以典型瑞特氏症模式小鼠研究運動障礙之療癒 - 政大學術集成

全文

(1)國立政治大學神經科學研究所碩士論文. 以典型瑞特氏症模式小鼠研究運動障礙之療癒 In search of interventions to ameliorate motor deficits in mouse models of typical Rett syndrome. 研究生：黃弈博 (Yi-bo, Huang) 指導教授：廖文霖博士 (Dr. Wenlin Liao). 中華民國一零四年一月三十日 January, 2015.

(2) 謝誌謝謝指導教授，我終於畢業了。感謝指導教授－廖文霖老師，這兩年多來對我的栽培所付出的心血，也感謝口試委員老師們－劉怡均老師與詹銘煥老師，在論文上給我許多精闢的建議，讓我的論文更加完整，也對於研究方向更有目標。謝謝同實驗室的同學方淇，在實驗上與課業上給了我很多的幫助。同屆的同學宇銘、芊澐和嘟嘟，偶爾能一起聊聊天，放鬆一下緊繃的情緒。鉉豐跟禎廷學長在我碩一的時後很照顧我。還有很多神祕的學弟妹們，雖然很少有交集，但是見面都還能打招呼跟聊天 (還有送食物給我!!!)，還能記得有我這個學長存在，真的很感謝！謝謝宗穎，在我碩班的生活給了很多支持。還有我的家人，雖然碩士班時，每年都只有過年期間能回家看爺爺奶奶，還好有你們支持我才能完成碩士班的學業。還有很多以前的朋友們的支持，在我上了碩士班跟大家很少聯絡後，偶爾還是會發簡訊來關心我，還有人能記得我的存在真好！感謝研究所的于姐，在我念碩班的期間，就像家人一樣的支持與鼓勵我，還有許多言語無法形容數不盡的感激，也謝謝趙老師，在這段期間的照顧，不論是課業或實驗上，都給了我許多相當有建設性的建議與幫助。謝謝可愛的老鼠們，雖然做實驗時，你們常逃跑與尖叫，而且繁殖也很不容易，但若不是你們，也就沒有我這份論文了！.

(3) 中文摘要瑞特氏症 (Rett syndrome, RTT)是由於第二型甲基 CpG 結合蛋白 (methyl - CpG binding protein 2, MECP2) 基因發生突變所造成的一種神經發育疾病。當小鼠的 MeCP2 缺失時，會產生許多類似瑞特氏症患者的運動障礙，其中包含運動活力低下、運動協調與運動學習能力缺損，此運動障礙可能由於 γ-胺基丁酸 (GABA)與多巴胺神經訊號傳遞功能失調所造成。先前研究發現 Mecp2 基因剔除小鼠的運動障礙伴隨大腦皮質與紋狀體中 GABA 合成的減少，我們因此嘗試利用藥理的方式增加 GABA 傳訊，測試其是否可改善 Mecp2 基因剔除小鼠的運動障礙。我們發現 Mecp2 基因剔除以及條件缺失公鼠，經由管餵方式給予 100 mg/kg 厚朴生藥 (cortex Magnoliae)連續七天後，對於平衡桿行走測試以及加速滾輪測試有改善的趨勢，但是對於 Mecp2T158A 點突變公鼠以及條件缺失母鼠卻沒有效果。我們進而檢測和厚朴酚合成純化物 (以下簡稱 MH101)對運動障礙的改善效果。在行為測試前九十分鐘腹腔給予 1 mg/kg 的 MH101 並觀察待測鼠在加速滾輪上的掉落延宕時間，發現 Mecp2 條件缺失母鼠在投藥後，與控制組母鼠在同樣藥物處理下相近，顯示 MH101 有改善運動障礙的效果。以免疫染色法觀察 c-Fos 蛋白表現量檢測神經細胞的活性，發現在投予 MH101 後，控制組母鼠的 c-Fos 蛋白表現量在紋狀體之內背側區有顯著的增加，且 Mecp2 條件缺失母鼠相對應的腦區也有增加的趨勢，而其他皮質腦區卻皆無明顯改變，其結果顯示內背側紋狀體的活性增加可能與 Mecp2 條件缺失母鼠的運動協調能力增加有所關聯。另一方面，先前研究指出瑞特氏症模式小鼠的前端紋狀體中，有 μ 型類鴉片受體表現量減少以及第二型多巴胺受體的過度表現，所以我們嘗試在野生型小鼠的前端紋狀體活化其 μ 型類鴉片受體或是減少第二型多巴胺受體的神經傳導，檢測是否能夠增加其運動能力。實驗結果顯示，不論是給予 μ 型類鴉片受體促效劑或是第二型多巴胺受體拮抗劑皆可有效防止手術後之運動活力表現的缺損，因此，於前端紋狀體活化 μ 型類鴉片受體或阻斷第二型多巴胺受體可能改善小鼠之運動障礙。綜上所述，本研究藉由改善神經傳導的缺失緩解瑞特氏症模式小鼠部份的運動障礙，提供典型瑞特氏症可能有效的治療方式。關鍵字 : 瑞特氏症, 第二型甲基 CpG 結合蛋白, 紋狀體, γ-胺基丁酸, 厚朴生藥, 和厚朴酚合成純化物. I.

