2 cBSA-vitamin D 3 complex 的合成

即和維生素 D3 結合而形成 cBSA-vitamin D3 complex。

第三節 抗原之確認

所合成之抗原須經確認後才能注射至動物體內，因此經由化學合 成後之 cBSA-vitamin D3 complex，利用 SDS-PAGE 以及 UV-可見光 分光光度計進行確認。

3-1 蛋 白 質 膠 體 電 泳 分 析 （ SDS-PAGE）

3-1-1 實驗材料

配置膠體的材料如表 3.1。分別為 Tris-HCl（Tris-hydroxymethyl methylammouium chioride）購自 Biochemical，30% acrylamide/Bis 購 自 Bio-Rad，Ammonium Persulfate（APS）購自 SIGMA，A-3678，

Sodium dodecyi sulfate（SDS）購自 M＆J scintek，TEMED 購自 platinum plus 及 bromophenol blue R250 購自 AMRESCO。

3-1-2 實驗方法

首先先將電泳玻片以 70% 乙醇洗淨擦乾，利用表 3.1 之配方將 separating gel 配置好後注入，厚度為 0.75 mm 之兩片電泳玻片 內，加入二次水或酒精將膠體壓平，約 10-15 分鐘待膠凝固後將水 層輕輕倒掉，加入已配置好的 stacking gel，迅速將梳子(comb) 插入尚未凝固的膠體中，待膠體凝固後才將梳子抽起，並用 running buffer 將每個孔洞沖洗乾淨，避免膠體的殘留。同時，處理蛋白質 的樣品，將蛋白質之標準品（protein marker）或欲分析之樣品分 別以 1:1 之比例和 sample buffer 混合後，在 98℃加熱 5 分鐘後，

迅速冷卻並進行離心。分析樣品配製的濃度為 BSA 15 mg/ml 稀釋 為 1/4000，cBSA 及 cBSA-vitamin D complex 分別注入 12 µl，將 running buffer 加滿內槽後加少許於外槽，將電壓設定於 80 伏特 進行 200 分鐘。

當電泳膠跑完後，將膠片小心的取下後至於染色劑 coomassile blue R250 中染色 30 分鐘後，將膠片取出後放入退染劑中進行退

表 3.1 製備 12% polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE 所需之材料。

12% polyacrylamide 5 ml（一片） 10 ml（二片）

H2O 1.675 ml 3.35

1.5 M Tris（pH=8.8） 1.25 ml 2.5 ml Bis/acrylamide 2.0 ml 4.0 ml

10 %APS 25 µl 50 µl

10 % SDS 25 µl 100 µl

TEMED 40 µl 10 µl

5% stacking gel 5 ml（一片） 10 ml（二片）

H2O 3.05 ml 6.1 ml

0.5 M Tris（pH=6.8） 1.25 ml 2.5 ml Bis/acrylamide 0.665 ml 1.33 ml

10 %APS 30 µl 60 µl

10 % SDS 50 µl 100 µl

TEMED 10 µl 20 µl

3-2 UV-分 光 光 度 計 3-2-1 實驗材料

Ultraviolet-visible spectrophotometry 購 自 HITACHI U-2001，BSA 標準品購自 Bio-Red，石英管，欲分析的樣品，包括:

BSA、cBSA、cBSA-vitamin D complex 以及 vitamin D 購自 Alexis Biochemicals。

3-2-2 實驗方法

將所合成之 cBSA 和維生素 D3 及反應形成 cBSA 和維生素 D3 複 合物（cBSA-vitamin D complex）。利用 UV-分光光度計，以不同化 合物其最大吸收峰會有所不同來確認。首先將機器暖機 30 分鐘後，

將裝有結合之緩衝溶液之石英管先進行空白試驗，並將儀器歸零 後，在測定每一個欲分析的樣品，每測量完一個樣品後需要以二次 水清洗石英管後，再測定下一個樣品。

第四節 抗體的製備及純化 4-1 實 驗 材 料

實驗用完全佐劑（complete Freund adjuvant, CFA）購自 GIBCOBRC 和不完全佐劑（incomplete Freund adjuvant, IFA）購自 SIGMA F5506，

另外進行親合性管柱所使用到的管柱有 protein A/G(Protein A/G Disposable Columns Sample Kit)購自 PIERCE，cBSA sepharose column 及 cOVA sephrose column 所 用 到 了 材 料 試 劑 包 括 ： CNBr

（ CNBr-activated sepharose TM 4B） 購 自 Amersham Pharmacia Biotech AB， (Hydrochloric Acid, HCl) 購自三德藥品，（SODIUM bicaronate, NaHCO3）， (Natriumchlorid, NaCl) 購 自 MERCK，

