3-1 BMAA 分析方法
本 研 究 使 用 液 相 層 析 串 聯 式 質 譜 儀 (Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)分析，高壓液相層析儀為 Agilent 公司所生產之 1260 Infinity Quaternary LC System，搭配串聯式質譜儀為 Thermo 公司生產之 TSQ Quantum Ultra，選用之層析管柱為 HILIC 管柱(Shiseido 公司，Capcell Core PC , S 2.7um, 4.6mm X 150 mm I.D.)，BMAA 標準品則由 Merck 公司購買。
本研究所採用的高壓液相層析質譜儀，配合著兩個高壓微量移動相幫浦，而 後接著串聯式質譜儀（Mass Spectrometry）；分析所用的溶劑移動相為 0.1% Formic acid 的水溶液與添加 0.1% Formic acid 的乙晴（Acetonitrile），混合之濃度梯度如 表 1 所示，分析管柱選用內徑2.7 μm (Capcell Core PC, Shiseido, Japan)，分析時 管 柱 溫 度 維 持 在 40℃ ， 設 濃 度 梯 度 進 行分 析 ， 選 擇 使 用 的 偵檢 器 為 ESI (Electrospray），監測模式為正電荷(Positive）模式，分析模式為 SRM，流速為 0.25 ml/min，注入樣本體積為20 μl，分析時間為 20 分鐘，高壓液相層析質譜儀之設 定分析參數與欲偵測 BMAA 之最佳特徵 m/z 值，整理如表 3-1, 3-2 所示。
研究中以標準品配製100 μg/L 的 BMAA 進行定性分析，以得知 BMAA 在 分析管柱中的停留時間，結果顯示 BMAA 的出峰時間為 10.53 分鐘，precursor ion m/z 為 119，product ions m/z 為 44.0 及 88.0，如圖 3-1 所示。另配製 BMAA 於一系列之稀釋濃度進行分析，配製濃度分別為 2、5、10、100、250、500 μg/L，
體積為 0.5mL，而後以 LC/MS/MS 以上述所設定之 SRM 模式進行定量分析，並 利用統計軟體進行迴歸分析，所獲得之檢量線如圖 2-2，R2值為 0.99976，顯示 分析結果良好。
表 3- 1. 移動相混合之濃度梯度表
A: 0.1% Formic acid water solution B: Acetonitrile with 0.1% Formic acid
表 3- 2. 質譜儀分析參數
Parameter MS/MS
Probe ESI
Model Positive
Spray Voltage (v) 3500 Vaporizer Temperature (℃) 270 Sheath Gas Pressure 40
Aux Gsa Pressure 10
Capillary Temperatuere (℃) 275
Tube Lens Offset 145
Collision Energy 119/44 12 Collision Energy 119/88 10
Time A(%) B(%)
0 15 85
0.5 15 85
1.5 70 30
9 70 30
11 15 85
20 15 85
0
0.97 2.56 4.14 5.55 9.03 9.15 11.71 15.37
10.53
10.73 13.59 14.68
3.78 4.94 17.23
2.56 15.42 18.81
1.89 8.84
0.64 6.42 8.32 9.52
10.53
16.02
0.41 3.12 3.50 4.86 5.83 6.70 9.52 10.17 11.11 11.64 13.93 18.34
NL: 1.03E6 TIC MS std100
NL: 7.10E5
m/z= 43.50-44.50 F: + p ESI SRM ms2 119.039 [43.995-44.005, 87.995-88.005] MS std100
NL: 3.22E5
m/z= 87.50-88.50 F: + p ESI SRM ms2 119.039 [43.995-44.005, 87.995-88.005] MS std100
