Abs
5-6-2-2 不同光源波長對生物晶片之光電流訊號之影響
不同光源波長對生物晶片之光電流訊號之影響不同光源波長對生物晶片之光電流訊號之影響 不同光源波長對生物晶片之光電流訊號之影響輻射，不需透過物質來傳遞，我們每天見到的太陽就是最明顯的例子，雖然地球和 太陽之間是一片真空，什麼都沒有，但是我們仍然能感受到太陽的光和熱，而一般所謂 的輻射線是指從物體放出來的電磁波。電磁波譜包含電磁輻射所有可能的波長。特定波 長λ 的電磁波的能量 E（在真空中）與頻率 ν 和光子速度 c 有關。這些物理量的關係 如下：λ=c/ν，且 E=hν，其中 c 是光速 (3×108 m/s)，h 是蒲朗克常數(6.626 × 10−34 J‧S)。 可見波長與頻率成反比，波長越大，頻率越小，反之，頻率越大，波長越小，其乘積是 一個常數即光速 c。電磁波譜頻率從低到高為無線電波、微波、紅外線、可見光、紫外 線、X 射線和伽馬射線，可見光只是電磁波譜中一個很小的部分。可見光(visible light) (Fig.
5-88)，是電磁波譜中人眼可以感知的部分，基本上，一般人的眼睛可以感知的電磁波的 波長在 400 到 700 奈米間，其主要天然光源是太陽。主要人工光源是白熾物體(如白熾 燈)。它們所發射的可見光譜是連續的。氣體放電管也發射可見光，其光譜是分立的。
常利用各種氣體放電管加上濾光片來作為單色光源。
Fig. 5-88 The spectra of light.
一般而言，文獻上大多採用黃光和綠光來驅動 PM 的質子泵，使之產生光電訊號。
我們更進一步的使用不同波長範圍之濾片，使氙燈的光線透過讓某範圍的光線而激發我 們的生物晶片。我們從長波長到短波長選用了紅色(622~780 nm)、黃色(577~597 nm)、
綠色(492~577 nm)、藍色(455~492 nm)等四種濾光片來進行光電實驗。
由 Fig. 5-89 的結果中，我們可以發現的在本實驗中，黃光(由功率計測量其能量約 為 2.3 W)和綠光(2.0 W)可以讓我們的樣品有比較高的光電流值。故我們選用最適當的綠 光當作我們激發光源，其結果與文獻 BR 需吸收綠光才可轉移到 M 態的現象吻合。但是 在乙醯化的樣品中，黃光的激發卻比綠光激發產生還要更高的光電流值。這可能是乙醯 化 PM 內部結構的 lysine 被取代之後，造成了質子泵的移動有些許的改變所導致的。而 紅光(2.0 W)和藍光(1.7 W)的光電訊號就明顯的會下降，其一可能是因為其波長離可以驅 動質子泵的波長有點遠，其二可能是經由濾光片到達樣品的能量被削減的因素所致。
5-6-2-3 添加
添加添加 NaN添加 3對於對於對於對於 D96N PM 晶片的光電響應之影響晶片的光電響應之影響晶片的光電響應之影響 晶片的光電響應之影響由文獻的結果，Fig. 5-90 可以知道當使用突變株 D96N PM 來測量光電流值時，會 有明顯的開燈訊號，但是卻不會有關燈的訊號(Koyama et al., 2000)，我們的實驗結果也 是如此(Fig. 5-91)。我們針對此點也做了進一步的實驗來探討。我們首先發現若在關燈 後隨即開燈的話，則 D96N PM 晶片之光電流訊號值會下降，這是因為質子泵來不及回 到原點。所以需要大約關燈後過 10 秒再進行開燈的動作，才會又可以達到較高的光電 流值。而且就用肉眼觀察的結果，若我們將 D96N PM 懸浮於 buffer 時，會明顯的發現 紫色起初有變透明的趨向，而需要再經過大約一天的懸浮後，才會慢慢的回復到原來的 顏色，可以推測是緩衝液導致了視黃醛的脫落(Fig. 5-92)。依照文獻建議(Koyama et al.,
2000)我們為了要可以得到關燈的訊號，所以添加了 NaN3，希望可以藉由 N3-來讓整個
光循環可以順利的完成。我們添加不同濃度的 NaN3分別於懸浮於去離子水和 buffer 內 之 D96N PM 中而後製備晶片，並測量其光電響應以期更深入研究其性質，同時也發現，
若加入 NaN3於懸浮於 buffer 的 D96N PM 溶液後，其外觀馬上又會再度的回到原本的紫 色(Fig. 5-93)。
red yellow green blue
0 n-PM chip prepared in D.I. water
Light socure Color
red yellow green blue
0 n-PM chip prepared in PB
Light socure Color
red yellow green blue
0 A-PM chip prepared in D.I. water
Light socure Color
red yellow green blue
0 A-PM chip prepared in PB
Light socure Color
Fig. 5-89 Effects of light color on the photocurrent densities of (A) native PM coated chip prepared with D.I. water as the suspension solution, (B) native PM coated chip prepared with buffer as the suspension solution, (C) Acetylated PM (A-PM) coated chip prepared with D.I.
