第三章 結果
第七節 和厚朴酚合成純化物對 Mecp2 條件缺失母鼠腦中神經活性的影響
由於先前研究指出和厚朴酚合成純化物 (MH101)為一種 GABA 受體促效劑，所以 當給予抑制性神經元促效劑處理時神經活性可能會受到改變，所以本實驗使用了一個 神經活性的指標蛋白 cFos，此為一立即早期基因 (Qiu et al., 2014; Shin & Ikemoto, 2010)，來檢測 1 mg/kg 的 MH101 是否改變大腦的神經活性。在吻端區 [前囟門 (bregma) 1.18 mm]的切片中，同胎非條件缺失母鼠經過 MH101 處理後的扣帶皮質 (cingulate cortex, Cg)、初級運動皮質 (motor cortex1, M1)與梨狀皮質 (piriform cortex, PC)中可以看出表達 cFos 的神經細胞數目並無顯著的改變 (如圖十三A, A’, p
> 0.05)，但是內背側紋狀體 (dorsomedial striatum, dmST)中經由 MH101 處理後顯著 的增加 (如圖十三 A, A’, p < 0.01)，表示 dmST 的細胞經過 MH101 處理後受到了活化。
而 Mecp2 條件缺失的母鼠控制組與實驗組中所分析的吻端區之 Cg、M1 與 PC 中均無 顯著差異 (如圖十三B,B’, p > 0.05)，而 dmST 雖無統計上顯著差異，但仍有增加的趨 勢 (如圖十三B,B’, p > 0.05)。
而在尾端區 (Bregma 0.14 mm)的染色分析中，同胎非條件缺失母鼠經過 MH101 處理後之 Cg、PC 與 dmST 中可以看出表達 cFos 的神經細胞並無顯著的改變 (如圖 十四A, A’, p > 0.05)，但初級感覺皮質 (primary sensory cortex, S1)則顯著地較其控 制組鼠減少(如圖十四A, A’, p < 0.05)，而外背側紋狀體 (dorsolateral striatum, dlST) 則有較其控制組鼠增加的趨勢 (如圖十四A, A’, p > 0.05)。Mecp2 條件缺失的母鼠的 控制組與實驗組，在尾端區之 Cg、S1、PC、dmST 與 dlST 則皆無顯著差異 (如圖十 四B,B’, p > 0.05)。綜合以上結果，和厚朴酚合成純化物 (MH101)之處理對於同胎非 條件剔除小鼠的前端區內背側紋狀體與尾端區初級感覺皮質與外背側紋狀體有較顯著 的影響。
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圖十三、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 條件缺失母鼠前腦前端神經活性的影響。(A) 為同胎非條件缺失母鼠經由生理食鹽水處理後 cFos 之表現 (A’)為同胎非條件缺失母 鼠經由 1 mg/kg 和厚朴酚合成純化物(MH101)處理後 cFos 之表現 (B) 為 Mecp2 條件 缺失母鼠經由生理食鹽水處理後 cFos 之表現 (B’) 為 Mecp2 條件缺失母鼠經由 1 mg/kg MH101 處理後 cFos 之表現 (C)為扣帶腦迴(Cg) (D)為初級運動皮質(M1) (E)為 梨狀皮質(PC) (F)為紋狀體 (dmST) 之 cFos 之細胞計數分析圖表。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。統計分析係以單一腦區獨立分析 two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
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圖十四、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 條件缺失母鼠前腦後端神經活性的影響。(A) 為同胎非條件缺失母鼠經由生理食鹽水處理後 cFos 之表現; (A’)為同胎非條件缺失母 鼠經由 1 mg/kg MH101 處理後 cFos 之表現; (B)為 Mecp2 條件缺失母鼠經由生理食鹽 水處理後 cFos 之表現; (B’)為 Mecp2 條件缺失母鼠經由 1 mg/kg MH101 處理後 cFos 之表現 (C)為扣帶腦迴(Cg) (D)為初級感覺皮質(S1) (E)為梨狀皮質(PC) (F, G)為紋狀 體(dmST, dlST) 之 cFos 之細胞計數分析圖表。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。統計分 析係以單一腦區獨立分析 two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
41 受體為成癮機制相關分子(Trezza et al., 2011; Whistler et al., 1999)，所以藥物劑量必 須謹慎的選擇。
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圖十五、前端紋狀體內投予 μ 型類鴉片受體促效劑對於小鼠敞箱活動力之影響。
