5-1 各突變基因之建構與篩菌 各突變基因之建構與篩菌 各突變基因之建構與篩菌 各突變基因之建構與篩菌

5-1-1 質體

本研究採用由 Dr. Krebs 等人於 1993 年所建立的 Halobacterial 表現系統，此系統的 質體與宿主菌株分別為帶有原生種 bop 基因之 pMPK62 與 H. salinarum MPK40。在建立 具有突變基因之質體前，本研究先進行質體 pMPK62 的 BamHI 限制酶反應、bop 基因 定序與轉殖之確認工作。BamHI 為質體 pMPK54 與 pMPK62 的唯一限制酶切點，其中 質體 pMPK62 是於質體 pMPK54 中插入一段具有原生種 bop 基因之 1.6 kb BamHI-BamHI 片段而得，因此我們可以將兩質體分別進行 BamHI 限制酶反應，以比較 pMPK62 是否 具有此基因片段，其結果如 Fig. 5-1 之 Lane 3 與 Lane 4 所示，証實質體 pMPK62 確實 具有 bop 基因片段。隨即，經定序確認無誤後，將質體 pMPK62 轉殖至菌體 H. salinarum MPK40 中以表現原生種 BR 膜蛋白，並以核酸引子 Bop-Upper 與 Bop-Lower 再進行 PCR 反應確認，結果分別如 Fig. 5-2 與 Fig. 5-3 所示。轉殖後的菌株在經過長時間培養之 後，明顯發現到部份菌株外觀呈現紫色 (如 Fig. 5-2 中的箭頭所示)，挑取數顆菌株先進 行固態活化培養再進行 PCR 反應，可以確定其中有些菌株具有完整的 bop 基因片段 (即 具有 918 bp 片段)；而介於 200 ~ 300 bp (大約 250 bp) 的基因片段則為於 H. salinarum MPK40 菌體中原本已被部份切除之 bop 基因片段，兩片段差距大小約為 0.6 kb。

Fig. 5-1 質體 pMPK54、pMPK62 之 BamHI 限制酶反應結果。M：marker；1：原質體 pMPK54；2：原質體 pMPK62；3：經過 BamHI 酵素反應的 pMPK54；4：經過 BamHI 酵素反應的 pMPK62。

Fig. 5-2 質體 pMPK62 轉殖入 H. salinarum MPK40 後，經長時間培養之結果。箭頭：表 示外觀呈現紫色之菌落，可表現原生種 BR 蛋白質之菌株。

M 1 2 3 4

8.6 kb

1.6 kb bps

21226

5148

2027

1375

Fig. 5-3 以核酸引子 Bop-Upper 與 Bop-Lower 再進行 PCR 確認反應之結果。

5-1-2 D85N、

在本實驗中，主要先建立具單一突變點之質體，而後再建構出具有雙突變點之質 體。如第四章所述，本實驗主要利用突變成功率較高的 SOEing 定點突變方法來進行突 變質體之建構，其建構流程與原理如 Fig. 4-2 與 Fig. 4-3 所示，此突變方法包含了二階 段：(1)具相同突變點但大小不同的兩 DNA 片段之合成；(2)黏合與大量複製。首先依據 定序所獲得之 pMPK62 基因序列來設計出核酸引子 (包含：BamHI-upper、BamHI-lower 與帶有突變點之核酸引子)，以原生種質體 pMPK62 作為模版，分別將 BamHI-upper 和 帶有突變點之“下股”核酸引子，以及 BamHI-lower 和帶有突變點之“上股”核酸引子混合 並進行第一階段的 PCR 反應。隨後，將經過“純化”的兩組片段以等莫耳比例混合，再加 入 BamHI-upper 與 Bam HI-lower 之核酸引子進行第二階段 PCR 反應與大量複製生產，

即可得到約 1.6 kb 且帶有突變點的基因片段，其實驗結果分別如 Fig. 5-4、Fig. 5-5 與 Fig.

