如前所述，嗜鹽菌的轉殖主要是採用原生質體法，利用 PEG600作媒介，讓菌體藉
由吸收 PEG600的同時，將 DNA 物質攝取至菌體內。在嗜鹽菌的轉殖程序上，避免菌體 產生溶菌現象、PEG600濃度 (最後混合濃度為 30 % v/v) 與果糖的添加為影響轉殖效率 高低的關鍵因素之外；另一個關鍵因素為 PEG600的純度。一般市售的 PEG600本身含有 其他有機溶劑，這些有機溶劑會對菌體產生毒害作用並使菌體死亡，因此在配製
PEG-SPS 溶液時，所使用之 PEG600需先經過純化步驟。
在本文中的轉殖步驟採用 Dr. Krebs 所提供。轉殖完成之菌體於含 mevinolin 與果 糖之固態培基上的生長過程是相當費時，大約 7 天之後方可明顯觀察出菌落，但菌體外 觀仍然保持著原本橘紅色，無法直接辦認其是否含有質體與菌體表現膜蛋白。因此，必 需藉由 PCR 直接篩菌方式挑取獲得。在本實驗中，篩菌所使用核酸引子為 BamHI-upper 與 BamHI-lower 之組合，所得 PCR 產物片段大小為 1656 bp，其實驗結果分別如 Fig.
5-12、Fig. 5-13、Fig. 5-14 與 Fig. 5-15 所示，可以確定部分菌株帶有突變基因之質體，
最後將菌體直接挑取並活化於固態培養基上，或先進行小量液態培養再劃於固態培養基 上，以利日後突變菌株的保存與其突變膜蛋之純化。
Fig. 5-12 含有質體 pMPK54/D85N 之 H. salinarum MPK 40 的篩菌結果。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 bps
2000
1500 1656 bp
Fig. 5-13 含有質體 pMPK54/D96N 之 H. salinarum MPK 40 的篩菌結果。
Fig. 5-14 含有質體 pMPK54/G241C 之 H. salinarum MPK 40 的篩菌結果。
Fig. 5-15 含有質體 pMPK54/D85N/D96N 之 H. salinarum MPK 40 的篩菌結果。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 bps
2000
1500 1656 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 bps
2000
1500 1656 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 bps
2000 1500
1656 bp
5-3 嗜鹽菌之培養 嗜鹽菌之培養 嗜鹽菌之培養 嗜鹽菌之培養、 、 、 、PM 膜蛋白純化 膜蛋白純化 膜蛋白純化 膜蛋白純化、 、 、 、光譜分析與蛋白質電泳 光譜分析與蛋白質電泳 光譜分析與蛋白質電泳 光譜分析與蛋白質電泳
示，各突變種菌株的生長速率大致相同，僅有少許差異。但與野生株 H. salinarum MPK1 相比較，可明顯發現各突變種 BR 菌株生長之速率均低於野生株的生長速率，此代表可 能原因是各突變種 BR 菌株的生長速率受到 mevinolin 藥物的作用而被抑制住。另外，從菌株外觀之顏色變化可發現到各菌株在已經培養 48 小時後，封口斷氧才開始發生改 變，如 Fig. 5-18 所示，明顯地看到菌株各自由淡黃色逐漸轉成具有“特殊”顏色之外觀 (H.