(4) Abstract Rett Syndrome (RTT) is a neurodevelopmental disorder caused by mutations of the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2). Mice with deficient MeCP2 recapitulate many RTT-like motor symptoms, including hypoactivity, deficits in motor coordination, and motor learning, those are associated with hypofunction of GABAergic and dopaminergic neurotransmission. Previous study found that decreased GABA synthesis in the striatum is accompanied by motor deficits in Mecp2-null mice, here we attempt to examine whether pharmacological interventions by increasing GABA transmission could ameliorate motor deficits in Mecp2 mutant mice. We found that Mecp2-null mice and conditional knockout (cKO) male mice, but not mice carrying Mecp2T158A point mutation and cKO old female mice, administered with the cortex Magnoliae for 7 days via oral gavage at the dose of 100 mg/kg, showed a trend of improvement on open field test, beam walking task or rotarod task. We next tested the therapeutic effects of MH101 (a synthetic analog of honokiol),which is a GABAA receptor agonist derived from the bark of the plant Magnolia officinalis. We found that female cKO mice showed improvement on the rotarod performance after administration of 1 mg/kg MH101 90 mins prior to behavior tests. By examining expression of c-Fos protein, an indicator of neuronal activity, in different cortical and striatal regions with immunohistochemistry, we found that the MH101 treatment increased c-Fos expression in dorsomedial part of the rostral striatum in both control and cKO mice, but without significant alteration in the cortical neuron activity, suggesting that neuronal activity in the dorsomedial part of the rostral striatum may be related to increased motor learning in Mecp2 cKO female mice. On the other hand, the reduced expression of mu opioid receptor 1 and increased dopamine D2 receptor in the rostral striatum of RTT-like mice had been demonstrated in our previous study, we thus try to test whether activation of MOR1 or blockade of DRD2 in the rostral striatum could enhance motor function in wild-type mice. The results indicated that both treatments prevented post-surgery hypoactivity, suggesting that opioid and dopaminergic drugs could be alternative choices for improving motor deficits in RTT-like animal models. Taken together, our findings provide a proof-of-principle for novel pharmacological therapeutics to ameliorate motor deficits in mouse models of typical Rett syndrome.. Keywords : Rett syndrome, Mecp2, Striatum, GABA , cortex Magnoliae, MH101 II.

