第三章 材料與方法
第四節 抗體的製備及純化
實驗用完全佐劑（complete Freund adjuvant, CFA）購自 GIBCOBRC 和不完全佐劑（incomplete Freund adjuvant, IFA）購自 SIGMA F5506，
另外進行親合性管柱所使用到的管柱有 protein A/G(Protein A/G Disposable Columns Sample Kit)購自 PIERCE，cBSA sepharose column 及 cOVA sephrose column 所 用 到 了 材 料 試 劑 包 括 ： CNBr
（ CNBr-activated sepharose TM 4B） 購 自 Amersham Pharmacia Biotech AB， (Hydrochloric Acid, HCl) 購自三德藥品，（SODIUM bicaronate, NaHCO3）， (Natriumchlorid, NaCl) 購 自 MERCK，
（ Tris-hydroxymethyl methylammouium chioride, Tris-HCl ） 購 自 Biochemical，（acetic acid, Acetate）購自 TEDIA ，（Potassium
phosphat,Monobasic , PBS）。
4-2 抗 體 產 生 之 實 驗 方 法
免疫的方法是根據 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)之規範，首次免疫反應其抗原須加入完全佐劑（complete Freund adjuvant, CFA），佐劑的加入後如何提升免疫反應能不清楚，
但有 2 種機制常被探討。佐劑可以保護快速崩解之抗原，另外也可以
4-3 多 株 抗 體 的 純 化
所收集之抗血清須進一步進行純化，實驗中所使用的之方法為親 合性管柱的層析方法，親合性管柱的層析方法是一種方便且專一純 化蛋白質的方法，利用製備固相的免疫支持物（spAg）這是一種可 和抗原成共價結合之惰性支持物。將免疫吸附物堆置於管柱中，並 使抗體混合物在生理條件下通過該管柱，抗原的抗體會流在管柱 內，而未結合的抗體及被洗去[54]。純化多株抗體之親合性管柱分 別為 protein A/G column：主要是去除血清中之 IgG 及 IgA，cBSA sephrose column：去 除 血 清 中 anti cBSA antibodies ， 最後一個 管 柱 為 cOVA sephrose column ： 可 以 結 合 住 anti -Vit D3 antibodies。 以 下 逐 一 介 紹 上 述 之 三 個 不 同 之 親 合 性 管 柱 。
4-3-1 protein A/G column
protein A/G column 之製備是購買商業套組，於實驗進行前先 將套組中之 Protein A/G Gel slurry 回溫至室溫，取出一乾淨 之管柱以二次水潤濕，再將墊片放入管柱中，加入二次水後，以 套組中的過濾管將墊片往下壓，此步驟之目的為潤濕墊片並趕走 氣泡，接著將套組中的 Protein A/G Gel slurry 搖晃均勻後倒 入管柱內約 5 ㏄，放入第二塊墊片後，於墊片上面加入二次水，
此步驟之目的為隔絕空氣，protein A/G column 便製作完成，將管 柱存放於 4℃的冰箱中靜置 30 分鐘。
4-3-2 cBSA sephrose column
將活化之 CNBr（CNBr-activated sepharose）緩慢加入裝有 1mM HCl 200 ml 燒杯中緩慢搖晃 15 分鐘，使活化之 CNBr 膨脹 後，填入管柱後，將管柱中之 HCl 要去除，以少量耦合之緩衝溶 液（coupling buffer）將剩餘 HCl 洗乾淨，耦合之緩衝溶液是一
清洗 3 次後，在加入 0.1 M Tris-HCl＋0.5 MNaCl20ml，pH8.0 清 洗 3 次，最後將管柱內充滿結合之緩衝溶液（binding buffer），製 備好的 cBSA sephrose column 於 4℃ 下儲存。
4-2-3 cOVA sepharose column
製備方法同 3-3-2 方法，其中不同的部分在 5ml 耦合之緩衝溶 液加入 20 mg cOVA 反應至隔夜其餘步驟均相同。
