第四章 結果與討論
流程圖 3. 3 多株抗體的純化過程
serum
Protein A/G column（A）
Bound unbound
cBSA-sepharose column（B）
collected fraction (Ⅰ)
bound unbound
cOVA-vitamin D3 sepharose column （C）
bound unbound
Anti-vitamin D3 polyclonal antibodies (Ⅳ) collected fraction (Ⅲ) (Final product)
流程圖 3.3 多株抗體的純化過程。將所收集的血清經過 protein A/G column（A）後收集其濾液，進行冷凍乾燥後，再通過 cBSA-sepharose column（B），收集其濾液，最後通過 cOVA-vitamin D3 sepharose column
（C）， 所結合到管柱上的抗體在利用 1 倍 PBS 洗提下來即為抗維生 素 D3 之多株抗體。
collected fraction (Ⅱ)
第五節 多株抗體的確認 immunosorbent assays, ELISA）。優點是利用會產生顏色的受質其顏 色的改變可以容易去定量酵素的反應。而最近ELISA的修飾中包括使 用不同吸附的材料和方法來測定酵素反應，這種修飾法稱為點墨免 疫分析法（Dot immunobinding assay）或是 Dot blot assay。這 種分析是利用蛋白質吸附在膜上，且用呈色來定量，這種反應可在
TTBS：（20 mM Tris-500 mM NaCl 0.05﹪Tween 20）
blocking solution （3﹪gelatin in TBS）
Antibody Buffer（1﹪gelatin in TTBS）
First-antibody（ 100 ml antibody buffer 1~ 10 µg / ml）
Second-antibody（1：2000 anti-rabbit peroxidase）
DAB（10 mg /15 ml TBS）
filter paper（Bio-Rad）
NC － membrane （ nitrocellulose membrane using hydridot
5-1-2 實驗方法
配置不同之抗原濃度包括 cBSA、cOVA 和 cBSA-Vit D 或 cOVA – Vit D complex 原始濃度為 6μg/ml，首先將 cBSA、cOVA 進行 2 倍之序列稀釋濃度分別為（6、3、1.5、0.75、0.375、0.187、
0.093、0 μg/ml），cBSA-Vit D 或 cOVA – Vit D complex 序列稀 釋的濃度為（1/300、1/600、1/1200、1/2400、1/4800、1/9600、
1/19200）， 先將 2 張過濾紙和 NC membrane 以 TBS 潤濕約 3 分鐘，於平盤上放入 2 層之過濾紙最後一層加上 NC membrane，
再利用 200 µlTBS 再次潤濕，以真空抽氣除去 TBS，於每個 well 加入 300 µl 抗原 cBSA 、cOVA 和 cBSA-Vit D complex 進行緩 慢抽真空至液面乾掉即可，再以 TBS buffer 清洗每個 well，清洗 完後將 TBS 除去，取出 membrance 放入 blocking solution 緩慢搖 動 30~60 分鐘，取出 membrance 後，以 TTBS 清洗 5 分鐘 2 次 後再將 membrance 放入 first antibody solution 反應至隔夜，取出 以 TTBS 清洗 5 分鐘 2 次，去除未結合的一級抗體，再放入有二 級抗體之緩衝液中反應至隔夜，TTBS 清洗 5 分鐘 2 次後，以 TBS 洗去 membrance 上的 Tween-20，最後加入呈色劑 DAB 反應至隔 夜，觀察其呈色結果。
第六節 利用 ELISA 來檢測多株抗體和維生素 D3
實驗所使用之直接型及競爭型 ELISA 免疫分析方法，為偵測抗體與 抗原反應的一種方法，將具特異性之抗原（維生素 D3）固定在固相支持 物上，加入抗體（抗維生素 D3 多株抗體）後，再利用具有酵素標示的 二級抗體會和受質作用後呈色（圖 3.2）。此分析方法之優點為所使用具 酵素標示之二級抗體，可偵測多種不同的抗體[55]。
圖 3.2 ELISA 檢測維生素 D3 與其多株抗體間作 用。將維生素 D3 固定於支持物表面，加入已預 混之維生素 D3 與其多株抗體後，再加入具有酵 素標示之二級抗體使其呈色後，在 450 nm 波長 下觀察其結果。
6-1 實 驗 儀 器
ELISA reader（MR 7000 ＆Dynex MRX）購自 Dynatech, USA.