salinarum MPK1 為深紫色；H. salinarum MPK40 為橘紅色；H. salinarum MPK40/pD85N 為淡咖啡色；H. salinarum MPK40/pD96N 為紫紅色；H. salinarum MPK40/pD85N/D96N 為淡墨綠色；H. salinarum MPK40/pG241C 為深紫色)。
在 PM 膜純化方面，由於 BR 膜蛋白僅存在於菌體的紫色細胞膜上，需要藉助果糖 梯度來分離純化。將菌體分別離心收集，經過一連串的透析、清洗與再懸浮等步驟之後，
再以 30 % ~ 50 % 之果糖梯度進行分離純化。實驗結果如 Fig. 5-19 所示，可以明顯地看 見顏色分層，最上層均為 RM 膜蛋白，而最下層則是實驗所需之膜白蛋。特別的是突變 膜 D85N/D96N 的分佈位置，與其他膜蛋白相互比較，可以明顯查覺到突變膜 D85N/D96N 分佈位置較高，且幾乎靠近 RM 膜的位置，此結果代表著突變可影響 PM 膜的分子密度，
地發現到位置略低，造成此原因可能是蛋白質電泳中的 SDS 無法將膜蛋白的結構完全 (M．cm)-1，此數值原本僅適用於 dBO/SDS (delipidated bactero-opsin in SDS)，需將原本 膜蛋白經過浸泡 SDS 與透析等程序後，方可獲得；然而 Krebs 等於於 1993 年曾引用此
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Absorpation value (Optical Density, OD)
Time (h) MPK1-OD560 nm
MPK1-OD660 nm MPK40-OD560 nm MPK40-OD660 nm
Fig. 5-16 H. salinarum MPK1 與 H. salinarum MPK40 生長曲線比較圖。箭頭：表示開始 封口斷氧時間。
H. salinarum MPK1 H. salinarum MPK40/pD85N H. salinarum MPK40/pD96N H. salinarum MPK40/pD85N/D96N H. salinarum MPK40/pG241C
Fig. 5-17 H. salinarum MPK1 與突變菌株 H. salinarum MPK40/pD85N、MPK40/pD96N、
MPK40/pD85N/D96N 與 MPK40/pG241C 之生長曲線比較圖。箭頭：表示開始封口斷氧 時間。
Fig. 5-18 H. salinarum MPK1、H. salinarum MPK40、與各突變重組菌株生長時之外觀變 化 。 (a) 野 生 株 H. salinarum MPK1 ； (b)H. salinarum MPK40 ； (c)H. salinarum MPK40/pD85N；(d)H. salinarum MPK40/pD96N；(e)H. salinarum MPK40/pD85N/ D96N；
(f) H. salinarum MPK40/pG241C。順序左→右：1~8 天。箭頭：表示開始封口斷氧時間 (第 二天，即已培養 48 小時)。
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Fig. 5-19 PM 膜與各突變膜之果糖梯度分離比較圖。(a)PM 膜；(b)突變膜 D85N；(c)突 變膜 D96N；(d)突變膜 D85N/D96N；(e)突變膜 G241C。
(a)
(b) (c)
(d) (e)
RM
PM
RM
RM
RM RM
D85N D96N
G241C
D85N/D96N
Fig. 5-20 各 PM 膜突變之蛋白質電泳。M：marker；1：native PM；：D85N；3：D96N；
4：G241C；5：D85N / D96N；6：G241C（不含β-mecraptoethanol)。
350 400 450 500 550 600 650
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
A b so rp ti o n
Wavelength (nm)
DA LA
Fig. 5-21 野生種 PM 膜之 Light Adapted (LA) 與 Dark Adapted (DA) 的紫外光-可見光 (UV/VIS) 吸收光譜比較圖 (CPM = 0.231 mg/mL)。
29 kDa
20.1 kDa
M 1 2 3 4 5 6
雙 硫 鍵 結 之 蛋白，約為 42 kDa
45 kDa
26 kDa
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
300 400 500 600 700
D85N D96N D85N/D96N G241C
Wavelength (nm)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
300 400 500 600 700
D85N D96N D85N/D96N G241C
Wavelength (nm)
Fig. 5-22 (a)各突變膜之 Light Adapted (LA) 的紫外光-可見光(UV/VIS) 吸收光譜比較 圖；(b)各突變膜之 Dark Adapted (DA) 的 UV/VIS 可見光吸收光譜比較圖 (CD85N = 1.55 mg/mL；CD96N = 2.25 mg/mL；CD85N/D96N = 2.77 mg/mL；CG241C = 1.32 mg/mL)。
(a)
(b)
A b o rp ti o n A b o rp ti o n
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
300 400 500 600 700
Wavelength (nm)
Fig. 5-23 野生種 PM 膜與突變膜 G241C 之 Light Adapted 的紫外光-可見光(UV/VIS) 吸 收光譜比較圖(CPM = 0.15 mg/mL；CG241C = 1.32 mg/mL)。
Table 5-1 野生種 PM 與各突變膜之最大吸收波長值 (λmax) 比較：
native PM D85N D96N D85N/D96N G241C 本實驗值 LA (nm) 568 596 549 584 568
DA(nm) 560 597 544 586 562
文獻值 LA (nm) 570a 615a 571a 575b --
DA (nm) 562a 617a 562a -- --
a：Krebs et al., 1993；b： Millerd et al., 1999
Table 5-2 野生種 PM 與各突變膜之膜塊濃度與膜塊總重比較 (550 mL 培養液)：
PM D85N D96N D85N/D96N G241C
OD280 nm 0.4147 0.0936 0.2544 0.1490 0.0924
Cconc.(mg/mL) 2.28 0.515 1.4 0.82 0.508
Vtotal (mL) 4 2 2 2 3
Wt (mg) 9.12 1.03 2.8 1.64 1.524
native PM
G241C