(A)為實驗流程示意圖。一個月大的野生型公鼠於前測後進行植入式給藥膠囊 (OSM) 手術，於前端紋狀體內投予 20ng 或 100 ng/ul μ 型類鴉片受體促效劑 (DAMGO)或生 理食鹽水 (Saline)連續 7 天，分析待測鼠在給藥期間第 1、3、6 天之敞箱活動力。(B) 待測鼠進行敞箱測試 30 分鐘之總移動距離。(C) 待測鼠於敞箱測試之平均速度。(D) 待 測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分 比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001,
repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
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圖十六、前端紋狀體內投予 μ 型類鴉片受體促效劑對於小鼠加速滾輪表現之影響。一 個月大的野生型公鼠於前測後進行植入式給藥膠囊 (OSM)手術，於前端紋狀體內投予 20ng 或 100 ng/ul μ 型類鴉片受體促效劑 (DAMGO)或生理食鹽水 (Saline)連續 7 天，
分析待測鼠在給藥期間第 1、3、6 天由加速滾輪掉落之延宕時間 (單位：秒)。 (A) 為 給藥前後，四個時間點之加速滾輪測試掉落延宕之秒數。 (B)藥物施打期間的體重改 變之曲線圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05; repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
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第九節 第二型多巴胺受體拮抗劑在前端紋狀體對於運動表現的影響
先前實驗室研究發現在瑞特氏症模式基因剔除小鼠的紋狀體中尚發現有另一分子 表現異常，即第二型多巴胺受體 (dopamine receptor D2, DRD2)表現量顯著的較野生 型小鼠來得高 (Kao et al., 2013)，因此推論若給予 DRD2 拮抗劑來減少此受體的神經 訊號傳遞，也許能夠改善其運動表現。在基底核 (Basal ganglia)中若是第二型多巴胺 受體受到活化即為活化間接路徑 (indirect pathway)，在先前研究指出此路徑為抑制動 作的產生 (Cazorla et al., 2014)，而 Mecp2 基因剔除小鼠的吻端紋狀體中發現第二型
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圖十七、前端紋狀體內投予第二型多巴胺受體拮抗劑對於小鼠敞箱活動力之影響。
(A) 為實驗流程示意圖。一個月大的野生型公鼠於前測後進行植入式給藥膠囊 (OSM) 手術，於前端紋狀體內投予 1 ng 或 10 ng/ul 第二型多巴胺受體抑制劑 (Raclopride) 或生理食鹽水 (Saline)連續 7 天，分析待測鼠在給藥期間第 1、3、6 天之敞箱活動力。
(B) 待測鼠進行敞箱測試 30 分鐘之總移動距離。(C) 待測鼠於敞箱測試之平均速度。
(D) 待測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時 間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05; **, p < 0.01, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
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圖十八、前端紋狀體內投予第二型多巴胺受體拮抗劑對於小鼠加速滾輪表現之影響。
一個月大的野生型公鼠於前測後進行植入式給藥膠囊 (OSM)手術，於前端紋狀體內投 予 1 ng 或 10 ng/ul 第二型多巴胺受體抑制劑 (Raclopride)或生理食鹽水 (Saline)連 續 7 天，分析待測鼠在給藥期間第 1、3、6 天由加速滾輪掉落之延宕時間(單位：秒)。
(A) 為給藥前後，四個時間點之加速滾輪測試掉落延宕之秒數。(B)藥物施打期間的體 重改變曲線圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。Repeated-measured two-way ANOVA。
A
B
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& Pozzo-Miller, 2012)。
第二節 厚朴生藥對不同瑞特氏症模式小鼠產生不同影響 2010)，則有可能因 Mecp2 點突變雄性小鼠的 MeCP2 蛋白尚有 40~50%左右的表 現量 (Chao & Zoghbi, 2012)，推測點突變的小鼠 GABA 生合成的缺失較為輕微，
所以對於額外補充 GABA 促效劑，可能過多的增加腦中的抑制性神經傳導素，導致