6-2 實 驗 材 料
抗維生素 D3 之多株抗體，Vit D3 購自 Alexis Biochemicals，
blocking solution （3﹪ gelatin in TBS），TTBS（20 mM Tris-500mM NaCl 0.05 ﹪Tween 20），ammonium bicarbonate buffer 和 anti-rabbit IgG peroxidase conjugate 皆購自 SIGMA，另外 osteomark ELISA kit 之套組中，chromogen reagent 及 stopping reagent 購自 Ostex International, Inc., Seattle。
6-3 實 驗 方 法
加入 100 µl 之維生素 D3 至有 96 孔洞的孔盤中，於室溫下反 應至隔夜後，在每個孔洞內加入 250 µl blocking solution，室 溫下反應 2 個小時，將孔盤內未接上維生素 D3 的位置覆蓋住，將 預先混合好的 100 µl 維生素 D3 和 100 µl 抗維生素 D3 抗體加入 well 反應 90 分鐘，以 330 µl ammonium bicarbonate buffer 清 洗 5 次後，加入 10 µl anti-rabbit IgG peroxidase conjugate 於室溫下 反應 90 分鐘後再以 ammonium bicarbonate buffer 清洗 5 次，加 入 200 µl 呈色物質 chromogen reagent 後會成淺藍色後，以 stopping reagent 混合後，靜置 5 分鐘後呈黃色，再以 ELISA reader 設定於 450 nm 進行讀數。
第七節 利用 SPR 技術定量食品中維生素 D3
感應晶片在固定鍵合物之前，須將感應晶片表面的 carboxymethyl dextran 活化，本實驗所固定的鍵合物為抗維生素 D3 之多株抗體及 goat-anti rabbit Fc IgG antibody，分析物為維生素 D3，利用分析 物和鍵合物之間之交互作用來建立一標準曲線。
7-1 實 驗 儀 器
BIAcore 購自 biacore AB, Pharmacia Inc., Sweden 7-2 實 驗 材 料
感應晶片 CM5, HBS buffer(0.01 M HEPES,0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% polysorbate 20(v/v pH 7.4,)，以及 amine coupling kit：
NHS(N-hydroxysuccinimide)，EDC
(1-Ethyl-3-(3-DIMETHYLAMINO-PROPYL)CARBODIIMIDE 及
Ethanolamine hydrochloride pH 8.5 皆購自 biacore AB, Pharmacia Inc., Sweden.
7-3 實 驗 方 法
7-3-1 感應晶片之製備
（a）感應晶片的活化
所使用之感應晶片為 CM5，在進行晶片的活化之前，必須讓 應晶片有一段時間穩定，其 RU 的變化穩定下才能進行活化，
再利用電腦軟體系統選擇 amine coupling 的模式下進行生物 感應晶片之活化，以 HBS buffer 通過微射流系統之流速為 5 µl/min，注入 35 µlNHS 0.05M/ EDC 0.2M（50：50, v/v），進 行感應晶片表面 carboxylmethylated dextran 之活化。
（b）感應晶片表面鍵合物之固定
取 70 µl 抗維生素 D3 之多株抗體（注入之體積設定於 50 µl）溶於 10 mM sodium acetate buffer，pH 4.5 後，在晶片活 化後 3 分鐘內注入至微射流系統後（圖 3.3）， RU 值會有明 顯的上升情形。
（c）感應晶片之去活化
取 55µl（注入之體積設定於 35 µl） 0.1 M Ethanolamine hydrochloride 注入微射流系統中，將感應晶片中未和抗體
（anti-vitamin D3 polyclonal antibodies 和 goat anti-rabbit Fc IgG）結合之 COOH 官能基覆蓋住，約需經歷 7 分鐘，待整 個流程結束後，即完成了晶片的活化、固定及去活化。此時 要讓晶片以 HBS buffer 通過微射流系統，使其 RU 值穩定，
將穩定後之 RU 值扣除未進行活化前之 RU 值。