5-6 所示。而 D85N/D96N 雙突變點之建構，是以質體 pMPK54/D85N 取代質體 pMPK62 為模版，利用 D96N-upper 與 D96N-lower 為突變之核酸引子再進行突變，其實驗結果 Fig. 5-7 所示。

在 PCR 反應過程之中，主要進行了二項修正 (modification)：(1)將模版 DNA 的使 用量由 ng 降低至 pg，其目的是為了減降最終產物原質體的發生機會，但產量則相對地 減少許多；(2)使用具 proofreading 的 pfu 聚合酶酵素進行 PCR 反應，其目的是為了降低 聚合反應過程的“錯碼”產生，以獲得具有突變點之“正確”基因片段。在完成第二階 PCR 反應之後，先將產物進行一串連實驗步驟 (包含 BamHI 限制酶反應、甲基化反應與膠體 純化)，再進行重組黏合於質體 pMPK54 中。在黏合重組之前，本實驗仍採取二項措施 以提高轉殖率：(1)在質體 pMPK54 進行 BamHI 限制酶反應後，加入去磷化酵素，此步 驟之目的是為了減降質體自我黏合 (self-ligation) 發生的機會；(2)將約 1.6 kb、經 BamHI 限 制 酶 反 應 的 PCR 產 物 進 行 甲 基 化 工 作 ， 其 目 的 是 防 止 菌 體 內 的 核 酸 內 切 酶 (endonculease) 將質體分解，以提高轉殖率。最後，將重組完成之質體以電孔法轉殖至 E. coli DH5α。

由於 BamHI 為質體 pMPK54 的唯一切點，黏合完成的產物 (完整質體，大小為 10.2 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

bps

918 bp

約 250 bp

1000 900 500 400

kb) 其基因片段具有“正接”與“反接”兩種結果產生，因此在定序確認之前，必須先進行 篩菌工作，以獲得“正接”之質體。在實驗中，篩菌所使用核酸引子為 Bop-upper 與 SeqL1 之組合，所得 PCR 產物片段大小為 1412 bp。而篩菌之實驗結果分別如 Fig. 5-8、Fig. 5-9、

Fig. 5-10 與 Fig. 5-11 所示，僅只有“正接”質體之菌株可被篩選獲得。經基因定序之結果 發現到所有單一突變點之質體其序列正確無誤，僅有雙突變質體 pMPK54/D85N/D96N 具有額外的點突變發生，但其蛋白質序列並未受到影響 (即 A196：GCG → Ala196：

GCA)。最後，將菌株大量培養並抽取質體與保存，以進行下一個嗜鹽菌轉殖步驟。

Fig. 5-4 質體 pMPK54/D85N 之建構。。。。M：marker；1：核酸引子 D85N-lower 與核酸引 BamHI-upper 之第一次 PCR 產物；2：核酸引子 D85N-upper 與核酸引 BamHI-lower 之 第一次 PCR 產物；3：核酸引子 BamHI-lower 與核酸引 BamHI-upper 之第二次 PCR 產 物。

Fig. 5-5 質體 pMPK54/D96N 之建構。。。。M：marker；1：核酸引子 D85N-lower 與核酸引 BamHI-upper 之第一次 PCR 產物；2：核酸引子 D85N-upper 與核酸引 BamHI-lower 之 第一次 PCR 產物；3：核酸引子 BamHI-lower 與核酸引 BamHI-upper 之第二次 PCR 產 物。

M 1 2 3 bps

1000 900

500 400 2000 1500

971 bp 717 bp 1656 bp

M 1 2 3 bps

1000 900

500 400 2000 1500

944 bp 754 bp 1656 bp

Fig. 5-6 質體 pMPK54/G241C 之建構。。。。M：marker；1：核酸引子 G241C-lower 與核酸 引 BamHI-upper 之第一次 PCR 產物；2：核酸引子 G241C-upper 與核酸引 BamHI-lower 之第一次 PCR 產物；3：核酸引子 BamHI-lower 與核酸引 BamHI-upper 之第二次 PCR 產物

Fig. 5-7 質體 pMPK54/D85N /D96N 之建構。。。。M：marker；1：核酸引子 D96N-lower 與 核酸引 BamHI-upper 之第一次 PCR 產物；2：核酸引子 D96N-upper 與核酸引 BamHI-lower 之第一次 PCR 產物；3：核酸引子 BamHI-lower 與核酸引 BamHI-upper 之第二次 PCR 產物

M 1 2 3 bps

1000 900

500 400 2000 1500

1181 bp

507bp 1656 bp

M 1 2 3 bps

1000 900

500 400 2000 1500

971 bp 717 bp 1656 bp

Fig. 5-8 含有質體 pMPK54/D85N 大腸桿菌的篩菌結果

Fig. 5-9 含有質體 pMPK54/D96N 大腸桿菌的篩菌結果 1 2 3 4 5 6 7 M

1412 bp ^{1500 bp} _{1200 bp}

1412 bp

1500 bp 1200 bp

Fig. 5-10 含有質體 pMPK54/G241C 之大腸桿菌的篩菌結果

Fig. 5-11 含有質體 pMPK54/D85N/D96N 大腸桿菌的篩菌結果 1412 bp ^{1500 bp} _{1200 bp}

1500 bp

1200 bp 1412 bp