期刊，但是當時並沒有引起醫學界的關注。直到 1983 年由瑞典醫師 Dr. Bengt Hagberg 也觀察到了 35 位擁有相同病徵的女性孩童案例，將這些案例以英文發表後 (Hagberg, 2002)，瑞特氏症才被醫學界注意，並且之後的科學家們便致力於尋找 RTT 的致病原 因。
瑞特氏症被歸類於一種神經發育疾病，好發於女性幼童，新生女嬰的發病機率大 約為一萬分之一 (Amir et al., 1999)。臨床上將此疾病的發病階段大致分為四個時期，
分別為發展遲緩期、快速退化期、穩定期、晚期運動障礙期 (Chahrour & Zoghbi, 2007)，
而病童在出生後的 6~18 個月左右仍有正常的發育，此時並非所有病童皆有病徵出現，
Zoghbi, 2007; Hagberg, 2002)。
二、 病源學
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瑞特氏症的病患主好發於女童，發生率為一萬分之一，且只有極少數的男童患病 後可以存活下來，所以早期對於瑞特氏症的研究推論為可能是 X 性染色體相關疾病。
在 1999 年，科學家運用基因篩選的方式發現了瑞特氏症病患的 X 染色體上的長臂上 的第 28 位置，第二型甲基化結合蛋白 (Methyl-CpG-binding protein 2,MECP2) 基因 發生突變 (Amir et al., 1999)。並且瑞特氏症的病患有 99%以上皆為偶發性的突變所以 很難利用關聯分析 (traditional linkage analysis)去找尋疾病基因，只能利用鮮少擁有 相似病徵的病患來篩選出發生突變的基因位點就是在 X 染色體長臂上的第 28 位置的 突變所造成 (Amir et al., 1999; Chahrour & Zoghbi, 2007)。其中約有 95%的典型瑞特 氏症患者都是因為來自父親的基因突變所造成 (Chahrour & Zoghbi, 2007; Trappe et al., 2001)。
瑞特氏症突變方式主要以錯義突變 (missense mutation)與無義突變 (nonsense mutation)為主，其中錯義突變 (也稱為點突變)為某個胺基酸內的其中一個鹼基改變，
導致其轉變成別種胺基酸，而錯誤的氨基酸序列可能導致製造出來的蛋白質功能失常，
在瑞特氏症病患中常見的點突變為 R106W、R133C 與 T158M 三種，而無義突變為某 個氨基酸內的鹼基突變後變成中止密碼子 (stop codon)，進而導致氨基酸序列轉譯提 早結束而造成蛋白質的縮短，在瑞特氏症病患中常見的無義突變為 R168X、R255X、
R270X、R294X 與 R306C 五種 (Colvin et al., 2004)。
此外有些病患也帶有突變的 MECP2 基因，但是卻不會有瑞特氏症病患的疾病表 徵，其原因為 X 染色體的去活化 (X chromosome inactivation)，這也是造成瑞特氏症 病患的疾病表徵差異性很大的原因之一。其中女性所擁有的兩條 X 染色體，其中一條 瑞特氏症的症狀 (Chahrour & Zoghbi, 2007)。
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三、 MECP2 基因
Mecp2 基因包含有 4 個外顯子 (exons)，負責轉錄製造 53kDa 大小的 MeCP2 蛋 白 (Theisen et al., 2013)，而因第二外顯子的結構不同，又可分為兩類異構物
(isoform)：MeCP2-e1 與 MeCP2-e2 (Chahrour & Zoghbi, 2007)，MeCP2 蛋白主要 高度表現在大腦、肺臟與脾臟，其次是心臟與腎臟，還有少許表現在肝臟、胃與小腸，
並且從胚胎時期開始，MeCP2 蛋白的含量在大腦中會隨著發育的過程表現越來越多 (Shahbazian et al., 2002)。MeCP2 蛋白依照功能性主要可分為兩個區域 : 甲基化 CpG 結合區域 (methyl-binding domain, MBD)及轉錄抑制區域 (transcriptional repression domain, TRD) (Li & Pozzo-Miller, 2012)。MeCP2 會經由 MBD 與 DNA 甲 基化的位點結合，而當 TRD 與 Sin3a 結合後，會招攬組蛋白去乙醯酶 (histone deacetylases, HDAC1/2)，使染色體纏繞緻密造成基因表現的抑制 (Damen &
Heumann, 2013)。然而，MeCP2 亦可與轉錄因子 CREB1 (cAMP responsive element binding protein 1)結合而促進基因轉錄 (Chahrour et al., 2008)。因此，MeCP2 蛋白 具有轉錄抑制與轉錄活化的功能，被視為轉錄調控者 (transcription regulator)。先前 研究指出當 MeCP2 蛋白的 S421 位點被磷酸化時可以調控樹突的排列、突觸小棘的形 態以及腦源性神經滋養因子 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因的轉錄 (Zhou et al., 2006)。
