4.1 收集液之分析方法
我們利用HPLC可以在20分鐘之內分析肌紅蛋白、細胞色素C以 及溶菌酶 蛋白質混合物，使用的管柱是polystyrene-diviylbenzene reversed-phase HPLC column (PLRP-S)，這類的reversed-phase HPLC 管柱適合應用在蛋白質的分析36。我們分析蛋白質混合物以280 nm UV偵測器(圖4-2)出現4個明顯的波峰A、B、C、D，在經過和標準品 比對之後，波峰A(8.1 min)為細胞色素C ，波峰B(9.4 min)是溶菌酶。
在分析肌紅蛋白標準品時，圖4-3，出現兩個波峰C(14.8 min)和D(16 min)，改用409 nm可見光再度偵測肌紅蛋白的結果，只存在單一訊號 D’(16 min)，由此可知C物質吸收波長280 nm的紫外光，而且無法被 波長409 nm的可見光所偵測，相反地D物質同時有280 nm以及409 nm 的吸收。
為了更進一步確認組成物質，兩物質分別收集後以質譜鑑定(圖 4-4)，波峰C(14.8 min)是肌紅蛋白分子量約為16954，而波峰D(16 min) 分子量約為616，因此我們可以確定這是肌紅蛋白之中的heme分子(圖 4-5)，另外研究指出有機溶劑或酸性條件下造成肌紅蛋白 和heme分 離37，可解釋我們實驗中，以reversed-phase HPLC分析肌紅蛋白之後 會形成兩支波峰C、D的原因。所以在蛋白質定量上選用波峰A(細胞
色素C) 波峰B(肌紅蛋白)以及波峰C(肌紅蛋白 without heme)，利用 0、25、50、100 ppm四種不同濃度的蛋白質標準品做檢量線，分析各 收集管中的蛋白質濃度。
4.2 以高速逆流層析分離蛋白質混合物實驗結果 4.2.1 實驗一
使用兩動相：50 mM Tris-HCl 、0.1 M KCl、 pH 7 緩衝溶液，以及 50 mM K2HPO4、0.1 M KCl 、pH 12 緩衝溶液，其餘實驗條件不改變，
進行梯度沖提，動相組成如圖 4-6 所示，管柱總體積 28 mL，得到靜 相滯留量大約是10 mL，逆流層析訊號如圖 4-7 所示。
由層析圖中可見在實驗流析的前 40 分鐘，整個系統相當不穩 定，因為溶液混濁而造成偵測到巨大且雜亂的訊號，注入蛋白質和動 相梯度變化之後，從管柱流出的液體呈現不穩定的混濁狀態，表示逆 流層析內部的相分佈遭到擾動，蛋白質的分離效果也非常不理想。我 們認為是因為離子強度不夠，使得有機-水相界面不容易迅速分層而 產生混濁。
4.2.2 實驗二
由於實驗一造成有機-水相界面混濁的原因，可能是因為離子強 度不夠，為了解決此項缺點，我們將KCl 濃度提高到 0.2 M，希望能 解決混濁以及靜相流失的問題。動相混合比例如圖4-8 所示
實驗二的逆流層析圖(圖 4-9)較為穩定許多，添加離子濃度可幫 助有機相-水相在逆流層析中的分層，因為有機靜相能有效地滯留在 管柱中而非迅速流失，增加了對於蛋白質樣品的分離能力，隨著動相 pH 值梯度改變，可明顯分辨訊號波峰，但是圖中之層析訊號圖並不 能完全表示純凈的蛋白質，流析的動相分別收集 17 管，從各收集管 的pH 值(圖 4-10)，可知動相的 pH 值從 7 到 12 線性攀升。
由HPLC 分析各收集管中的蛋白質濃度(表 4-1、圖 4-11a)以及蛋 白質相對濃度(表 4-2，圖 4-11b)，由於肌紅蛋白的 pI 值約為 7，在動 相pH 7 條件下，蛋白質表面淨電荷與陰離子型界面活性劑 AOT 的電 荷作用力較小，肌紅蛋白不易進入反微胞靜相。cyrochrome c 和溶菌 酶兩蛋白質在pH 7 環境中，表面正電荷和 AOT 反微胞有強大的吸引 力因而容易進入靜相，而與肌紅蛋白分離開來。分離出肌紅蛋白之 後，再提高動相pH 值可逐漸減低蛋白質的表面正電荷，細胞色素 C 分子從pH 7 升高到 pH 9 的過程，表面正電荷逐漸微弱，蛋白質與反 微胞的靜電吸引力逐漸減小，細胞色素 C 離開反微胞回到動相水溶 液，與溶菌酶分離開來。隨著 pH 值逐漸增高至 11 左右，溶菌酶表 面電荷和AOT 反微胞的吸引力也逐步減弱，因而回到動相水溶液中。
但是蛋白質溶菌酶的回收率不高，溶菌酶的等電點 pI = 11，表面 正電荷和反微胞之間有強大的電荷吸引力，即使以pH 12 動相沖提，
溶菌酶有效回收率只有 16 % (表 4-3)，實驗中不使用更高的酸鹼值 ( pH 13 or 14 )是為了避免破壞蛋白質活性，我們將嘗試在後續的實驗 中更改酸鹼值之外的其他參數。
4.2.3 實驗三
為了提高溶菌酶的回收率，我們除了使用 pH 動相梯度之外，再 加入 KCl 增加動相的離子強度，形成了 pH 7~12 的酸鹼梯度和 KCl 0.2~0.6M 的離子強度梯度，其動相混合比例如圖 4-12 所示，藉由 pH 值梯度逐步改變蛋白質表面電荷，離子強度的增加可減低溶液中蛋白 質和反微胞的電荷作用力。
實驗三的兩動相A3和B3線性梯度沖提(圖 4-12)，從逆流層析訊號 圖可見訊號(圖 4-13)，依序收集之後得到 20 支蛋白質收集管，量測 各管中的pH變化(圖 4-14a)，隨著流析時間增加，沖提收集管中的pH 值如預期地進行梯度升高，因為兩動相線性比例混合，所以KCl濃度 預測如(圖 4-14b)。利用HPLC定量蛋白質含量(表 4-4,圖 4-15a)和蛋白 質相對濃度(表 4-5,圖 4-15b)以及質譜鑑定蛋白質(圖 4-16)，確認可得 到蛋白質相對濃度85 %以上，回收率 60 %以上的效果。
比較實驗二和實驗三的分析結果，兩實驗中的肌紅蛋白和細胞色 素C 的回收濃度和蛋白質相對濃度相差不大(表 4-3，表 4-6)，但溶菌 酶的濃度和蛋白質相對濃度均有提升，回收率從16 % 大幅提升到 60
%，因為兩實驗的 pH 值梯度條件相同，能大幅提升溶菌酶蛋白質的 回收率是因為提高了 KCl 離子濃度，有效降低蛋白質和反微胞的靜 電吸引力，使溶菌酶反萃取回水中。