本部分研究主要分為三方向，包括 BMAA 濃縮及分析方法之建立、臺灣地 區湖庫中環境水體 BMAA 的檢測分析和優勢藻種產 BMAA 能力之調查分析。詳 細研究流程如圖 6-1 所示：
圖 6- 1. 台灣地區湖庫及飲用水藻類毒素β-甲氨基-L-丙氨酸流佈之研究研究流 程圖
濃縮樣品
SPE 管柱選擇 操作條件確認
HPLC/MS/MS 分析 吹氮濃縮
操作條件確認 BMAA 分析方法確立
DI water
天然水
含藻體水樣 水樣中 BMAA 的檢測分析
溶解態 BMAA
細胞內 BMAA
Free BMAA Bound BMAA 目標藻種鑑別與計數
6-1 三種固相萃取管柱對柱孢藻液的萃取效果(凍融法)
以凍融法破碎藻體再經固相萃取濃縮對數生長期與穩定期的柱孢藻液中游 離態 BMAA 及蛋白質鍵結 BMAA，並比較固相萃取管柱 MM1、MCX 及 HCX-3 等不同管柱對 BMAA 之萃取效果。
6-1-1 樣品前處理 游離態 BMAA
以0.45μm 濾膜過濾藻液，並調整至 pH=3，即可進行固相萃取 蛋白質鍵結 BMAA
1. 取藻液凍融三次，接著離心去除上澄液
2. 加入 1 毫升 6M 鹽酸回溶，以乾式加熱器恆溫 130℃加熱 20 小時 3. 吹氮至乾燥並以 0.5 毫升 LC water 回溶，即可進行固相萃取 6-1-2 固相萃取步驟
1. 2 毫升甲醇、2 毫升 LC water 活化管柱 2. 過樣品
3. 1 毫升 0.1%甲酸、1 毫升 0.1%甲酸+25%甲醇溶液清洗管柱 4. 吹空氣至管柱常溫
5. 3 毫升 15%氨水甲醇溶液脫附
6. 吹氮至乾，以 0.5 毫升 LC water 回溶 7. 離心過濾後上機
6-1-3 實驗結果
當柱孢藻於對數生長期時，以 MM1 和 HCX-3 兩種管柱相較於 MCX 管柱濃 縮蛋白質鍵結 BMAA，有較好萃取效果；然並未在穩定期之柱孢藻萃取液中偵 測 BMAA。此外，推測未偵測到對數生長期柱孢藻液游離態 BMAA 的原因為濃 度過低，而此一濃縮倍率之柱孢藻萃取液 BMAA 之濃度未達儀器之偵測極限。
表 6- 1. 固相萃取對數生長期與穩定期之柱孢藻液(凍融法) 蛋白質鍵結
BMAA
游離態 BMAA 柱孢藻 3.22x106 cells/ mL @對數生長期(170324)
MM1 + -
MCX - -
HCX-3 + -
柱孢藻 7.38x106 cells/ mL @穩定期(170406)
MM1 - -
MCX - -
HCX-3 - -
注：“+”表示偵測，“-”表示未偵測。除了對數生長期游離態 BMAA 柱孢藻液體積為 15 毫升 外，其餘柱孢藻液體積皆為 10 毫升。
6-2 兩種固相萃取管柱對柱孢藻液及環境水樣的萃取效果(超音波破碎法)
以超音波破碎法破碎藻體再經固相萃取濃縮對數生長期與穩定期的柱孢藻 液中的游離態 BMAA 及蛋白質鍵結 BMAA，並比較固相萃取管柱 MCX 及 HCX-3 萃取效果。此外，濃縮環境水樣之游離態 BMAA，且在水樣中添加 10ppb BMAA 以推算回收率。
6-2-1 樣品前處理
以超音波破碎機(Digital Sonifier，BRANSON 公司)破碎水體中藻顆粒 15 分 鐘(Amplitude= 61%, Pulse on= 5.0 sec, Pulse off= 3.0 sec)，接著離心
游離態 BMAA
以0.45μm 濾膜過濾上澄液，並調整至 pH=3，即可進行固相萃取 蛋白質鍵結 BMAA