MeCP2 蛋白在成熟的神經細胞內有較高量的表現，而 MeCP2 缺失會干擾突觸 的成熟化，導致神經細胞的密度、大小和突觸的形狀皆有所改變 (Xu, Miller, &
Pozzo-Miller, 2014)，顯示神經細胞的成熟化 (maturation)與神經元形態及功能的維持 需要 MeCP2 的參與。
第二節 瑞特氏症模式小鼠
為了研究瑞特氏症的致病機轉，科學家們建立了各種不同類型的 Mecp2 基因突變 的模式小鼠，主要可分為三類：Mecp2 基因剔除小鼠 (Mecp2-null mice)、Mecp2 點
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突變小鼠 (Mecp2 mutant mice)與特定細胞的 Mecp2 缺失小鼠 (Cell-type specific
Mecp2 deletion mice)。瑞特氏症模式小鼠的公鼠發病時間約為四到六週大，而母鼠至
少有四個月的正常生長期。當瑞特氏症模式小鼠發病後，會產生與瑞特氏症患者相類 似的表型特徵，例如：大腦重量較輕、呼吸不規則、運動活力低下、運動協調能力缺 失與後肢蜷縮等表徵; 而在體重方面，公鼠會隨著發病過程越來越輕，母鼠則相反，其中公鼠壽命皆較母鼠為短 (Chahrour & Zoghbi, 2007; Li & Pozzo-Miller, 2012;
Ricceri et al., 2008)。
一、
Mecp2 基因剔除小鼠
區域或神經元缺少 MeCP2 之子代。例如利用 CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II)做為 Cre 重組酶的啟動子 (promoter)時，可產生只在前腦缺失 Mecp25
的小鼠(Gemelli et al., 2006); 利用 Sim1 (Single-minded homolog 1)做為 Cre 重組酶 的啟動子時，則可使 Mecp2 的缺失只發生在下視丘 (Fyffe et al., 2008); 利用 Th (tyrosine hydroxylase)或 Pet-1 做為 Cre 重組酶的啟動子時，則分別產生只在單胺類 神經元或是血清素神經元中缺乏 Mecp2 的小鼠 (Samaco et al., 2009); 而利用 Viaat (vesicular inhibitory amino acid transporter)做為 Cre 重組酶的啟動子，則產生只在 GABAergic 神經元中缺乏 Mecp2 的小鼠 (Chao et al., 2010)。各種不同 Mecp2 剔除 缺少的 Mecp2，主要可分為兩種：全身性 (systemic)給予 Mecp2 或是特定細胞 (cell-type specific)給予 Mecp2 (Li & Pozzo-Miller, 2012)。
由於瑞特氏症病患為 MECP2 缺失所造成的疾病，且小鼠研究發現，Mecp2 表現 在全身各處，先前研究指出藉由 Cre/loxP 重組酶系統，將 Mecp2 基因帶有 STOP codon 的瑞特氏症模式小鼠在出生後三到四週時以有表現 cre-ER 的雄性小鼠給予 Tamoxifen (一種雌激素受體的拮抗劑)的方式達到約 80%的神經細胞重新表現 Mecp2 即可顯著改 善瑞特氏症相類似的病症，例如存活率、步態、呼吸、陣顫與體重等指標，甚至對於 腦波 (Electroencephalography)也能有所改善 (Guy et al., 2007; Lang et al., 2014;
Robinson et al., 2012) ; 或是以週邊方式給予帶有 Mecp2-cDNA 的腺病毒 (AAV9)轉
6 給予不同的藥物治療， 例如：選擇性血清素回收抑制劑 (selective serotonin reuptake inhibitor)改善血清素的缺乏、Beta 受體阻斷劑 (Beta blockers)改善心律不整、抗癲癇 藥物(antiepileptics)控制癲癇的發作、乙醯左旋肉鹼 (Acetyl-l-caritine)改善心臟自主神 因子 (Insulin-like growth factor 1, IGF-1)相仿，其下游路徑皆經由磷脂酸肌醇激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase)/絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酵素 (Akt)與絲分裂蛋白酶 (mitogen-activated protein kinase)路徑，也在瑞特氏症模式小鼠中發現其表現量有所缺 失(Mellios et al., 2014)。MeCP2 蛋白的缺失也造成某些神經傳導素的減少，例如：在
Mecp2 基因剔除小鼠的紋狀體與腹側中腦皆發現多巴胺的減少 (Gantz et al., 2011;
Kao et al., 2013)。而 GABAergic 神經元若缺少 MeCP2 就會造成合成酶 (Gad1/2)及 GABA 的生合成量的減少 (Chao et al., 2010)。此外，MeCP2 的缺失也造成腦中特定 受體的改變，例如：μ 型類鴉片受體 (μ-opioid receptors, MOR1)在紋狀體有顯著減少、