（ Tris-hydroxymethyl methylammouium chioride, Tris-HCl ） 購 自 Biochemical，（acetic acid, Acetate）購自 TEDIA ，（Potassium

phosphat,Monobasic , PBS）。

4-2 抗 體 產 生 之 實 驗 方 法

免疫的方法是根據 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)之規範，首次免疫反應其抗原須加入完全佐劑（complete Freund adjuvant, CFA），佐劑的加入後如何提升免疫反應能不清楚，

但有 2 種機制常被探討。佐劑可以保護快速崩解之抗原，另外也可以

4-3 多 株 抗 體 的 純 化

所收集之抗血清須進一步進行純化，實驗中所使用的之方法為親 合性管柱的層析方法，親合性管柱的層析方法是一種方便且專一純 化蛋白質的方法，利用製備固相的免疫支持物（spAg）這是一種可 和抗原成共價結合之惰性支持物。將免疫吸附物堆置於管柱中，並 使抗體混合物在生理條件下通過該管柱，抗原的抗體會流在管柱 內，而未結合的抗體及被洗去[54]。純化多株抗體之親合性管柱分 別為 protein A/G column：主要是去除血清中之 IgG 及 IgA，cBSA sephrose column：去 除 血 清 中 anti cBSA antibodies ， 最後一個 管 柱 為 cOVA sephrose column ： 可 以 結 合 住 anti -Vit D3 antibodies。 以 下 逐 一 介 紹 上 述 之 三 個 不 同 之 親 合 性 管 柱 。

4-3-1 protein A/G column

protein A/G column 之製備是購買商業套組，於實驗進行前先 將套組中之 Protein A/G Gel slurry 回溫至室溫，取出一乾淨 之管柱以二次水潤濕，再將墊片放入管柱中，加入二次水後，以 套組中的過濾管將墊片往下壓，此步驟之目的為潤濕墊片並趕走 氣泡，接著將套組中的 Protein A/G Gel slurry 搖晃均勻後倒 入管柱內約 5 ㏄，放入第二塊墊片後，於墊片上面加入二次水，

此步驟之目的為隔絕空氣，protein A/G column 便製作完成，將管 柱存放於 4℃的冰箱中靜置 30 分鐘。

4-3-2 cBSA sephrose column

將活化之 CNBr（CNBr-activated sepharose）緩慢加入裝有 1mM HCl 200 ml 燒杯中緩慢搖晃 15 分鐘，使活化之 CNBr 膨脹 後，填入管柱後，將管柱中之 HCl 要去除，以少量耦合之緩衝溶 液（coupling buffer）將剩餘 HCl 洗乾淨，耦合之緩衝溶液是一

清洗 3 次後，在加入 0.1 M Tris-HCl＋0.5 MNaCl20ml，pH8.0 清 洗 3 次，最後將管柱內充滿結合之緩衝溶液（binding buffer），製 備好的 cBSA sephrose column 於 4℃ 下儲存。

4-2-3 cOVA sepharose column

製備方法同 3-3-2 方法，其中不同的部分在 5ml 耦合之緩衝溶 液加入 20 mg cOVA 反應至隔夜其餘步驟均相同。

所收集之血清先通過 protein A/G column 中，收集其濾液，收集 的濾液進行冷凍乾燥將體積濃縮後，濃縮好的樣品加入結合之緩衝溶 液至 10 ml 後進行第二個管柱 cBSA sepharose column，將 10 ml 的收 集液重複 3 次通過此管柱，確保 anti-cBSA antibody 都結合在管柱 上，並收集濾液，並且以結合之緩衝溶液充分沖洗管柱。將所收集之 濾液再通過第三個管柱 cOVA sepharose column，重複 2 次每次所加 入 的 體 積 為 管 柱 的 高 度 ， 才 能 有 效 的 捉 住 anti-vitamin D antibodies，最後利用 1 倍 20 ml PBS 清洗管柱，重複兩次，將所結 合在管柱內的抗體洗提出來。收集濾液進行冷凍乾燥如流程圖 3.3。

serum

Protein A/G column（A）

Bound unbound

cBSA-sepharose column（B）

collected fraction (Ⅰ)

bound unbound

cOVA-vitamin D₃ sepharose column （C）

bound unbound

Anti-vitamin D₃ polyclonal antibodies (Ⅳ) collected fraction (Ⅲ) (Final product)

流程圖 3.3 多株抗體的純化過程。將所收集的血清經過 protein A/G