1. 除去離心後的上清夜，並在剩下的藻體中加入 1 毫升 6M 鹽酸回溶，
以乾式加熱器恆溫 130℃加熱 20 小時
2. 吹氮至乾燥並以 0.5 毫升 LC water 回溶，即可進行固相萃取 6-2-2 固相萃取步驟
同 6-1 節
圖 6- 3. 樣品前處理流程圖(超音波破碎法)
6-2-3 實驗結果
當柱孢藻於對數生長期時，以 MCX 和 HCX-3 兩種管柱萃取柱孢藻液皆可以 偵測到蛋白質鍵結 BMAA；但未能在穩定期之柱孢藻萃取液中偵測 BMAA (表 6-2)。由於穩定期的柱孢藻數多於對數生長期之藻數，但皆未能於固相萃取過程 中偵測出 BMAA 之存在，推測柱孢藻在對數生長期中可能產生較多的 BMAA。
雖於對數生長期的柱孢藻中分析到 BMAA，然因濃度低於定量極限，因此無法 定量。
為了測試固相萃取法對於 BMAA 之萃取效率，取去離子水 10mL，並在水中 添加 BMAA 標準品使其濃度為 10 ug/L 後進行固相萃取實驗；同時於 106 年 4 月採集金門太湖湖水及淨水廠原水及 106 年新竹寶山水庫湖水及原水(皆有藻華 發生)，進行環境水樣的調查。由表 6-3 得知，HCX-3 管柱較 MCX 管柱之回收 率為高，有較好萃取效果，但此回收率仍未達理想萃取濃縮之成效。
表 6-4 為 2016-2017 年間於台灣本島及離島各水庫對 BMAA 的調查，其中 包括金門太湖水庫、寶山水庫、蘭潭水庫都曾檢驗到 BMAA 存在於湖水或原水 中，寶山水庫更於清水中檢驗出 BMAA。而由於在前述結果中的回收率不甚理 想，因此其餘未檢驗出 BMAA 的各湖庫，也無法完全排除因回收率偏低而導致 無法測到 BMAA 存在的可能。
表 6- 2. 固相萃取對數生長期與穩定期之柱孢藻液(超音波破碎法) 蛋白質鍵結
BMAA
游離態 BMAA 柱孢藻 3.17x106 cells/ mL @穩定期(170421)
MCX - -
HCX-3 - -
柱孢藻 1.21x106 cells/ mL @對數生長期 (170519)
MCX + -
HCX-3 + -
註：於 170519 之固相萃取步驟中，移除清洗後之吹管柱至乾步驟
表 6- 3. 固相萃取 10mL 去離水子添加回收率測試(濃縮倍率 40) BMAA 濃度(μg L-1) 回收率( %) 去離子水(170519)
MCX 1.09 10.9
HCX-3 2.95 29.5
註：於 170519 之固相萃取步驟中，移除清洗後之吹管柱至乾步驟
表 6- 4. 台灣湖庫中 BMAA 之調查 水樣來源 BMAA (μg L-1) 160225
仁義潭水庫湖水 ND
阿公店水庫湖水 ND
蘭潭水庫湖水 ND
160507
蘭潭水庫湖水 +
160512
金門太湖原水 0.23
金門太湖湖水 A 2.06
金門太湖湖水 B 2.59
160603
寶山水庫湖水 A 0.04
寶山水庫湖水 B 0.05
160616
馬祖勝利水庫原水 +
160624
馬祖勝利水庫湖水 ND
馬祖勝利水庫原水 ND
160627
金門太湖湖水 ND
金門太湖原水 ND
金門太湖慢濾水 ND
金門太湖清水 ND
160721
金門陽明湖水庫湖水 ND
170421
金門太湖湖水 ND
金門太湖原水 ND
170519
寶山水庫湖水 ND
寶山水庫原水 ND
170704
寶山水庫原水 0.166
寶山水庫清水 0.156
註：“+”表示偵測到 BMAA，但因濃度低於定量極限因此無法定量，