而第二型多巴胺受體 (dopamine d2 receptor, DRD2)在紋狀體則有顯著的增加 (Kao et al., 2013)。
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對於上述各類型腦內分子的缺失，常用的治療方法為對於增加的分子給予抑制劑 而減少的分子則給予促效劑。先前研究指出，以腹腔注射方式給予鞘氨醇磷酸受體調 節劑 (Fingolimod)可以增加大腦皮質、海馬迴與紋狀體的 BDNF 的表現量，並且能夠 改善 Mecp2 基因剔除小鼠的運動活力低下以及運動協調能力缺失，甚至延長壽命 (Deogracias et al., 2012)。而給予重組人類胰島素生長因子 (recombinant human IGF1, rhIGF1)則可以延長 Mecp2 基因剔除小鼠的壽命、改善運動活力、心率、呼吸、
社交障礙與焦慮行為 (Castro et al., 2014)，而此 rhIGF1 使用在瑞特氏症病患上也顯 著地改善行為表現以及呼吸異常 (Khwaja et al., 2014)。由於瑞特氏症患者發病晚期也 表現類似巴金森氏症的運動障礙，因此部份科學家研究多巴胺系統的恢復對於瑞特氏 症模式小鼠的運動行為改善，例如以腹腔注射的方式給予左旋多巴 (levodopa)與多巴 脫羧酶 (dopamine decarboxylase, DDC)抑制劑，發現能夠延長壽命以及減輕運動障 礙 (Szczesna et al., 2014)。瑞特氏症病患先前在精神疾病診斷與統計手冊第四版 (DSM-IV)被歸類於泛自閉症 (autism spectrum disorder)，有許多臨床用藥都是依照症 狀給予適當的藥物，常見的藥物皆為 GABA 的促效劑 (Briggs, 2013)，主要用來改善
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先前研究指出，以 GABA 回收抑制劑給予 Mecp2 基因剔除小鼠，並未看到行為 上的改善效果，可能是因為增加了突觸間的 GABA 總量，因此活化突觸前 GABAB受 體，進而回饋抑制 GABA 的釋放 (Shrivastava et al., 2011)，所以無法偵測到行為改 善的效果。因此，我們嘗試選擇只作用在 GABAA受體的促效劑，厚朴生藥 (cortex
Magnoliae, How-Poh, HP)或是和厚朴酚合成的純化物 (以下簡稱 MH101)，測試其是
否可有效改善運障礙。再者，先前文獻亦指出和厚朴酚可穿過血腦障壁 (Blood-brain barrier)，所以我們採用管餵 (gavage)或是腹腔注射 (Intraperitoneal injection, i.p.) 周 邊給藥的方式投予不同瑞特氏症模式小鼠藥物，並比較這些小鼠在接受藥物處理前後 (MOR1)在前端紋狀體 (rostral straiatum)有顯著的減少，而第二型多巴胺受體 (DRD2) 在前端紋狀體有顯著的增加，我們因此推論若以μ 型類鴉片受體的促效劑 (DAMGO) 來增加前端紋狀體中 MOR1 的訊號傳遞或以第二型多巴胺受體的拮抗劑 (Raclopride) 來減少前端紋狀體中 DRD2 的訊號傳遞，有可能改善運動障礙或是其他瑞特氏症表徵。本研究也因此檢測在前端紋狀體投予 DAMGO 或 Raclopride 對正常小鼠的運動活力、
運動協調及運動學習能力的影響。本研究之成果可望有助於未來針對瑞特氏症之運動 障礙開發出新的治療策略。
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二、 DAMGO 與 Raclopride
DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin)為μ 型類鴉片受體促效劑 (Sigma, E7384)；Raclopride (3,5-Dichloro-N- (1-ethylpyrrolidin-2-ylmethyl) -2-hydroxy-6-methoxybenzamide (+)-tartrate salt) 為第二型多巴胺受體拮抗劑 (Sigma, R121)，皆溶於滅菌生理食鹽水後分裝保存於-20℃冰箱，使用前再將藥物以 生理食鹽水稀釋至適當濃度。其中，DAMGO 配製為 20 與 100 ng/ul (Sugino et al., 2012)，而 Raclopride 則配製為 1 與 10 ng/ul (Klinker et al.,2013) 。在使用孔徑 0.22 um 過濾器 (Miliipore)將藥物過濾後，吸取 100 ul 注入植入式給藥膠囊 (Alzet®
osmotic pump, 1007D)中，然後裝上長約 3 公分之引流導管與導管前端銜接的腦內注 射導管(brain infusion kit, Alzet)，並將組裝好的膠囊浸泡於無菌生理食鹽水中室溫靜 置 16 小時，在植入體內前於 37℃加熱 30 分鐘。此腦內注射導管以立體定位手術
（stereotaxic surgery, 見第五節） 植入待測小鼠的前端紋狀體時，連接其上的給藥 膠囊則植入小鼠的背部皮下，於吸收體液後，給藥膠囊將可連續七天以每小時 0.5 ul 的速率穩定將藥物輸出至目標腦區。
第二節 實驗動物
本實驗所採用之野生型雄性小鼠為 C57BL/6JNar 品系，於國家動物中心所購得。