48 在大腦皮質中約有 15~25%的 GABA 神經元 (Gonchar & Burkhalter, 1997)，在中 腦的腹側被蓋區 (ventral tegmental area,VTA)也包含了 30%左右的 GABA 神經元 (van Zessen et al., 2012)，甚至在紋狀體中有 95%以上的 GABA 神經元(Dehorter et al., 2009; Durieux et al., 2011)，其分別投射到不盡相同的腦區，但是其中尤其以紋 狀體中所含 GABA 神經元為大宗，所以若是給予 GABA 促效劑表示其受到的影響最
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(Takemura et al., 2000)。
為了檢測神經細胞的活性是否有受到和厚朴酚合成純化物的影響我們使用一神 經活性的標記物 c-Fos 來檢測，先前文獻指出若是神經受到刺激或是活化時會表達 立即早期基因 (immediate early gene)c-Fos， 指出給予 GABA 抑制劑會增加 c-Fos 的表現量 (Shin & Ikemoto, 2010)，所以本實驗使用和厚朴酚合成純化物應該會抑 制其表現量，有趣的是，本實驗中的非條件缺失母鼠經由和厚朴酚合成純化物處理
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51 相關的運作分子以及造成體內荷爾蒙的改變(Ricardo Buenaventura, Rajive Adlaka,
& Nalini Sehgal, 2008)，為了避免μ 型類鴉片受體促效劑造成全身性的影響，本實 驗特別使用植入式給藥膠囊來達到區域性給藥之方式，這可以避免對於全身性的μ
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角色也各不相同，但若是只在吻端紋狀體中給予其拮抗劑，則能直接的抑制紋狀體 中的間接路徑，進而達到增加運動活力表現的結果。
第六節 瑞特氏症模式小鼠運動障礙之療癒
瑞特氏症模式小鼠具有與瑞特氏症病患相類似的病徵，例如：運動障礙、刻版 行為、心肺與腸道症狀等，其起因為 MeCP2 的缺失所造成的，而先前科學家們也 發展出許多不同種類的 Mecp2 基因突變小鼠來研究瑞特氏症，以不同區域的剔除
Mecp2 基因來檢測其表徵，讓大家更了解各個地方的 Mecp2 基因所產生的功用(Li &
Pozzo-Miller, 2012)，現今科學家們也逐一研究各種腦區恢復 Mecp2 基因是否真的 能夠改善其表徵，但基因操弄之技術對於應用於臨床方面的風險相當高，且較難實 際檢測是否真的有其效果。
對於現行的瑞特氏症病患的治療方式皆為物理治療搭配藥物治療，物理治療方 式輔助例如：以語言治療增進其交談能力或是職能治療方式減輕扭手的刻板行為，
而藥物治療部分常見的都是 GABA 促效劑也就是抗焦慮劑或是抗驚厥劑。但是在病 患身上皆只能得到減輕單一病症的效果很難看的出來顯著的差異，而瑞特氏症動物 模式之產生即能用來操弄各種不同方式的療癒方法。
第七節 本篇研究重要性
本研究展示不同種類的瑞特氏症模式小鼠展現對於厚朴生藥與和厚朴酚合成純 化物操弄後所產生的運動活力以及運動協調學習能力的影響，對於先前也研究 GABA 促效劑操弄卻未得到改善運動障礙的結果整合了了一個合理的解釋與原因，
此次研究在紋狀體剔除 Mecp2 的小鼠中發現給予厚朴生藥與和厚朴酚合成純化物 能夠改善其運動協調學習能力，這表示了紋狀體的 GABA 顯然對於運動協調學習能 力有很重要的影響，而這影響還是因為突觸後的 GABA 訊號傳遞不足所造成，未來
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可以針對紋狀體的不同區域給予 GABA 促效劑或拮抗劑的操弄來證明紋狀體的 GABA 對於運動協調學習能力的影響。
而且對於區域性藥物給予的方式也檢測在吻端紋狀體給予μ 型類鴉片受體促效 劑以及第二型多巴胺受體拮抗劑確實是有可能改善小鼠的運動活力，而高劑量的μ 型類鴉片受體促效劑與第二型多巴胺受體拮抗劑對於吻端紋狀體的影響可能會造成 抑制運動協調能力的表現，在劑量上的選擇給予了一個方向。
對於瑞特氏症模式小鼠的治療也給予了一個新的方向，此治療方式並非給予基因操 弄而是改善由 Mecp2 缺失所造成的分子改變，未來檢測其可能性也許能對於研究瑞 特氏症模式小鼠的療癒方式，以利研究更多瑞特氏症病患的治療方向之可能性。
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第五章 結論
本研究以不同類型的瑞特氏症模式小鼠進行藥物處理，來探討不同藥物對於運 動障礙的療效。結果發現，Mecp2 基因剔除公鼠在以管餵方式給予七天的厚朴生藥 後，可有效加快其在平衡桿上行走的速度並縮短到達標的的時間，而 Mecp2 條件缺 失公鼠在給予厚朴生藥後，由加速滾輪上掉落的延宕時間也有延長的趨勢。除此之
本研究以不同類型的瑞特氏症模式小鼠進行藥物處理，來探討不同藥物對於運 動障礙的療效。結果發現，Mecp2 基因剔除公鼠在以管餵方式給予七天的厚朴生藥 後，可有效加快其在平衡桿上行走的速度並縮短到達標的的時間，而 Mecp2 條件缺 失公鼠在給予厚朴生藥後，由加速滾輪上掉落的延宕時間也有延長的趨勢。除此之