水基包圍 避免疏水基與水分子直接接觸，形成一個團狀的結構，稱為微胞 (micelle)。雖然微胞通常成球形，但實際形狀與大小會隨著界面活性 劑濃度與溫度而逐漸改變，形成雙層或是層狀等結構(圖 2-3)，界面
活性劑可形成微胞的濃度，稱為臨界微胞濃度 CMC (critical micelle concentration)。
(2)反微胞(Reverse micelle)
當疏水型的界面活性劑處於有機溶劑之中，也能產生類似水中微 胞的聚集結構4，因為這個環境之中，界面活性劑的兩端與水中微胞 的排列方向相反，疏水端碳鏈朝外溶於有機溶劑，親水端朝內，這種 聚集結構稱為反微胞(reverse micelle)(圖 2-4，圖 2-5)。反微胞中心是 一個極性高的親水環境叫做水核(water pool)，因為水核存在於有機溶 劑之中，我們稱之為water in oil。
2.1.3 反微胞萃取親水性物質的機制 (1) 靜電作用力(electrostatic interactions)
離子型界面活性劑帶有正(負)電荷，利用界面活性劑聚集而成的 反微胞萃取親水性物質，離子型界面活性劑和水溶液中的帶電物質之 間的靜電力是重要的關鍵所在5,6。譬如從反微胞有機相萃取水溶液中 的帶電染料(表 2-3)，對於帶負電荷的染料分子，需採用陽離子型的 界面活性劑，相反地，萃取帶正電的染料分子需要用到陰離子型的界 面活性劑7。藉由正負電荷相互吸引的力量達萃取效果，此萃取過程 中靜電力是最主要的作用力。
(2)疏水性作用力(hydrophobic interactions)
而對非離子型的界面活性劑而言，改變pH值對其萃取的效果影 響不大，亦即上述所提到的靜電作用力對非離子型的界面活性劑並非
影響其萃取的主要因素，因此有些學者認為水溶性分子的疏水基與界 子，每一種蛋白質都有它的等電點(isoelectric point, pI)，在酸鹼值小 於 pI 的環境中，蛋白質表面淨電荷為正電，相反地，在酸鹼值大於 pI 值的環境中，蛋白質表面靜電荷為負電。離子型界面活性劑的親水 端帶電，於有機溶劑中形成反微胞，想要使蛋白質能被萃取進入反微 胞，則蛋白質必須和反微胞帶相反電荷，產生靜電吸引力，此一萃取 過程我們稱為正向萃取(forward extraction)。而當在另一個相反的 pH 環境之下，蛋白質表面淨電荷轉變成和反微胞帶相同電荷，產生靜電 排斥力，蛋白質離開反微胞回到水相，此一過程我們稱為反向萃取 (backward extraction)。我們可說 pH 值和萃取主要機制(靜電作用力) 的關係為：pH 值直接影響蛋白質帶正電或負電、決定萃取的排斥力 或吸引力。
(2)水溶液中的離子強度(ionic strength)12,
水溶液中帶電粒子之間的靜電作用力，會因為溶液中的離子強度 增加，造成靜電吸引或排斥力降低，稱之Debye screening effect，此 效應可減低蛋白質和界面活性劑的淨電力。在一個以AOT 反微胞相 萃取細胞色素蛋白(cytochrome c)的實驗中，固定水溶液的pH值，使 細胞色素C蛋白和反微胞之間電荷相反，兩者之間存在靜電吸引力，
以不同的KCl離子濃度觀察萃取效果，發現在 0.1 M KCl的環境下，
細胞色素C分子很容易地被反微胞萃取，而提高離子強度之後，在高 達1 M KCl情況下， 細胞色素C分子無法以反微胞萃取。同時又有研 究發現，若是水中的離子強度不高(濃度< 0.1 M)，含有界面活性劑的 有機相和水溶液兩相不容易分層，無法有效萃取蛋白質14，
離子強度與萃取主要作用力(靜電吸引力)的關係為：雖無法改變 蛋白質電荷(也就是吸引力和排斥力)，但其濃度可調整靜電作用力大 小，進而影響萃取效果。
(3)離子種類(Type of Electrolyte)
水溶液中的鹽類種類也會影響蛋白質的萃取效果，鹽類解離之後 產 生 的 離 子 會 產 生 遮 蔽 效 應(screening effect) ， 有 文 獻 發 現 在 AOT/isooctane系統下只改變離子種類15，對蛋白質的萃取效果是Li+
>Na+ >Cs+ >Rb+ >K+，推測是金屬的水合離子電荷的遮蔽效果所影 響，鉀離子遮蔽的效果最大導致萃取率不高。鋰離子的遮蔽效果最 差，所以蛋白質的萃取效果最好。
(4)界面活性劑16
界面活性劑的選擇是非常重要的一部分，目前常見用在反微胞萃 取 的 陰 離 子 型 界 面 活 性 劑 有sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate (AOT)以及di-(2-ethylhexyl)phosphoric acid (DEHPA)兩種17，AOT是屬 於磺酸型陰離子界面活性劑，DEHPA則是磷酸型陰離子，除了這兩 種陰離子型界面活性劑之外，尚有一些研究試圖合成不同種類的界面 活性劑18，目的就是為了達到更有效、迅速、選擇性高的蛋白質萃取。
Trioctyl methyl ammonium chloride (TOMAC) 和 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)則是常用在蛋白質萃取的陽 離子界面活性劑，它們都是四級銨鹽，在有機溶劑中形成帶正電荷的 反微胞19,20。
此外，增加界面活性劑的濃度可增加有機相萃取蛋白質的量21， 濃度高的界面活性劑雖然有利於正向萃取，但將會使蛋白質的反向萃 取相對困難，因此如何調整界面活性劑濃度，在正向-反向萃取率之 間達到最佳化，也可能是設計萃取條件的參考之一。
(5)蛋白質種類22
因為蛋白質是一種複雜的巨大分子，不同的蛋白質除了pI值、分 子量不同之外，它們的表面電荷分佈也不相同。不同的pI值可造成在 同樣的pH值環境下，一種蛋白質帶正電、另一種則帶負電。反微胞 的水核大小有限，比較容易萃取低分子量的蛋白質，然而高分子量的 蛋白質(分子量大於 100000)因為過於巨大造成萃取效果不佳23，所以 需要用到較高的界面活性劑濃度，造成有機-水兩相不容易分層。
(6)共界面活性劑(cosurfactant)和共溶劑(cosolvent)
因為反向萃取的速率緩慢，於是在反微胞系統中，在主要的界面 活性劑加入非離子型界面活性劑24或是共溶劑25，嘗試改變反微胞的 電荷分佈或是反微胞形狀，期望減低蛋白質和反微胞的電荷作用力，
減低反萃取時間，所以加入這類添加物的目的是為了加強反萃取效 果。另外有研究使用終結反微胞電荷的方法，在使用陰離子界面活性 劑的情況之下，加入陽離子型界面活性劑會瓦解反微胞26，產生電荷
中和，蛋白質便迅速回到水相。
2.2 逆流層析(Countercurrent chromatography)