(5) 目錄中文摘要 ........................................................................................................................... I 英文摘要 .................................................................................................................................... II 目錄 ................................................................................................................................ III 表次 ................................................................................................................................ V 圖次 ............................................................................................................................... VI 縮寫對照表 .................................................................................................................... VII 第一章緒論 ................................................................................................................... 01 第一節瑞特氏症 (Rett syndrome, RTT) .......................................................................... 01. 一、症狀 ......................................................................................................... 01 二、病源學 ...................................................................................................... 01 三、MECP2 基因 ............................................................................................ 03 第二節瑞特氏症模式小鼠 .............................................................................................. 03. 一、Mecp2 基因剔除小鼠 .............................................................................. 04 二、Mecp2 點突變小鼠 ................................................................................ 04 三、Mecp2 條件缺失小鼠 .............................................................................. 04 第三節瑞特氏症模式小鼠的療癒. ................................................................................. 05. 一、基因治療. ............................................................................................... 05. 二、藥物治療. ............................................................................................... 06. 第四節實驗目的與策略. .............................................................................................. 07. 第二章材料與方法 ........................................................................................................ 09 第一節實驗藥物……...………………………………………………………….……..09 一、厚朴生藥與和厚朴酚合成純化物二、DAMGO 與 Raclopride 第二節實驗動物. ........................................................... 09. ......................................................................... 09. …….………………………………………………………………..09. 第三節基因轉殖鼠之基因型鑑定. .……………………………………………..10. 一、基因組去氧核醣核酸 (Genomic DNA)之萃取. ..................................... 10. 二、聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 第四節小鼠行為測試. ............................. 10. ……..……………………………………………………… 12. 一、敞箱測試 (open field test, OFT). ........................................................... 12. 二、平衡桿行走測試 (beam walking test, BWT). ......................................... 12. 三、加速滾輪測試 (accelerating rotarod, RTR). ........................................... 12. III.

(6) 四、行為實驗之統計分析. ............................................................................. 13 ……..……………………………………… 13. 第五節腦部藥物注射之立體定位手術第六節免疫組織染色. ……..………..………………………………………………… 13. 一、腦組織的灌流固定與切片二、免疫組織染色. .................................................................... 13. ...................................................................................... 14. 三、cFos 細胞計數定量分析. ...................................................................... 14. 第三章結果 ................................................................................................................... 16 第一節厚朴生藥對 Mecp2 基因剔除公鼠運動障礙之影響. ……..………………..16. 第二節厚朴生藥對 Mecp2 點突變公鼠運動障礙之影響……..……………………..20 第三節厚朴生藥對 Mecp2 條件缺失公鼠運動障礙之影響. ……………………….24. 第四節厚朴生藥對 Mecp2 條件缺失母鼠運動障礙之影響. .…………………..28. 第五節和厚朴酚合成純化物對 Mecp2 點突變公鼠運動障礙之影響. .………..32. 第六節和厚朴酚合成純化物對 Mecp2 條件缺失母鼠運動障礙之影響第七節和厚朴酚合成純化物對 Mecp2 條件缺失母鼠腦中神經活性的影響第八節 μ 型類鴉片受體促效劑在前端紋狀體對於運動表現的影響第九節第二型多巴胺受體拮抗劑在前端紋狀體對於運動表現的影響. .……..35 ...38 .....…..41 ..…...44. 第四章討論 ................................................................................................................... 47 第一節瑞特氏症模式小鼠表現運動活力低下與運動協調能力缺失. ………...…..47. 第二節厚朴生藥對不同瑞特氏症模式小鼠產生不同影響.…………………………..47 第三節和厚朴酚合成純化物對於不同腦區的神經細胞活性的影響..……………….49 第四節紋狀體前端活化 μ 型類鴉片受體促效劑對於運動表現的影響.………..…....50 第五節紋狀體前端抑制第二型多巴胺受體拮抗劑對於運動表現的影響..........…....51 第六節瑞特氏症模式小鼠運動障礙之療癒.………………………....………………..52 第七節本篇研究重要性………..………………………………………………….……52 第五章結論 ................................................................................................................... 54 參考文獻 ........................................................................................................................ 56 附錄 ............................................................................................................................. VIII. IV.