圖 3.3 感應晶片 CM5 中鍵合物之固定。感應晶片活化後，
注入鍵合物（ligand），本實驗中之鍵合物為抗維生素 D3 之
7-3-2 檢測流程
（
1）儀器之設定在進行實驗之前一天須先以固定有 anti-vitamin D3 polyclonal antibodies 或 coat-anti-rabbit Fc IgG 晶片放入儀器中，以 HBS buffer 通過微射流系統中 且 溫 度 在 25℃ 下 至 隔 夜 ，流 速 設 定 在 1 進行序列稀釋分別為 6.4、54.2、33.2、2.35、1.5、1.125 µM 後注 入以固定有 anti-vitamin D3 polyclonal antibodies 的感應晶片上，每 一個樣品以注入之體積為 70 µl（設定於 50 µl），流速設定為 5 ng，此濃度為 stock solution 其餘樣品進行序列稀釋。
（4）萃取市售牛奶中維生素
取 25g 牛奶中置於 250 ml 燒杯中，在加入 50 ml ethanolic pyrogallol solution 及 15 ml KOH solution 緩慢搖動混合至隔夜此 步驟為皂化，皂化完成後之產物移至 500 ml 分液漏斗，再加入 40 ml 二次水、20 ml 乙醇及 50 ml hexane 將殘留於燒杯中的物 質萃取乾淨，在利用 50 ml hexane 移除水層重複 3 次，收集 3 次 的萃取物並利用 60 ml ethanolic pyrogallol solution 清洗，
第四章 結果與討論
第一節抗原之確認
1-1 陽 離 子 化 反 應 之 確 認
根據Jean.et al. (1999) 研究中指出，作者之實驗設計為陽離子 化之BSA（cBSA）的產物以逆向電極10 % native PAGE來確認，電 泳之通電方向為正極至負極。作者以2 mg BSA和不同量之EDA，分 別是72 、48 、24 、12 和6 mg反應後，發現以48 mg EDA，往負 極移動的速率比其他濃度之EDA快，表示在這種濃度下陽離子化之 BSA（cBSA）可得較高的產率，而EDA的濃度越低時，陽離子化程 度會降低，相對的當高濃度EDA並不會增加陽離子化的反應。而EDC 的量（0.72到10 mg）對於陽離子化反應並沒有影響。因此根據以 上的實驗結果，本實驗設計以48 mg EDA來與BSA進行陽離子化的反 應。
陽 離 子 化 之 BSA 的 產 物 利 用 UV- 可 見 光 分 光 光 度 計及 12%
SDS-PAGE來進行確認。利用有機化學合成之cBSA以UV-可見光分光 光度計，不同化合物其最大吸收峰會有所不同來確認，首先，將BSA 在200-400 nm波長範圍內進行掃描，結果發現其最大吸收波長為238 nm如（圖4.1），在相同條件下將所合成之cBSA進行掃描cBSA的最 大吸收峰都是在238 nm（圖4.2）。
比較圖 4.1 及 4.2 的結果， BSA 與 cBSA 之光譜圖很類似，
均在 238 nm 偵測到最大吸光峰。推究其原因可能有二，第一、
因為 BSA 和 cBSA 之結構很相近，第二、此二者之差異性為電 荷之不同，而 UV-可見光分光光度計是利用物質分子或離子團 對紫外線及可見光的特定吸收光譜來分析的定性及定量方 法，因此無法分辨出因電荷不同所造成的差異性。
1-2 Vitamin D3 和 cBSA 的 鍵 合 反 應 之 確 認 1-2-1 UV-可見光分光光度計
確認 Vitamin D3 和 cBSA 的鍵合反應所形成之 cBSA-維生素 D3 鍵合物（cBSA-vitamin D complex），以 UV-可見光分光光度 計進行波長設定於 200-400 nm 範圍之分別掃描維生素 D3 之標 準品、cBSA、維生素 D3 和 cBSA 之混合物、以及合成之 cBSA-維生素 D3 鍵合物。首先針對cBSA-維生素 D3 之標準品，以 UV-可見 光分光光度計進行波長設定於 200-400 nm 範圍之掃描，結果發 現維生素 D3 之標準品其最大吸收波長在 265 nm（圖 4.3）
[5152]；維生素 D3 和 cBSA 之混合物經由 UV-可見光分光光度 計掃描，結果分別在 238 nm 和 265 nm 的波長發現 2 個吸收峰
（圖 4.4）。實驗中抗原 cBSA 和 vitamin D3 經反應形成 cBSA-圖 4.2 cBSA 之 UV 分光光譜cBSA-圖。在波長範圍
200-400nm 掃描 cBSA 樣品後，在 238 nm 偵測 到最大吸光峰。