6-3 串聯 HLB+MCX 管柱對環境水樣的萃取效果
由前述固相萃取法未能有效濃縮環境水樣中游離態 BMAA，故參考 Yan 等 人論文中提及之最佳化固相萃取步驟(Yan et al. 2017)，並移除清洗管柱後之吹 氮步驟，以萃取環境水體中游離態 BMAA。
6-3-1 樣品前處理 游離態 BMAA
以0.45μm 濾膜過濾藻液，並調整至 pH=3，即可進行固相萃取 6-3-2 固相萃取步驟
1. 10 毫升甲醇、10 毫升 2%甲酸活化 MCX 管柱；10 毫升甲醇、10 毫升 LC water 活化 HLB 管柱
2. 串聯 HLB 及 MCX 管柱過樣品
3. 10 毫升 2%甲酸、10 毫升甲醇清洗 MCX 管柱 4. 7.5 毫升 5%氨水甲醇溶液脫附
5. 吹氮至乾，以 0.5 毫升 0.1%甲酸回溶 6. 離心過濾後上機
圖 6- 4. 串聯 HLB+MCX 管柱之固相萃取步驟(Yan et al. 2017)
6-3-3 實驗結果
此部分實驗採取串聯式固相萃取採用串聯 HLB+MCX 管柱，調查寶山原水 及清水中之 BMAA，經固相萃取濃縮後， 檢測到寶山水庫原水及清水中 BMAA 濃度分別為 0.166 和 0.156μg L-1，表示在寶山原水及清水中確實有 BMAA 存在 之情形，但由於未針對環境水樣之回收率進行探討，而無法計算水樣中 BMAA 之真實濃度。此外，添加濃度為 10μg L-1 BMAA 去離子水之回收率依舊未顯著 提升(表 6-5)。因此針對天然水和去離子水之固相萃取回收率需要更進一步的研 究。
表 6- 5. 串聯 HLB+MCX 管柱之環境水樣固相萃取(濃縮倍率 40) BMAA 濃度(μg L-1) 回收率( %) 170704
寶山原水 0.166 -
寶山清水 0.156 -
10mL 去離子水添加 10ppb 2.37 23.7
6-4 兩種串聯 HLB+MCX/ C-18+HCX-3 管柱對環境水樣的萃取效果
調整 6-3 節之固相萃取操作參數：移除清洗後之吹氮步驟、分開清洗分開 脫附兩支管柱並改變清洗溶液，以萃取環境水體中游離態 BMAA，並比較兩種 固相萃取管柱串連方式 HLB+MCX、C-18+HCX-3 之萃取效果。
6-4-1 樣品前處理 游離態 BMAA
以0.45μm 濾膜過濾藻液，並調整其 pH=3，即可進行固相萃取。
6-4-2 固相萃取步驟
1. 10 毫升甲醇、10 毫升 2%甲酸活化 MCX/ HCX-3 管柱；10 毫升甲醇、
10 毫升 LC water 活化 HLB/ C-18 管柱
2. 串聯 HLB 及 MCX 管柱過樣品；串聯 C-18 及 HCX-3 管柱過樣品 3. 5 毫升 2%甲酸、5 毫升甲醇清洗 HLB/ MCX 管柱；3 毫升 0.1%甲酸、
3 毫升 0.1%甲酸+25%甲醇溶液清洗 C-18/ HCX-3 管柱
4. 7.5 毫升 5%氨水甲醇溶液分別脫附 HLB/ MCX 管柱；6 毫升 5%氨水 甲醇溶液分別脫附 C-18/ HCX-3 管柱；
5. 吹氮至乾，以 0.5 毫升 0.1%甲酸回溶 6. 離心過濾後上機
圖 6- 5. 改變參數之 Yan 等人(2017)論文中固相萃取步驟(HLB+MCX)
圖 6- 6. 改變參數之 Yan 等人(2017)論文中固相萃取步驟(C-18+HCX-3)
6-4-3 實驗結果
利用改變參數後的串聯 HLB+MCX 固相萃取方法，在寶山原水、寶山清水、