(7) 表次表一. 基因型鑑定之引子序列。 .............................................................................. 11. 表二：本研究所使用之藥物對於運動障礙之改善效果彙整表。 ................................55. V.

(8) 圖次圖一、厚朴生藥對於 Mecp2 基因剔除小鼠的敞箱活動力之影響。 .............................18 圖二、厚朴生藥對於 Mecp2 基因剔除小鼠的平衡桿行走測試表現之影響。 .............19 圖三、厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的敞箱活動力之影響。 ................................22 圖四、厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的加速滾輪測試表現之影響。 ......................23 圖五、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失公鼠的敞箱活動力之影響。 .............................26 圖六、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失公鼠的加速滾輪測試表現之影響。...................27 圖七、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失母鼠的敞箱活動力之影響。 .............................30 圖八、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失母鼠的加速滾輪測試表現之影響。 .................31 圖九、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 點突變小鼠的敞箱活動力之影響。 ...............33 圖十、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 點突變公鼠的加速滾輪表現之影響。............34 圖十一、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 條件缺失母鼠的敞箱活動力之影響。 ........36 圖十二、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 條件缺失母鼠的加速滾輪表現之影響。 .....37 圖十三、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 條件缺失母鼠前腦前端神經活性的影響。 .39 圖十四、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 條件缺失母鼠前腦後端神經活性的影響。 40 圖十五、前端紋狀體內投予 μ 型類鴉片受體促效劑對於小鼠敞箱活動力之影響。 ....42 圖十六、前端紋狀體內投予 μ 型類鴉片受體促效劑對於小鼠加速滾輪表現之影響。 ..43 圖十七、前端紋狀體內投予第二型多巴胺受體拮抗劑對於小鼠敞箱活動力之影響。 .45 圖十八、前端紋狀體內投予第二型多巴胺受體拮抗劑對於小鼠加速滾輪表現之影響。 46. VI.

(9) 縮寫對照表 AAV9. Adeno-associated virus serotype 9. ASD. Autism spectrum disorder. CaMKII. CAMP responsive element binding protein 1. CREB1. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. cDNA. Complementary deoxyribonucleic acid. DNA. Deoxyribonucleic acid. Dlx5/6. Distaless homeobox 5 and 6. DRD2. Dopamine D2 receptor. GABA. γ-Aminobutyric acid. GAD67 / GAD2. Glutamic Acid Decarboxylase 67 / 2. HDAC. Histone deacetylases. MAPK. Mitogen-activated protein kinases. MeCP2. Metyl-CpG-binding protein 2. MOR1. μ opioid receptor. rhIGF1. Recombinant human insulin-like growth factor. PIK3 RTT. Phosphatidylinositol 3-kinase Rett syndrome. SSRI. Selective serotonin reuptake inhibitor. Th. Tyrosine hydroxylase Vesicular inhibitory amino acid transporter. Viaat. VII.