右(與 vitamin D 最大吸收峰之波長相同)，但在這兩個波長下，
有不同吸收峰的形態，根據此結果推論 cBSA 已經和維生素 D 鍵 結（圖 4-5）。
圖 4.3 維生素 D3 之 UV 分光光譜圖。在 265 nm 偵測 到最大吸收峰
圖 4.4 cBSA 及 vitamin D 混合液之 UV 分光光譜圖。
分別在 238 nm 和 265nm 偵測到最大及較大吸收峰。
1-2-2 SDS-PAGE
取出 15 µl 蛋白質標準品、15 µl 濃度 0.15 mg/ml 與 15 µl 濃 度 0.075 mg/ml 之 BSA，15 µl 濃度 2.85g/ml 之 cBSA 進行 80 伏特 200 分鐘之電泳分析後進行照相顯影圖（圖 4.6）。Lane 1 是蛋白質標 準品其分子量由上至下分別是 97 kDa、66.2 kDa、45 kDa、31 kDa、
20.1 kDa 和 14.4 kDa，Lane 2 和 Lane 3 為不同濃度之 BSA 標準品，
Lane 4 為 cBSA，Lane 5 為 cBSA-vitamin D complex。
圖 4.6 12% SDS PAGE 照相顯影圖。Lane 1 為蛋白質之標準品，
Lane2 和 Lane3 均為 BSA，Lane4 為所合成之 cBSA，Lane5 為 cBSA 和維生素 D3 之複合物。
97 kDa 66.2kDa
45 kDa
31 kDa
20.1 kDa 14.4 kDa Lane 5 Lane 4 Lane 3 Lane 2 Lane 1
根據 SDS PAGE 照相顯影圖之 Lane 1 中分子量為 97 kDa、66.2kDa 之間的距離約為 8 mm， 換算 1mm 約為 3.875 kDa， 已知 Lane 2 及 Lane 3 之 BSA 分子量約為 66.2 kDa，推算出 Lane 4 中 cBSA 的分子 量約為 68.1 kDa，並推算出 Lane 5 cBSA-vitamin D complex 的分子 量約為 85.45 kDa。利用上述各個產物之分子量，可大約估計 BSA 的 COOH 官能基上接上 EDA 及維生素 D3 的數目，其計算方法如下：
1. EDA MW＝0.06 Da vitamin D MW=0.3847 Da 2. cBSA（BSA＋nEDA-nH2O）-vitamin D
（66.2 ＋ 0.06n-0.018n）＋（0.3847n）＝85.45 kDa n =45.4
BSA是一個由607個胺基酸所組成之蛋白質(圖4.7)，其序列上有96個 具有COOH官能基的胺基酸，可以被EDC所活化後接上一個分子量約為60 Da的EDA分子。而經由實驗結果顯示大約有45個COOH被活化且接上 EDA，相同地大約有45個維生素D3和cBSA結合而形成cBSA-vitamin D complex。
1 60 MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA FSQYLQQCPF
61 129 DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK VASLRETYGD MADCCEKQEP 130 180 ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY 190 240 ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA
250 300 RLSQKFPKAE FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE
310 360 CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL GSFLYEYSRR
370 420 HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK
430 480 LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL
490 540
第二節 抗體的純化及確認
本實驗中所收集之抗血清是利用親合性管柱層析之方法進行純 化 。 分 別 經 過 3 種 不 同 管 柱 其 中 包 括 ： protein A/G column 、
本實驗中所收集之抗血清是利用親合性管柱層析之方法進行純 化 。 分 別 經 過 3 種 不 同 管 柱 其 中 包 括 ： protein A/G column 、