葫蘆埤水和成功湖水中皆可偵測到 BMAA，且推算其真實濃度分別為 0.1、0.17、
0.3 及0.55μg L-1 (表 6-6)；添加標準品至水樣中測試回收率，從表中可看出，不 同天然水之回收率：寶山清水> 寶山原水> 去離子水≌ 葫蘆埤水> 成功湖水。
再從水體中的天然有機物含量來看(NPDOC)，葫蘆埤水體中的 DOC 濃度雖高達 12.97 mg L-1，但在回收率上卻與成功湖水(3.66 mg L-1)及去離子水並沒有太大的 差異，顯示此部分水體中的有機物多寡對於回收率並沒有太大的影響。
而取寶山原水以兩種不同型式之串聯 HLB+MCX、C-18+HCX-3 管柱之萃取 效果，比較其回收率可知 HLB+MCX 較 C-18+HCX-3 的管柱串聯方式為佳，已 提升至 50%以上。然而，添加 10ppb BMAA 去離子水之回收率約為 40%依舊未 顯著提升(表 6-7)。
表 6- 6. 改變參數串聯 HLB+MCX 管柱之環境水樣固相萃取(濃縮倍率 40)
游離態之 BMAA 添加 10ppb
HLB+MCX 真實濃度 HLB+MCX 回收率
水樣來源 μg L-1 μg L-1 μg L-1 %
170720
寶山原水 2.09 0.10 210.16 52.5
寶山清水 4.08 0.17 238.43 59.6
去離子水 NA NA 151.88 38.0
170726
葫蘆埤水 4.74 0.30 157.76 39.44
成功湖水 7.22 0.55 130.94 32.74
去離子水 NA NA 159.79 39.95
NPOC:葫蘆埤水= 12.97mg L-1、成功湖水= 3.66 mg L-1
表 6- 7. 兩種串聯 HLB+MCX/ C-18+HCX-3 管柱對寶山原水的萃取效果 BMAA 濃度(μg L-1) 回收率( %) 10mL 寶山原水添加 10ppb
HLB+MCX (170720) 210.16 52.5
C-18+HCX-3 (170720) 5.70 1.4
C-18+HCX-3 (170726) 4.11 1.0
6-5 串聯 HLB+MCX 管柱萃取步驟之 BMAA 損失情形
綜觀 6-3、6-4 節之回收率約為 23.6~59.6%，萃取成效未達理想，且發現去 離子水回收率較天然水低之情形，故針對添加 10ppb BMAA 的 20mL 去離子水 進行固相萃取，並分別收集過樣品步驟的最後 2 毫升、分別清洗 HLB/ MCX 管 柱的最初 2 毫升，以了解固相萃取時 BMAA 的潛在損失。
如圖 6-6 所示，於固相萃取各步驟中收集樣品，再直接以 LC/MS/MS 分析 後發現，在清洗 HLB 萃取管柱的出流水中可以偵測到 BMAA，表示清洗步驟 中有 BMAA 損失情形。
圖 6- 7. 串聯 HLB+MCX 管柱萃取步驟中 BMAA 之損失
6-6 清洗步驟對寶山原水的萃取效果
據 6-5 節所述，HLB 清洗步驟中 BMAA 損失之情形，所以改變分別清洗 HLB/ MCX 管柱為串聯之 HLB+MCX 管柱，期望以 MCX 管柱吸附 HLB 脫附 之 BMAA，減低清洗步驟中 BMAA 之損失；並比較分開脫附與串聯脫附之萃 取效果。
6-6-1 固相萃取步驟
1. 10 毫升甲醇、10 毫升 2%甲酸活化 MCX 管柱；10 毫升甲醇、10 毫升 LC water 活化 HLB 管柱
1. 10 毫升甲醇、10 毫升 2%甲酸活化 MCX 管柱；10 毫升甲醇、10 毫升 LC water 活化 HLB 管柱