(10) 第一章第一節. 緒論瑞特氏症 (Rett syndrome, RTT). 一、症狀西元 1966 年，一位維也納小兒科醫生 Dr. Andreas Rett 觀察到了 22 位小女孩擁有類似的不尋常手部扭絞行為，並且把這類的徵狀歸類為一種臨床病症，發表於德文期刊，但是當時並沒有引起醫學界的關注。直到 1983 年由瑞典醫師 Dr. Bengt Hagberg 也觀察到了 35 位擁有相同病徵的女性孩童案例，將這些案例以英文發表後 (Hagberg, 2002)，瑞特氏症才被醫學界注意，並且之後的科學家們便致力於尋找 RTT 的致病原因。瑞特氏症被歸類於一種神經發育疾病，好發於女性幼童，新生女嬰的發病機率大約為一萬分之一 (Amir et al., 1999)。臨床上將此疾病的發病階段大致分為四個時期，分別為發展遲緩期、快速退化期、穩定期、晚期運動障礙期 (Chahrour & Zoghbi, 2007)，而病童在出生後的 6~18 個月左右仍有正常的發育，此時並非所有病童皆有病徵出現，但開始發病的病童在發展遲緩期會開始出現腦部發展遲緩，即小頭畸形的現象，此外身高與體重會受到影響，也會出現因肌張力低下所產生姿勢不正常的情況發生。之後病情隨著年紀發展到了快速退化期(約 1~4 歲)時會開始出現發展遲緩的現象，並伴隨自閉症的病徵，例如畏縮或避免眼神的接觸，對身旁事物也逐漸失去興趣，手部的運動技能開始喪失並且出現手部絞紐或是搓手等非必要的行為，語言能力也會逐漸退化或失去，此階段的病童大部分都伴隨呼吸功能的不正常以及癲癇發生。但是到了穩定期(約 3~10 歲)時病情看似穩定，所出現的自閉症的病徵似乎不再退化趨於穩定，此階段會維持相當長一段時間，不過會開始出現行為動作的障礙或是脊柱側彎的情形發生。最後到了瑞特氏症的晚期(約 10 歲後)大部分的病患皆會喪失運動行為的能力，可能終身都需要行走的輔助器具，最後還會有類似帕金森氏症的症狀出現 (Chahrour & Zoghbi, 2007; Hagberg, 2002)。. 二、病源學. 1.

(11) 瑞特氏症的病患主好發於女童，發生率為一萬分之一，且只有極少數的男童患病後可以存活下來，所以早期對於瑞特氏症的研究推論為可能是 X 性染色體相關疾病。在 1999 年，科學家運用基因篩選的方式發現了瑞特氏症病患的 X 染色體上的長臂上的第 28 位置，第二型甲基化結合蛋白 (Methyl-CpG-binding protein 2,MECP2) 基因發生突變 (Amir et al., 1999)。並且瑞特氏症的病患有 99%以上皆為偶發性的突變所以很難利用關聯分析 (traditional linkage analysis)去找尋疾病基因，只能利用鮮少擁有相似病徵的病患來篩選出發生突變的基因位點就是在 X 染色體長臂上的第 28 位置的突變所造成 (Amir et al., 1999; Chahrour & Zoghbi, 2007)。其中約有 95%的典型瑞特氏症患者都是因為來自父親的基因突變所造成 (Chahrour & Zoghbi, 2007; Trappe et al., 2001)。瑞特氏症突變方式主要以錯義突變 (missense mutation)與無義突變 (nonsense mutation)為主，其中錯義突變 (也稱為點突變)為某個胺基酸內的其中一個鹼基改變，導致其轉變成別種胺基酸，而錯誤的氨基酸序列可能導致製造出來的蛋白質功能失常，在瑞特氏症病患中常見的點突變為 R106W、R133C 與 T158M 三種，而無義突變為某個氨基酸內的鹼基突變後變成中止密碼子 (stop codon)，進而導致氨基酸序列轉譯提早結束而造成蛋白質的縮短，在瑞特氏症病患中常見的無義突變為 R168X、R255X、 R270X、R294X 與 R306C 五種 (Colvin et al., 2004)。此外有些病患也帶有突變的 MECP2 基因，但是卻不會有瑞特氏症病患的疾病表徵，其原因為 X 染色體的去活化 (X chromosome inactivation)，這也是造成瑞特氏症病患的疾病表徵差異性很大的原因之一。其中女性所擁有的兩條 X 染色體，其中一條 X 染色體會表現在所有的細胞內，而另外一條會選擇性的隨機活化，表示這些細胞內所活化的 X 染色體中，一半表達源自母親的 X 染色體，另一半表達源自父親的 X 染色體。因此，當細胞中表現有正常的 MECP2 基因時會分化的比帶有突變的 MECP2 基因的細胞較快或是存活率較高，因此 X 染色體的去活化造成了隨機表現任一條 X 染色體的現象消失，進而減輕了 MECP2 基因突變所產生的瑞特氏症表徵，甚至是不表現瑞特氏症的症狀 (Chahrour & Zoghbi, 2007)。. 2.