water as the suspension solution, and (D) Acetylated PM (A-PM) coated chip prepared with buffer as the suspension solution. The values present the current density differences between the Xenon light-on and light-off signals. Ranges indicate the standard deviations of the results using at least five chips. Measuring electrolyte condition: 100 mM KCl (pH=8.5 without buffering).
Fig. 5-90 Response profiles at electrochemical cells for D96N mutant PM. (Koyama et al., 2000)
0 1 2 3 4 5 6 7 -40
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
Photocurrent (nA)
Time (s)
light-off light-off
light-on light-on
Fig. 5-91 The photocurrent profile for a D96N PM-coated chip. The chip was prepared with D.I. water as the suspension buffer. Measuring electrolyte condition: 100 mM KCl (pH=8.5 without buffering).
Fig. 5-92 The color became lighter after adding buffer in the D96N PM solution.
buffer buffer buffer
without NaN3 with NaN3
D96N in D.I. water D96N in buffer D96N in D.I. water D96N in buffer
Fig. 5-93 The color returned to its original color when adding NaN3 in the D96N solution which had been suspended in buffer.
從 Fig. 5-94 可以發現當 D96N PM 懸浮於去離子水中，在不添加 NaN3的情形下而 製備晶片的話，其光電流響應並沒有關燈的訊號出現，但是隨著添加 NaN3於製備懸浮 液中的濃度慢慢地增加，關燈的訊號會慢慢地增強，這應該是由於系統中開始出現離子 進而會開始增加關燈的訊號。而在 D96N PM 懸浮於 buffer 中的製備情形，則是要添加 10 mM 的 NaN3後其晶片才會有明顯(>50 nA)的關燈訊號出現(Fig. 5-95)。雖然說在這兩 種製備條件下，基本上均是在加入 10mM 的 NaN3後，可以讓此生物晶片產生較高的光 電流值，但是，其開燈和關燈的比例卻無法達到 1:1，這可能是因為所加入的 NaN3濃度 太低，以致於不夠造成在關燈時也可以得到跟開燈一樣的光電流值。接著將 NaN3濃度 增加後，發現在添加 50 mM 的 NaN3後，可以發現開燈和關燈的訊號值大致上相同了，
且其關燈訊號值也相對其他 NaN3的濃度有較高的光電流值(除了 10 mM 之外，雖然開 燈訊號會下降)。且若我們繼續添加 NaN3也會發現其整體光電流值會下降，這是因為有 過多的離子充斥其中，所以會降低光電流值。
NaN
30 1 2 4 5 8 10 20 50 100 200 500 suspending in D.I. water containing different concentration of NaN3. (A) Ip-p, (B) Ipeak-on, (C) Ipeak-off.
