此部分之研究成果已發表於 Chen, Y. T., Chen, W. R., Liu, Z. Q., & Lin, T. F.
(2017). Reaction Pathways and Kinetics of a Cyanobacterial Neurotoxin β-N-Methylamino-L-Alanine (BMAA) during Chlorination. Environmental science &
technology, 51(3), 1303-1311.，詳細請見附件。以下為簡要說明。
4-1 BMAA 減少與結合餘氯生成
加氯氧化實驗過程中，兩組 BMAA 和氯初始濃度相同的實驗結果皆顯示在 加氯後的第一分鐘，總氯的濃度並沒有太大的改變，而自由餘氯則僅有初始劑量 的 50% (圖 4-1)，顯示在系統中有結合餘氯的生成，而同時間 BMAA 的濃度即 減少為原來的 15%。推測由於 BMAA 結構中有兩個氨基(圖 4-2)，氯原子可能與 氨基結合形成一氯胺、二氯胺分子或三氯胺分子。在此兩組實驗中，BMAA 減少 的莫耳濃度為 6.9 和 22.8 nM，而所觀察到相對應的結合餘氯莫耳濃度為 7.8 和 33.2 nM，而結合餘氯和含氯中間產物的比例為 1:1.23 (圖 4-3)，代表可能有 1-2 個氯原子與 BMAA 結合，與前述所推論之結果一致。而當將 BMAA 初始濃度固 定時，結合餘氯的濃度會隨著加入次氯酸鈉的濃度增加而增加，反之亦然 (圖 4-4)。
4-2 加氯反應中間產物檢測
本研究中利用質譜儀所產生之碎片離子的質譜圖比對來推測反應中所生成 之中間產物的結構。利用 Q3 Full scan 模式偵測到 BMAA 的離子碎片為 44.0 amu ([CH3-NH=CH2]+)，76.0 amu ([M+H-CH2=N-CH3]+) 及 88.0 amu ([M+H-CH3-NH2]+) (圖 4-5a)，與 Kruger 於 2010 年所研究之結果相符合(Krüger et al. 2010)。根據上 段所述結果，推測在加氯氧化過程中會有氯胺等中間產物的生成，根據其接上 1-3 個氯原子，其可能的分子量為 151-3(M+1-34)、187(M+68)或 191(M+102)，預測的 結構式則於圖 4-5b 及 4-5c 中顯示。將 Q3MS 設定為 m/z 44 amu，Q1MS 為 full scan 模式時，同樣也能得到含有 m/z 為 153 amu 及 187 amu 之圖譜，顯示的確有 m/z 為 153 amu 及 187 amu 的分子存在於系統中；再將 Q1MS 設定為 m/z 153 amu 及 m/z 187 amu，Q3MS full scan 模式，則可得到圖 4-5b 及 4-5c 的質譜圖，表示 為 M+34(a)、M+34(b)、 M+68(a)及 M+68(b)。 由圖 4-5b 及 4-5c 中可看出，m/z 為 153 amu 及 187 amu 的碎片離子質譜圖與 BMAA 之碎片離子質譜圖相似，可 推測這四個中間產物是由 BMAA 與氯作用後形成。利用 LC/MS/MS 層析圖於 SRM 模式下做進一步的確認，比對加氯氧化前(圖 6a)及加氯氧化五分鐘(圖 4-6b)後，可以看出分別代表四個中間產物的離子碎片 m/z 187>44 amu、187>78 amu、
153>44 amu 及 153>44 amu 的波峰出現，顯見這四個產物確實為加氯反應後所產 生。
由於目前尚無法獲取這四個中間產物的標準品用以定量，因此在本研究中採 用質譜圖中相對訊號強度的變化(A/Amax)來表示該中間產物的濃度變化。Amax代 表該中間產物在當次實驗中最大積分面積值，A 則為每個採樣時間點的面積值，
如此標準化後則可用於了解各中間產物於反應過程中的濃度變化趨勢。實驗結果 顯示，BMAA 與氯的作用相當迅速，在反應的第一分鐘內即被大量降解，並隨之 生成四種中間產物(圖 4-7)。而若尚有餘氯存在於系統中時，中間產物則會再次 與餘氯反應，濃度隨反應時間下降(圖 4-7a 及 4-7b)；相反地，若系統中的餘氯 已不足以繼續和 BMAA 或中間產物反應時，相較於 M+34(a)和 M+34(b)於反應 時間 6 小時內仍可以穩定的持續存在於系統中(圖 4-7c 及 4-7(d)，M+68(a) 和 M+68(b)則在生成後隨反應時間降解消失。此外，從圖中也可發現在各組實驗中，
四種中間產物於反應過程中的濃度變化趨勢在一氯胺及二氯胺之間相當一致。
4-3 BMAA 含氯中間產物之還原作用
在飲用水系統中，除氯(dechlorination)常被用作中止與氯化反應相關的程序，