3-2 BMAA 氧化動力模式介紹
本研究為探討氧化劑對於 BMAA 之破壞動力模式，首先模擬水中氧化劑濃 度之變化，假設氧化劑與水中物質反應，由兩項組成，如 3-1 式中所示。
𝐶𝐶𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 = 𝑎𝑎𝑒𝑒−𝑚𝑚𝑜𝑜+ 𝑏𝑏 Coxidant = a × e-mt + b (3- 1)
其中 Coxidant為氧化劑之濃度(mg/L)，a (mg/L)為參與反應部分、b (mg/L)為不參與
反應部分(或反應較慢部分)及 m (1/min)為反應指數，三者皆為模擬氧化劑濃度之 常數，t 則為反應時間(min)。
本研究假設 BMAA 被氧化劑的降解反應，可以用二階反應描述(分別對氧化 劑及 BMAA 濃度呈一階)，因此 BMAA 降解的速率與氧化劑接觸時間及劑量的 關係如式(3-3、3-4)所示，
𝑜𝑜𝑑𝑑
𝑜𝑜𝑜𝑜 = −𝑘𝑘𝐶𝐶𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝐶𝐶 (3- 2)
式中 C 為 BMAA 濃度，k (L/mg-min)為 BMAA 氧化動力常數，將(3- 1)式對 t 積 分，可以求得式(3-3)，
ln �𝑑𝑑𝑑𝑑
𝑜𝑜� = −𝑘𝑘 ∫ 𝐶𝐶𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑑𝑑𝑑𝑑 (3- 3)
其中 Co為 BMAA 初始濃度，氧化劑對時間的積分值，為常用於自水消毒的氧化
劑－時間乘積值(Ct 值)，可以如(3-4)式所示。
C𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜t = ma (e−mt− 1) + bt (3- 4)
整合式(3-3)及(3-4)，BMAA 濃度變化與 Ct 的關係如式(3-5)所示，
ln C
C0 = −kC𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜t (3- 5)
上述式(3-5)，即可以應用於與實驗數據擬合，以求出求出反應速率常數(k 值)。
3-3 BMAA 競爭實驗介紹
在本研究各氧化劑的氧化實驗中，因為氯和臭氧與 BMAA 的反應速率太大，
以致於無法以直接計算 CT 值的方式求得其二階反應速率。參考 Shan 等人(2006) 的研究，可以使用同樣反應速率也相當大的另一化合物做為競爭劑，以競爭實驗 之方式求得氯與臭氧對 BMAA 之反應速率。在競爭實驗中，假定競爭劑與 BMAA 與氧化劑皆為二階反應，即遵守上述 3- 5 之公式：
ln (
𝑑𝑑
𝑐𝑐𝑜𝑜𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑜𝑜𝑐𝑐𝑑𝑑
𝑐𝑐𝑜𝑜𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑜𝑜𝑐𝑐0) = −𝑘𝑘𝑐𝑐′ [Oxidant]𝑑𝑑ln (
𝑑𝑑
𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝑑𝑑
𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵0) = −𝑘𝑘𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵′ [Oxidant]𝑑𝑑若競爭劑與 BMAA 在同一系統中初始莫耳濃度相同，則兩式合併後可改寫為為 3-6 式，並求出 BMAA 之反應動力常數
ln �
[competitor]0𝑐𝑐[competitor]𝑐𝑐
� =
𝑘𝑘𝑎𝑎𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑜𝑜𝑚𝑚𝑐𝑐𝑐𝑐𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑐𝑐𝑘𝑘𝑎𝑎𝑐𝑐𝑐𝑐𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵
× ln �
[BMAA][BMAA]0𝑐𝑐
�
(3-6)3-4 加氯氧化實驗及中間產物之分析
本實驗係以次氯酸鈉做為氧化劑，分為三部分進行實驗。第一部分為自由餘 氯與 BMAA 之競爭實驗，並使用 4,6 二氯間本二酚(4,6-dichlororesorcinol, DCR) 做為競爭劑。BMAA 與 DCR 之初始濃度皆為5μM，並分別加入 3.3, 5.9, 7.7, 9.3 and 13.5 μM 之次氯酸納於反應器中，並分析 BMAA 及 DCR 剩餘之濃度。DCR 於不同 pH 值下和氯的反應速率則參考 Rebenne 等人於 1996 年所發表之文獻，
並利用 3-6 式求得反應速率常數。
第二部份分別以濃度為 5mg/L 之 BMAA 與濃度為 0.1、0.2、0.5、0.8 及 1mg/L 之次氯酸鈉反應，採樣時間分別為 0、10、30、60、90、120、180、240、300、
360 分鐘，並於各時間點取出樣品後加入抗壞血酸 (Ascorbic acid)以終止氧化反 應。第三部分則固定次氯酸鈉之起始濃度為 5 mg/L，BMAA 濃度則為 0.5、0.8 及 1.25mg/L。氧化實驗的採樣時間分別為 0、10、20、40、60、90 及 120 分鐘，
加入抗壞血酸 (Ascorbic acid)以終止氧化反應。同時，進行殘餘氧化劑濃度之測 定、BMAA 濃度之分析。研究中餘氯以標準方法中之 DPD-FAS 法配合綜合水質 分析儀法(No. No.14828, Merck, Nova 60, US)分別量測自由餘氯與總氯之濃度。
BMAA 的分析採用 SRM 模式，其中 BMAA 的 precursor ion m/z 為 119，
product ions m/z 為 44.0 及 88.0，定量時所使用的母子離子對為 119.1>44.0 amu。
加氯反應的中間產物分析則使用 parent scan 模式，Q3MS 設定為 m/z 44 amu，
3-5 過錳酸鉀氧化實驗
本部分實驗分別以濃度為 3、4、5mg/L 之高錳酸鉀，氧化初始濃度皆為 0.5mg/L 之 BMAA，採樣時間為 0、5、10、30、60、90、120、180 分鐘，同樣加入抗壞 血酸做為中止劑停止氧化反應進行，並分析過錳酸鉀及 BMAA 之剩餘濃度。 為氫氧自由基之探針化合物(probe compound) (Kwon et al. 2014)，以量化推估氫 氧自由基的濃度，可以以公式 (3-7)表示：
(3-9)
本實驗以濃度為 10 及 60 mg/L 之過氧化氫，分別在 57.4 Wm-2的紫外光照 強度下與 0.2 及 0.5mg/L 之 BMAA，進行氧化反應。在游(2014)的研究結果中顯 示，過氧化氫與在紫外光照射下與藻體細胞反應，6 小時的反應過程中過氧化氫 濃度幾乎均維持不變。因此在本實驗 3 小時的反應過程中也將過氧化氫濃度視為 不變，能持續產生相同濃度之氫氧自由基。
3-9 DCR 與 4-CG 之分析
本研究使用高壓液相層析儀(Shimadzu-Diode-array-detector, Shimadzu Inc., Japan)進行 DCR 與 4-CG 之分析。分析管柱為 C18 ODS column (150 mm × 4.6 mm)， 流動相為水、甲醇及乙酸之混合溶液(45：54：1)，流速為 0.8 ml/min，分 析時間為 28 分鐘。UV detector (SPD-M10A, Shimadzu Shimadzu Inc.,日本)設定的 偵測波長為 295 及 280 nm。
3-10 BMAA 濃縮方式之探討
本研究中 BMAA 的濃縮方式分為固相萃取 (Solid phase extraction, SPE)方法 及吹氮濃縮方法。探討固相萃取對比不同 SPE 管柱對 BMAA 的吸附、脫附效率，
選擇適合分析水中溶解態 BMAA 的固相萃取前處理方法，以提高濃縮倍率，降 低於樣品中的偵測極限。同時測試吹氮濃縮對 BMAA 的濃縮效率，及樣品中基 質是否干擾後續於串連式質譜儀中的分析結果。
此部分的詳細實驗細節與結果，及後續於環境水樣中 BMAA 的檢測分析，
將於第 6 章台灣地區湖庫及飲用水藻類毒素β-甲氨基-L-丙氨酸之研究中詳加討
論。
t C C k
C
OH BMAA , OH BMAA0
ln BMAA =− • •