第四章 結果與討論
第二節 抗體的純化及確認
本實驗中所收集之抗血清是利用親合性管柱層析之方法進行純 化 。 分 別 經 過 3 種 不 同 管 柱 其 中 包 括 ： protein A/G column 、 cBSA-sepharose column 和cOVA vitamin D sepharose column後，
最後所收集到的血清為抗維生素D3之多株抗體，通過的第一個管柱可 以結合住IgG和IgA，所收集的血清再通過第二個管柱此管柱可以結合 anti-cBSA antibody，最後將血清通過第三個管柱此管柱可以結合 anti-vitamin D3 antibody，再利用1倍的PBS將抗體洗提下來後濃縮 成粉末及濃縮液，進一步進行點墨免疫分析法確認。
2-1 點 墨 免 疫 分 析 法 （ Dot immunobloting assay）
將所純化後的抗維生素 D3 之多株抗體經由點墨免疫分析法進行確 認，抗原（cBSA、cOVA 和 cBSA-viamin D complex）之原始濃度為 6 g/ml ， 在 分 別 序 列 稀 釋 後 成 1/2,1/4,1/8,1/16 等 濃 度 ， 另 外 cBSA-viamin D complex 序 列 稀 釋 成 1/300,1/600,1/1200,1/2400,1/4800,1/9600 等濃度下（圖 4.8），在 本 實 驗 設 計 中 把 cBSA-viamin D complex 以 進 行 序 列 稀 釋 成 為 1/2,1/4,1/8,1/16 等濃 度， 但沒有看到結果（ 圖 4.9）， 因此 將 cBSA-viamin D complex 進行 1/300,1/600,1/1200, 1/2400, 1/4800, 1/9600 等濃度進行序列稀釋[30]。呈色後所得的結果在 1/9600 濃度 下有看到反應（圖 4.10），因此利用第二次的抗血清再以同樣方法進 行實驗，結果在 1/600 看到呈色反應（圖 4.11）。此結果也可以說明 所純化出的抗體已去除 anti-cBSA antibody，此抗體在血清中佔很大 之比例，因此所純化出之抗體為為抗維生素 D3 之多株抗體。
圖 4.9 點墨免疫分析方法照相顯影結果圖。將抗 原 cBSA 、cOVA 和 cBSA-vitD complex 都進行 1/2 序列稀釋後，呈色反應後並沒有看到結果。
圖 4.8 點墨免疫分析方法設計圖。設計將抗原 cBSA 、cOVA 和 cBSA-vitD complex，以原始濃度 6 µg/ml 進行序列稀釋加在膜上，進行分析確認。
圖 4.10 點墨免疫分析方法照相顯影結果圖。結果顯示 在 cBSA-vitD complex 1/9600 的濃度下有呈色的情形。
圖 4.11 點墨免疫分析方法照相顯影結果圖。結果顯示 在 cBSA-vitD complex 1/600 的濃度下有呈色的情形。
圖 4.10 和 4.11 分別為兩次不同時間點所收集之抗血清，經由 純化後之多株抗體進行點墨免疫分析方法之照相顯影結果圖，圖 4.10 為濃度 6 µg/ml 之 cBSA-vitD complex 稀釋成 1/9600 的濃 度下與抗血清作用產生呈色的情形，圖 4.11 在 6 µg/mlcBSA-vitD complex 稀釋成 1/600 的濃度下有呈色的情形，發現不同之時間 點所純化出的多株抗體其效價也不相同，此結果可驗證多株抗體 之特性。另外推論於親合性管柱層析過程中，其中 IgG 、IgA 及 anti-cBSA antibody 已被去除，因為抗維生素 D3 之多株抗體中 如果還包含其它抗體，則在點墨免疫分析的結果圖中，cBSA 和
y = 0.0597Ln(x) + 0.9579
最後加入有酵素標示的二次抗體(anti-rabbit IgG peroxidase)均 勻混合後，再與其受質作用呈色反應後，測得之 OD 值整理於表 4.1，
y = -0.0169x + 1.3847
利用直接型及競爭型酵素免疫方法檢測維生素 D3 標準品與其多株 抗體之反應結果，並探討此二種方法之可行性及準確性。直接型酵素 免疫方法方面，其反應過程如圖 4.14，當維生素 D3 固著於 ELISA 平 盤上後，多株抗體會和抗原（維生素 D3）有專一性之結合，當兩者之 結合量越多時所測的之 OD 值其數值也越大。實驗結果顯示當抗維生素 D3 之多株抗體濃度越高時，所測得之 OD 值也越大(如圖 4.12)，推論 抗維生素 D3 之多株抗體濃度增高時，和維生素 D3 結合的量也增多。