為進一步探討 BMAA 與其含氯中間產物的特性，在本研究中也進行了加氯反應 後使用抗壞血酸除氯的實驗。由前置實驗結果得知，抗壞血酸並不會與 BMAA 反應。由前述 LC/MS/MS 層析圖結果已知，在加氯反應後，BMAA 的訊號強度 大幅下降，並出現 m/z 187>44 amu、187>78 amu、153>44 amu 及 153>44 amu 等 四個中間產物的離子碎片的波峰(圖 4-6b)，然而在加入抗壞血酸除氯後，這四個 中間產物的離子碎片的波峰隨即消失(圖 4-6c)，同時 BMAA 的濃度也比除氯前 增 加許 多(圖 4-8)。 文獻中曾指出抗壞血 酸能與血液透析液中 的氯胺反應 (Wiseman 1997, Botella et al. 1977)，加之以上觀察可推測，抗壞血酸會與含氯的 中間產物作用，並且將其還原成 BMAA。
4-4 BMAA 與氯作用之反應途徑
氯氣在水中根據 pH 值的不同會形成 HOCl 和 OCl-兩種型態(Lewis 1980)，
而本研究中的 pH 值介於 5.5-7.0 之間，因此主要為 HOCl 存在於系統中。綜合以 上結果，可以推測 BMAA 與 HOCl 作用會形成四種含氯的中間產物。雖然這四 種中間產物生成的時間幾乎相同，但也不排除先生成兩種含一個氯的中間產物 (M+34(a)和 M+34(b))後再繼續與 HOCl 反應生成(M+68(a) and M+68(b))的可能 性，而完整的反應途徑則描述於 Scheme 4-1 中。
4-5 BMAA 與氯反應動力模式
由上述各實驗結果可得知，BMAA 會先與氯反應作用後生成含氯的中間產 物，若此時系統中尚有自由餘氯存在，則會繼續和含氯的中間產物反應。本研究 為探討氯對於 BMAA 之破壞動力模式，參考 Daly et al. 及 Lin et al.研究中所提 出的公式(Daly et al. 2007, Lin et al. 2009)，首先模擬水中自由餘氯濃度之變化，
假設自由餘氯與系統中之 BMAA 或含氯中間產物反應，可由 3-1 式中所示。
CCl=CCl,1e-kClt+CCl,2 (3- 2)
其中 CCl為自由餘氯之濃度(mg/L)，CCl,1 (mg/L)為參與反應部分、CCl,2 (mg/L)為不 參與反應部分(或反應較慢部分)及 kCl (1/min)為反應指數，三者皆為模擬氧化劑 濃度之常數，t 則為反應時間(min)。
將上述公式對時間積分後，便可求得 Ct。本研究假設 BMAA 及含氯中間產 物被氧化劑的降解反應，可以用二階反應描述(分別對氧化劑及 BMAA 濃度呈一 階)， BMAA 濃度變化與 Ct 的關係如式(3-2)所示，
ln C
C0 = −kC𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜t (3- 2)
上述式(3-2)，即可以應用於與實驗數據擬合，以求出求出反應速率常數(k 值)。
由圖 4-7 中可看出，BMAA 與自由餘氯在一分鐘內即反應完畢。為求得 BMAA 與自由餘氯的反應速率常數(以 k1 表示)，本研究以初始濃度為 5 和 2.5 mg-L-1的氯與初始濃度為 1 和 0.5 mg-L-1的 BMAA 反應，然而其反應過於迅速，
在 10 秒鐘內即結束，因此後續以 4-6 DCR 做為競爭劑，由競爭實驗的方式求出 二階反應速率(圖 4-9)。結果顯示，在 pH=5.8 時的反應速率為 2.1×103M-1s-1，而 pH=7 時則為 5.0×104。
而即使在自由餘氯劑量已不足以繼續氧化 BMAA 或含氯中間產物的情況下，
含氯中間產物的濃度仍會隨著反應時間緩慢下降(圖 4-7c 和 4-7d)。此外，在加 入抗壞血酸還原反應的實驗中，被還原的 BMAA(Re-BMAA)濃度加上未反應的 BMAA，仍舊小於 BMAA 的初始濃度，而被還原的 BMAA 可視為由含氯中間產 物與抗壞血酸還原反應而成，可由此推測含氯中間產物可能不甚穩定，會有自體 降解(auto-decomposition)的現象。前人的研究報告中也曾指出一氯胺會自體降解 並提出其降解速率的公式(Ozekin et al. 1996, Jafvert and Valentine 1992, Vikesland et al. 2001)，本研究則採用擬一階反應來描述含氯中間產物的自體降解情形，其 公式如下，
𝑜𝑜𝑑𝑑𝑅𝑅𝑐𝑐−𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵
𝑜𝑜𝑜𝑜 = −𝑘𝑘2[𝐶𝐶𝑅𝑅𝑐𝑐−𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵] (3- 3) 其中以 k2 表示含氯中間產物的自體降解反應速率常數。由於 BMAA 與氯的反應 相當迅速，在 BMAA 劑量遠多於氯的實驗中於極短時間內便將自由餘氯耗盡，
且在反應五分鐘之後 BMAA 和自由餘氯的濃度即不再變動(圖 4-10)。假設剩餘 的自由餘氯劑量已不足以繼續反應(< 0.1 mg-L-1)，此後 Re-BMAA 的變化量則可 視為自體降解，並適用至 3-3 式以求得 k2。帶入三組不同濃度的實驗中進行模 擬，可得於 pH=5.5-5.8 時 k2 = 0.012 min-1 ；pH=7 時 k2 = 0.003 min-1， R2 = 0.897 和 0.814 (圖 4-11)。
而為求得自由餘氯與含氯中間產物之反應速率常數(k3)，此部分則以氯的初 始濃度遠大於 BMAA 進行實驗。由於 BMAA 同樣會在極短的時間內與自由餘氯 反應完畢，因此採用反應進行五分鐘後 Re-BMAA 的變化量即代表含氯中間產物 的變化量，同樣可利用 3-2 式求出反應速率常數，從圖 4-12 可看出 pH 值對於此 部分的反應速率常數並無顯著影響，k3=16.8 M-1s-1，且其擬合結果相當好(圖 5，
R2 =0.97)。
(a)
(b)
圖 4- 1. Changes of (a) total and free chlorine levels and (b) BMAA and combined chlorine concentrations with time. The reaction condition 1: [BMAA]0= [Cl2]0 =1 mg/L. The reaction condition 2: [BMAA]0=[Cl2]0 =3 mg/L. (The pH was set at
Total Chlorine (condition 1) Free Chlorine (condition 1) Total Chlorine (condition 2) Free Chlorine (condition 2)
C hl ori ne c onc ent ra ti on (m g/ L )
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
C ombi ne d C hl or in e ( nmol )
BMAA-Cl (nmol) y = 1.225x + 0.002 R2 = 0.841
圖 4- 2. Molecular structure and functional groups of BMAA
圖 4- 3. The relationship between combined chlorine and chlorinated BMAA intermediates (BMAA-Cl).
methylamino group alanine group
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
0 20 40 60 80 100 120 140
Combined chlorine (1 mg/L) Combine chlorined (0.8 mg/L) Combined chlorine (0.5 mg/L)
Com bi ne d Chl ori ne (m g/ L )
Time (min)
00.2 0.4 0.6 0.8 1
0 1 2 3 4 5
0 20 40 60 80 100 120 140
Combined chlorine (1 mg/L) Combined chlorine (0.5 mg/L) Combined chlorine (0.2 mg/L)
Free Chlorine (1 mg/L) Free Chlorine (0.5 mg/L) Free Chlorine (0.2 mg/L)
Com bi ne d C hl ori ne (m g/ L ) F re e C h lo rin e ( m g /L )
(a)
(b)
圖 4- 4. Changes of the combined and free chlorine concentrations for (a) initial BMAA concentration = 0.2, 0.5, and 1 mg-L-1 and chlorine dosage = 5 mg-L-1, and (b) chlorine dosages of 0.5, 0.8, 1 mg-L-1and BMAA concentration = 5 mg-L-1.
