第二章 研究背景與理論
2.2 逆流層析(C OUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY )
逆流層析27,28是一種不需固體靜相支持物的液相-液相分配層析
法，所用的動相、靜相皆為液體，利用重力和離心力將液態靜相滯留 在管柱中，並利用樣品在動靜相中的分佈係數(partition coefficient)不 同而分離，逆流層析的液態靜相不會有吸附現象，不會造成樣品流失 和避免管柱阻塞而失效，能製備分離大量的樣品，適合用在天然物的 製備分離。
早期的逆流層析技術為一種不連續式分液漏斗的液相萃取，我們 稱此項技術為逆流分佈(Countercurrent Distribution，CCD)29，但因其 操作耗時且儀器複雜龐大容易損壞，Yoichiro Ito 等人對於CCD的理 論基礎開始深入研究而發展出離心系統，即所謂的離心式行星螺管結 構 (Coil Plant Centrifugal，CPC)。之後Ito和Conway 等人進而發展出 多種不同的儀器結構。在 1981 年發展出高速逆流層析 (High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)即是其中之一。
2.2.2 逆流層析分離理論30,31
逆 流 層 析 分 離 的 基 礎 是 建 立 於 逆 流 分 佈CCD(countercurrent disturbution)，CCD是一連串的萃取過程，其過程可以用圖 2-6(A)說 明：若有多個連續的萃取槽，最初分析物在L0中，而U0、U1...Un和L1、 L2...Ln分別為不含分析物的兩相（L代表下層液；U代表上層液）。當 U0和L0混合後，物質在液相/液相系統中分配，達到濃度平衡時，U0會
萃走部份分析物，接著和L1混合，完成平衡後，再依序與L2、L3...Ln
(1) 流體靜態平衡系統 (Hydrostatic Equilibrium System，HSES)在 HSES 系統中，管柱的每一個部分所受力大小固定。靜相因重力場滯
留在管柱中，樣品隨著動相穿越靜相，並藉著樣品在動靜相的分配係 數不同而達到分離。圖 2-7 為 HSES 的示意圖。圖 2-7(A)，所使用的 靜相是事先平衡過的下層相，先使其充滿管柱後將動相 (上層相) 由 一端緩緩注入，靜相會被動相推出直到兩相的界面到達螺管底部，此 時由於重力場的作用，動相開始往上穿越靜相直到螺管頂端，如此一 直重複直到分離管柱的末端，因此造成每一圈的螺管都會保留住一半 的靜相。圖2-7(B)和圖 2-7(A)相反，使用平衡過的上層相當作靜相，
而下層相為動相，使動靜相在螺管中產生不同的平衡狀態。
(2) 流體動態平衡系統 (Hydrodynamic Equilibrium System，HDES ) 在HDES 系統中，螺旋管柱會藉由轉動所產生的扭力及離心力將靜相 滯留在管柱中，這扭力是由希臘數學家阿基米德發現，藉由轉動螺旋 型的管子，可將河水取至水壩(圖2-8)，此即所謂阿基米德扭力
(Archimedes screw force)。此原理亦被應用在HDES 系統中。若螺旋 管柱內存在有輕重兩相，受阿基米德扭力以及重力的作用之下，輕重 兩相因為受力不均而在管柱中有不同的分佈，圖2-9 說明在重力場作 用下，阿基米得扭力對旋轉中螺管的影響。圖2-9(a)先在螺管中注滿 水再導入氣泡和玻璃珠，封住螺管兩端，接著將螺管緩慢旋轉，由於 阿基米得扭力的作用將使氣泡與玻璃珠帶往螺管的左端，此表示不管 比水輕或比水重的物質皆會向螺管的某一端移動，此端稱為螺管的頭 端 (head)，而另一端則稱為尾端 (tail)。圖2-9(b)中，利用平衡過的溶
劑系統進行相同的實驗，圖2-9 (b)上圖是先將螺管注滿較輕的一相，