競爭型酵素免疫方法方面，其反應過程如圖 4.15，當維生素 D3 濃度 越高時，其和多株抗體的結合數目相對增加，因此會剩餘較少之多株 抗體和平盤上之維生素 D3 結合，所測到之 OD 值會越低。圖 4.13 之實 驗結果也得到一致結果，顯示維生素 D3 之濃度和測到之 OD 值呈現負 相關。
根據以上結果發現利用直接型及競爭型酵素免疫方法檢測維生素 D3
圖 4.14 直接型 ELISA。將維生素 D3 固定於平盤表面，在加入不同濃度 之多株抗體後，和二級抗體混合均 勻後再加入受質進行呈色。
圖 4.15 競爭型 ELISA。將維生 素 D3 固定於平盤表面，將維生 素 D3 與其多株抗體預混後再加 入平盤內反應，之後和二級抗體 混合均勻再加入受質進行呈色。
第四節 利用表面膜漿共振技術檢測標準品維生素 D3 4-1 感 應 晶 片 之 製 備 ： 活 化 、 固 定 抗 體 與 去 活 化 過 程
感應晶片的製備，包括晶片表面的活化、鍵合物（ligand）的固 定與去活化反應（圖4.16）。
圖 4.16 CM5 感應晶片表面之活化、抗體之固定及感應晶片表面之去活 化。圖中標示 I 之階段為感應晶片表面之活化反應（activation）：利 用活化試劑 NHS（0.05 M）/EDC（0.2 M）（50：50 v/v）使感應晶片表 面上羰基的碳原子上產生親電子（electrophilic）的狀態(1)，而趨向 於親核（nucleophilic）之胺基反應形成醯胺鍵（amide bind）(2)。
圖 中 標 示 為 II 的 階 段 為進 行 感應晶片表面上鍵合物的固定反應
（immobilization）：本實驗中將抗維生素 D3 之多株抗體固定於晶片表 面，感應晶片上之官能基呈現活化狀態(1)，多株抗體中的親核之胺基 NH2會與感應晶片表面上已活化 methylcarboxyl 之官能基，缺電子的羰 基之碳原子（-C）產生共價鍵結。
III 的
階段為感應晶片之去活化（deactivation）：注入 0.1M ethanolamine hydrochloride 將感應晶 片上已被活化之官能基，但未鍵結上抗維生素 D3 之多株抗體之官能基 覆蓋，此一過程為感應晶片之去活化。
I階段
II階段 III階段
4-2 固定抗維生素D3之多株抗體及goat-anti rabbit Fc IgG antibody於CM5感應晶片
實驗之策略為(一) 將抗維生素D3之多株抗體固定於晶片上，分 析物為維生素D3，(二) 將goat-anti rabbit IgG antibody固定於 感應晶片上，注入抗維生素D3之多株抗體與goat-anti rabbit IgG antibody進行結合反應後，將系統設定在不清洗的模式下，不具專 一性之部分會慢慢解離，再注入標準品維生素D3與抗維生素D3之多 株抗體進行結合如（圖4.17）
圖4.17 固定不同鍵合物於CM5感應晶片。(一)為固定 抗維生素D3之多株抗體於感應晶片上，分析物是維生素 D3。(二)固定goat-anti rabbit IgG antibody於感應晶片 上後先注入抗維生素D3之多株抗體，再注入不同濃度之維 生素D3。
4-2-1 固定抗維生素D3之多株抗體於CM5感應晶片
根據圖4.15之感應晶片之活化、感應晶片之固定及表面之去活化 過程。本實驗設計之一是將抗維生素D3之多株抗體固定於CM5之感應 晶片表面（圖4.18）。固定抗體於感應晶片表面之感應分析圖中其中I 的階段為感應晶片的活化反應，II的階段為感應晶片表面多株抗體之 固定，III的階段為感應晶片表面的去活化反應。
圖4.18 固定抗體於感應晶片表面之感應分析圖。感應晶片之製備包 括：表面之活化（activation）、抗體之固定（immobilization）與表 面之去活化作用（deactivation）。感應分析圖之縱軸為RU （resonance unit）值，橫軸為時間（秒）。圖中標示為I的階段為感應晶片的活化反 應：取35 µl的NHS（0.05M）/EDC（0.2 M）（50：50 v/v）均勻混合後，
注入微射流檢測系統中。圖中標示II的階段為感應晶片表面多株抗體之 固定：在感應晶片活化後3分鐘內，將50 µl抗維生素D3之多株抗體(1.1 mg溶解於 1 ml 10 mM sodium acetate buffer，pH 4.5）注入微射流系統 中，以完成抗體之固定反應。圖中標示III的階段為感應晶片表面的去 活化反應：取55 µl， 0.1M 之ethanolamine hydrochloride注入微射 流系統以後，覆蓋住感應晶片上尚未與抗維生素D3之多株抗體鍵結之官 能基，藉以避免任何不當的吸附（non-specific binding）。當晶片表 面固定化完成後，觀察到RU值在固定反應之前後總共增加了393RU。