圖 4- 5. Spectrogram and proposed structures of BMAA and four intermediates,
(a) (b) (c)
圖 4- 6. LC/MS/MS chromatogram under SRM mode of (a) standard solutions of BMAA at 1 mg-L-1, (b) BMAA (1 mg-L-1) reacted with free chlorine (1 mg-L-1) for 5 mins, and (c) BMAA (1 mg-L-1) reacted with free chlorine (1 mg-L-1) for 5 mins and then dechlorinated with ascorbic acid.
0
Relative abundance of Intermediates (A/Amax) BMAA(mg/L)
Time(min)
Relative abundance of Intermediates (A/Amax) BMAA(mg/L)
Time(min)
Relative abundance of Intermediates (A/Amax) BMAA(mg/L)
Time(min)
(a) (b)
(c) (d)
圖 4- 7. Variations of relative abundances of BMAA and intermediates with time during chlorination. The A/Amax is the ratio of the MS integrated area of each intermediate (A) to the highest MS integrated area of the same intermediate (Amax). (a) BMAA = 1 mg/L, chlorine = 1 mg/L; (b) BMAA = 3 mg/L, chlorine = 3 mg/L; (c) BMAA = 2.5 mg/L,
Relative abundance of Intermediates (A/Amax) BMAA(mg/L)
Time(min)
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0 20 40 60 80 100 120
BMAA 1 mg/L (+ascorbic acid) BMAA 1 mg/L
BMAA 3 mg/L (+ascorbic acid) BMAA 3 mg/L
BM A A c o nc ent ra ti on (m g/ L )
Time (min)
圖 4- 8. Change of BMAA concentration with time under the conditions of with and without dechlorination using ascorbic acid, with the initial chlorine and BMAA concentrations both set at 1 and 3 mg/L, pH=7.0-7.3. Ascorbic acid was added immediately when the samples were taken. The ratios of ascorbic acid and free chlorine in two sets of experiment were 7:1 and 2.4:1. (The difference between solid symbol and open symbol is the Re-BMAA)
Scheme 4-1. Proposed reaction pathways for BMAA with free chlorine.
+HOCl +HOCl
CH3
NH HN OH O
Cl
CH3 N
Cl NH2 CH3 O
OH
CH3 N
Cl NH Cl
OH O CH3
NH N Cl Cl
OH O
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Ln (C T/C 0, DCR)
Ln (C
T/C
0, BMAA)
y=0.198X+0.007 R2=0.978 y=0.276X+0.006 R2=0.98
pH=5.8 pH=7.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 20 40 60 80 100 120 140
Total Cl2 (1 mg/L) Free Cl2 (1 mg/L) Total Cl2 (0.5 mg/L) Free Cl2 (0.5 mg/L)
C hl ori ne c onc ent ra ti on (m g/ L )
Time (min)
圖 4- 9. Competition reaction of BMAA/DCR. The initial BMAA and DCR
concentration were set at 10μM, and the dosages of chlorine were at 3.3, 5.9, 7.7, 9.3 and 13.5 μM at pH 5.8 and 7.0.
圖 4- 10. Changes of total and free chlorine levels with time, with the initial chlorine dosage at 0.5 and 5 mgL-1, and BMAA concentration set at 2.5 and 5 mgL-1.
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 L n ( C/ C
0,R ev e rse d B MA A)
Time (min)
y=-0.0121X-0.281 R2=0.897
y=-0.003X+0.09 R2=0.814 pH=5.5-5.8 pH=7.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 100 200 300 400 500 600
L n (C/ C
0, R eve rs ed BM A A )
CT C/C
o= e
-0.0142(CT), R
2= 0.965
pH=5.5-5.8 pH=7.0-7.3
圖 4- 11. The concentrations of chlorinated BMAA intermediates (Re-BMAA) and fit with auto-decomposition model. The initial BMAA concentration was set at 5 mg-L-1, and the dosages of chlorine were at 0.5, 0.8, and 1.25 mg-L-1.
圖 4- 12. The reaction rate between the chlorinated-intermediates and free chlorine.
The initial chlorine dosage was set at 5 mg/L, and the concentrations of BMAA were