所收集之血清先通過 protein A/G column 中，收集其濾液，收集 的濾液進行冷凍乾燥將體積濃縮後，濃縮好的樣品加入結合之緩衝溶 液至 10 ml 後進行第二個管柱 cBSA sepharose column，將 10 ml 的收 集液重複 3 次通過此管柱，確保 anti-cBSA antibody 都結合在管柱 上，並收集濾液，並且以結合之緩衝溶液充分沖洗管柱。將所收集之 濾液再通過第三個管柱 cOVA sepharose column，重複 2 次每次所加 入 的 體 積 為 管 柱 的 高 度 ， 才 能 有 效 的 捉 住 anti-vitamin D antibodies，最後利用 1 倍 20 ml PBS 清洗管柱，重複兩次，將所結 合在管柱內的抗體洗提出來。收集濾液進行冷凍乾燥如流程圖 3.3。
serum
Protein A/G column（A）
Bound unbound
cBSA-sepharose column（B）
collected fraction (Ⅰ)
bound unbound
cOVA-vitamin D3 sepharose column （C）
bound unbound
Anti-vitamin D3 polyclonal antibodies (Ⅳ) collected fraction (Ⅲ) (Final product)
流程圖 3.3 多株抗體的純化過程。將所收集的血清經過 protein A/G column（A）後收集其濾液，進行冷凍乾燥後，再通過 cBSA-sepharose column（B），收集其濾液，最後通過 cOVA-vitamin D3 sepharose column
（C）， 所結合到管柱上的抗體在利用 1 倍 PBS 洗提下來即為抗維生 素 D3 之多株抗體。
collected fraction (Ⅱ)
第五節 多株抗體的確認 immunosorbent assays, ELISA）。優點是利用會產生顏色的受質其顏 色的改變可以容易去定量酵素的反應。而最近ELISA的修飾中包括使 用不同吸附的材料和方法來測定酵素反應，這種修飾法稱為點墨免 疫分析法（Dot immunobinding assay）或是 Dot blot assay。這 種分析是利用蛋白質吸附在膜上，且用呈色來定量，這種反應可在
TTBS：（20 mM Tris-500 mM NaCl 0.05﹪Tween 20）
blocking solution （3﹪gelatin in TBS）
Antibody Buffer（1﹪gelatin in TTBS）
First-antibody（ 100 ml antibody buffer 1~ 10 µg / ml）
Second-antibody（1：2000 anti-rabbit peroxidase）
DAB（10 mg /15 ml TBS）
filter paper（Bio-Rad）
NC － membrane （ nitrocellulose membrane using hydridot
5-1-2 實驗方法
配置不同之抗原濃度包括 cBSA、cOVA 和 cBSA-Vit D 或 cOVA – Vit D complex 原始濃度為 6μg/ml，首先將 cBSA、cOVA 進行 2 倍之序列稀釋濃度分別為（6、3、1.5、0.75、0.375、0.187、
0.093、0 μg/ml），cBSA-Vit D 或 cOVA – Vit D complex 序列稀 釋的濃度為（1/300、1/600、1/1200、1/2400、1/4800、1/9600、
1/19200）， 先將 2 張過濾紙和 NC membrane 以 TBS 潤濕約 3 分鐘，於平盤上放入 2 層之過濾紙最後一層加上 NC membrane，
再利用 200 µlTBS 再次潤濕，以真空抽氣除去 TBS，於每個 well 加入 300 µl 抗原 cBSA 、cOVA 和 cBSA-Vit D complex 進行緩 慢抽真空至液面乾掉即可，再以 TBS buffer 清洗每個 well，清洗 完後將 TBS 除去，取出 membrance 放入 blocking solution 緩慢搖 動 30~60 分鐘，取出 membrance 後，以 TTBS 清洗 5 分鐘 2 次 後再將 membrance 放入 first antibody solution 反應至隔夜，取出 以 TTBS 清洗 5 分鐘 2 次，去除未結合的一級抗體，再放入有二 級抗體之緩衝液中反應至隔夜，TTBS 清洗 5 分鐘 2 次後，以 TBS 洗去 membrance 上的 Tween-20，最後加入呈色劑 DAB 反應至隔 夜，觀察其呈色結果。