I
III
II
15000
0 500 1000 1500 2000 2500
Time s
Response
RU
4-2-2 固定goat-anti rabbit Fc IgG antibody於CM5感應晶片 實驗上另一設計是將感應晶片上固定上goat-anti rabbit Fc IgG
antibody，其活化、固定及去活化過程均和3-1相同。
圖4.19 固定抗體於感應晶片表面之感應分析圖。感應晶片之製備包 括：表面之活化（activation）、抗體之固定（immobilization）與表 面之去活化作用（deactivation）。感應分析圖之縱軸為RU （resonance unit）值，橫軸為時間（秒）。圖中標示為I的階段為感應晶片的活化反 應：取35 µl的NHS（0.05M）/EDC（0.2 M）（50：50 v/v）均勻混合後，
注 入 微 射 流 系 統 中 。 圖 中 標 示 II 的 階 段 為 感 應 晶 片 表 面 goat anti-rabbit Fc IgG antibody之固定：在感應晶片活化後3分鐘內，將 50 µlgoat anti-rabbit Fc IgG antibody (100 µg溶解於1 ml 10 mM sodium acetate buffer，pH 4.5）注入微射流系統中，完成抗體之固定反 應 。 III 的 階 段 為 感 應 晶 片 表 面 之 去 活 化 反 應 ： 取 55 µl 0.1M ethanolamine hydrochloride注入微射流系統中以後，覆蓋住感應晶片 上尚未與coat anti-rabbit Fc IgG antibody結合，藉以避免任何不當 的吸附（non-specific binding）。當晶片表面固定化完成後，觀察到
I
II
III
4-3 SPR方 法 標 準 曲 線 的 製 作
RU vitD on anti-vitD Ab CM5 chip
6.45 µM
經由 BIAcore X 儀器檢測後，所得到之感應圖後，分析數據將結 果整理於表 4.3。再利用 Excel 軟體繪製成圖（圖 4.21）。
表 4.3 標準品維生素 D3 和抗維生素 D3 之多株抗體以 BIAcore X 儀器檢測之結果
a維生素 D 之起始濃度為 9.675 µM
b表示樣品注入完成後，微射流系統以高流速沖洗晶片表面後，不
具專一性的部分會被洗去，所得之 RU 是具專一性和固定之鍵合物 結合之物質，△RU 則是最後清洗完之 RU 和注射前之 RU 差異
利用表面膜漿共振技術（Surface Plasmon Resonance, SPR) 檢測固定於感應晶片上之抗維生素 D3 之多株抗體和維生素 D3 標準 品之間交互作用，其感應分析圖如圖 4.20，觀察發現當維生素 D3 濃度越高時，其因為質量濃度變化所反應出的 RU 值也相對的提高，
當樣品（維生素 D3）注射完之後，系統將以緩衝液高流速沖洗感應 晶片表面，此時不具專一性的部分會被洗去，而感應晶片所固定之 抗維生素 D3 之多株抗體和維生素 D3 具專一性結合部分所呈現之 RU 值即為△RU，如圖 4.20 A 部分。
標準品維生素 D 濃度(µM)a △RUb
0.75 8.5
1.125 7
1.5 12.2
2.35 12.4
3.2 16.8
4.23 18.9
6.45 34.6
9.675 44.7
y = 4.3081x + 3.6198
vitD conc (µM)
△RU 程式為 y=4.3081x ＋ 3.6198，利用此方程式，日後可以進行市售 食品中維生素 D3 含量之檢測，
圖 4.21 SPR 分析不同濃度之維生素 D3 之曲線圖。序列稀釋原 始濃度 9.675 µM維生素 D3 後，進行檢測，將檢測後的△RU 值 和維生素 D3 的濃度以 Excel 軟體繪圖。
0
vitD on anti-NTX CM5 chip
s antibody 進行抗原及抗體的交互作用。實驗中發現雖當維生素 D3 濃度越高，測到之 RU 值也越高如（圖 4.22）。
經由 BIAcore X 儀器檢測後，所得到之感應圖後，分析數據將結
經由 BIAcore X 儀器檢測後，所得到之感應圖後，分析數據將結