也就是溶劑系統的上層相，而較重的一相則由尾端打入，此時較重的 一相行為就像是水中的玻璃珠會往頭端移動，圖2-9(b)下圖則是先將 較重的一相注滿螺管，由尾端打入較輕的一相。其行為就像是水中的 氣泡。圖2-9(c)，先將螺管內填入等體積的輕重兩相，兩相會在螺管 的每一圈形成分離，當螺管開始轉動，任一相多餘的量則會被推至螺 管尾端。因此，當螺管達到動力學平衡，則兩相在螺管中的分佈將保 持不變，使靜相維持某程度的滯留。
2.1.4 反扭轉機構的應用
由於在 DCCC 等僅使用重力場的形式中，必須降低流速防止靜 相的流失，因此分離上往往要耗費數天的時間；然而在導入離心場的 旋轉式儀器上，可以較易於保持靜相而使得流速得以提高，可以在數 小時內完成分離。因此目前的儀器設計大多使用了旋轉結構以提供較 強的離心力場。但在此系統中出現了一個重要的問題，便是如何將流 體導入管以及導出管連接在旋轉的分離管上而不至發生扭轉打結現 象。
1975 年，Ito, Y. 等人應用反扭轉機構來防止導管糾結28,32。反扭轉機 構的發展，使得逆向流層析的技術得以廣泛應用。其基本架構依照行 星繞旋的模式分成三大類(圖 2-10)：本實驗所使用的高速逆向流層析
儀屬於行星軸同步式。
2.1.5 高速逆流層析 (HSCCC) (1) 原理33
高速逆流層析設計原理如圖2-9 所示，中心軸呈水平方向，一螺 管支持物支撐一行星齒輪 (planetary gear)，其和固定在中心軸上的太 陽齒輪 (sun gear、stationary gear) 相互咬合。其運動模式為螺管支持 物不僅繞著中心軸旋轉，同時自身也以相同的角速度往相同方向旋 轉。螺管支持物的同步行星運動可防止流體導管因為旋轉產生的扭 轉。(圖 2-11)
(2) 影響相分佈的因素
除了螺管在不同轉速下會影響兩不互溶溶劑的相分佈，此外，螺 管半徑 (r) 與公轉半徑 (R) 的比值β值 ( β= r/R )34，也是影響的因 素。首先將較輕的一相 (靜相) 填滿管柱，令管柱旋轉，接著打入較 重的一相 (動相)，待兩相達動力學平衡後，由頻閃觀測儀可看到管 柱內的相分佈情形，如圖2-12。
在 A 位置因靠近離心力中心區域，離心力較小，阿基米得扭力 帶動兩相使得動靜相劇烈混合，為混合區 (mixing zone) ;而在 B 位置 管柱外側因離心力較大，可蓋過阿基米得扭力使得動靜相分成一明顯 界面，較輕的一相在內，較重者在外為澄清區 (settling zone)。隨著 管柱公轉，在 b、c、d 位置皆有與 a 相同的情形，表示兩相在任何位 置都可不斷進行混合與澄清。
(3) 溶劑系統的選擇
大部分溶劑系統含水，配合其他有機溶劑，相互飽和而為不互溶 的兩相，分別為動相與靜相。其成分組合視其分離條件而決定。在高 速逆流層析中，溶劑系統的選擇有幾點必須注意：(1) 樣品不會被分 解和去活性 (2) 樣品有充分的溶解度 (3) 適當的分配係數 (4) 良好 的靜相滯留量。
(4) 影響靜相滯留量的因素
在高速逆流層析中，液體靜相在管柱中滯留的多寡影響了分離的 效果。在較高的靜相滯留量下可提高分離的解析度以及對樣品的承載 量。影響靜相滯留量及分離的因素可分為下列幾點35
(a) 溶劑系統 : 在選擇溶劑系統時必須考慮溶劑極性、對溶質的選擇 性以及溶質在不同溶劑中的溶解度。一般而言，分析物在兩相間最佳 化的分配係數K 需落在 0.2 ~ 5 之間，才可達到較佳的分離效果。但 在二元溶劑系統中，要落在此範圍並不容易，因此，常藉由加入第三 種甚至第四種可溶於兩者溶劑以調和原先溶劑在極性或是界面張力 的差異。之後，再依分離需要決定動靜相。
(b) 轉速 : 在較大的轉速下，可提供較高的靜相滯留量，解析度也較 佳。
(c) 動相流速 : 較慢的動相流速，會有較佳的靜相滯留量，提高解析 度，但分離時間會變長。