0 1 2 4 5 8 10 20 50 100 200 500
Photocurrent density (nA/cm2 )
I
peak-on
5-6-2-4 添加
添加添加 DTT 對於添加 對於對於 G241C 突變對於 突變突變 PM 晶片的光電響應之影響突變 晶片的光電響應之影響晶片的光電響應之影響 晶片的光電響應之影響由於突變株 G241C PM 是將 PM 膜 C 端末端的 Gly241 突變成帶有硫基的 Cys 殘基。又 因為此胺基酸是在膜外，所以很容易產生 C 端和 C 端之間的雙硫鍵鍵結，而使兩個 BR 分子會以相反的方向連接在一起，以至於可能會降低所測量到的光電流訊號。所以在使 用 G241C PM 時，需要加入還原劑來降低 G241C PM 聚集的現象。在此，我們利用加入 不同濃度的 DTT 於晶片製備的懸浮液其中，試圖找出最佳懸浮液的濃度，並且可以得 到較高的晶片光電流訊號。由結果可以看出來，在 G241C PM 懸浮於去離子水的時候，
DTT 的濃度在 1~5 mM 的時候其所製備晶片的光電流值皆差不多，而增加到 10 mM 之 後就會開始下降了。而在 G241C PM 懸浮於 buffer 的條件下，可以看出來當添加 1 mM 的 DTT 於其中後可以使所製備的晶片產生較高的光電流值。但是此次的實驗卻發現，
加入同濃度的 DTT 之後，G241C PM 若懸浮於去離子水中的光電值會和懸浮於 buffer 中的光電值差不多。尤其是沒有添加 DTT 的時候，G241C PM 懸浮於去離子水中的晶片 光電流值並沒有比懸浮於 buffer 中所得到的晶片光電流值還要低很多(Fig. 5-96、Fig.
5-97)，這和先前 n-PM 晶片的結果不同。
0 1 2 5 8 10 50
0 50 100 150 200 250 300
Photocurrent density (nA/cm2 )
DTT (mM)
I
p-pFig. 5-96 Photocurrent densities of various G241C-coated chips, which were prepared by suspending in D.I. water containing different concentrations of DTT.
0 1 2 5 8 10 50 0
50 100 150 200 250 300 350
Photocurrent density (nA/cm2 )
DTT (mM)
I
p-pFig. 5-97 Photocurrent densities of various G241C-coated chips, which were prepared by suspending in buffer containing different concentrations of DTT.
5-6-2-4 利用可變電阻量測晶片光電壓和光電流的變化關係
利用可變電阻量測晶片光電壓和光電流的變化關係利用可變電阻量測晶片光電壓和光電流的變化關係利用可變電阻量測晶片光電壓和光電流的變化關係最後，我們將所製備的 PM 生物晶片連接到一個 100 KΩ 的可變電阻，利用此線路 裝置來量測受到光線激發後所產生的光電壓和光電流，試圖找出本生物晶片的開路電壓 (open-circuit voltage，V2)、短路電流(short-circuit current，It)和光電池的 I-V 特殊曲線(Fig.
5-98)。由 Fig. 5-99 和 Fig. 5-100 可以看出此晶片在不同脈衝雷射能量激發下所得到的 I-V 特徵曲線。可以發現使用雷射能量為 10.5 mJ 時，在可變電阻調整為 0 的時候，其 輸出電壓值為 4.88 mV，輸出電流值為 170 nA(逼近短路電流，It)，不過由於 PM 本身有 內阻的關係，所以無法量到 R0 時的短路電流。而在可變電阻調整到最大值時，其輸 出電壓值為 8.08 mV(逼近開路電壓，V2)，輸出電流值為 27.2 nA。而當雷射能量為 36 mJ 時，在可變電阻調整為 0 的時候，其輸出電壓值為 5.28 mV，輸出電流值為 132 nA (It)；
而在可變電阻調整到最大值時，其輸出電壓值為 8.64 mV (V2)，輸出電流值為 24.0 nA。
此實驗只能在此能量條件下進行，因為過低能量時，會發生無法同時測量到光電流和光 電壓的現象，而較高的能量則會發生如前所述會破壞晶片內含的 PM 而導致無法量測到 完整的數據。
Fig. 5-98 The characteristic curve of the current and voltage for a photocell.
Fig. 5-99 The I-V curve of a native PM chip illuminated with a pulse laser at 10.5 mJ energy.
The chip was prepared by suspending 0.5 mg/mL PM in buffer and then drying, and the electrolyte was 100 mM KCl containing 10 mM buffer at pH=7.5.
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Fig. 5-100 The I-V curve of a native PM chip illuminated with a pulse laser at 36 mJ energy.
The chip was prepared by suspending 0.5 mg/mL PM in buffer and then drying, and the electrolyte was 100 mM KCl containing 10 mM buffer at pH=7.5.