(12) 三、 MECP2 基因 Mecp2 基因包含有 4 個外顯子 (exons)，負責轉錄製造 53kDa 大小的 MeCP2 蛋白 (Theisen et al., 2013)，而因第二外顯子的結構不同，又可分為兩類異構物 (isoform)：MeCP2-e1 與 MeCP2-e2 (Chahrour & Zoghbi, 2007)，MeCP2 蛋白主要高度表現在大腦、肺臟與脾臟，其次是心臟與腎臟，還有少許表現在肝臟、胃與小腸，並且從胚胎時期開始，MeCP2 蛋白的含量在大腦中會隨著發育的過程表現越來越多 (Shahbazian et al., 2002)。MeCP2 蛋白依照功能性主要可分為兩個區域 : 甲基化 CpG 結合區域 (methyl-binding domain, MBD)及轉錄抑制區域 (transcriptional repression domain, TRD) (Li & Pozzo-Miller, 2012)。MeCP2 會經由 MBD 與 DNA 甲基化的位點結合，而當 TRD 與 Sin3a 結合後，會招攬組蛋白去乙醯酶 (histone deacetylases, HDAC1/2)，使染色體纏繞緻密造成基因表現的抑制 (Damen & Heumann, 2013)。然而，MeCP2 亦可與轉錄因子 CREB1 (cAMP responsive element binding protein 1)結合而促進基因轉錄 (Chahrour et al., 2008)。因此，MeCP2 蛋白具有轉錄抑制與轉錄活化的功能，被視為轉錄調控者 (transcription regulator)。先前研究指出當 MeCP2 蛋白的 S421 位點被磷酸化時可以調控樹突的排列、突觸小棘的形態以及腦源性神經滋養因子 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因的轉錄 (Zhou et al., 2006)。 MeCP2 蛋白在成熟的神經細胞內有較高量的表現，而 MeCP2 缺失會干擾突觸的成熟化，導致神經細胞的密度、大小和突觸的形狀皆有所改變 (Xu, Miller, & Pozzo-Miller, 2014)，顯示神經細胞的成熟化 (maturation)與神經元形態及功能的維持需要 MeCP2 的參與。. 第二節. 瑞特氏症模式小鼠. 為了研究瑞特氏症的致病機轉，科學家們建立了各種不同類型的 Mecp2 基因突變的模式小鼠，主要可分為三類：Mecp2 基因剔除小鼠 (Mecp2-null mice)、Mecp2 點. 3.

(13) 突變小鼠 (Mecp2 mutant mice)與特定細胞的 Mecp2 缺失小鼠 (Cell-type specific Mecp2 deletion mice)。瑞特氏症模式小鼠的公鼠發病時間約為四到六週大，而母鼠至少有四個月的正常生長期。當瑞特氏症模式小鼠發病後，會產生與瑞特氏症患者相類似的表型特徵，例如：大腦重量較輕、呼吸不規則、運動活力低下、運動協調能力缺失與後肢蜷縮等表徵; 而在體重方面，公鼠會隨著發病過程越來越輕，母鼠則相反，其中公鼠壽命皆較母鼠為短 (Chahrour & Zoghbi, 2007; Li & Pozzo-Miller, 2012; Ricceri et al., 2008)。. 一、. Mecp2 基因剔除小鼠最常見的 Mecp2 基因剔除小鼠也被稱為”Bird strain”，為剔除 Mecp2 基因的第三. 外顯子與部份的第四外顯子，從發育早期就缺少了 MeCP2 蛋白的表現。剔除 Mecp2 的公鼠在出生後約四到六週就會開始發病且壽命約只有八到十週; 而剔除 Mecp2 的母鼠則在約四個月後才開始發病，且壽命並未顯著縮短 (Guy et al.,2001)。. 二、. Mecp2 點突變小鼠而 Mecp2 點突變小鼠 (Mecp2 mutant mice)種類則較多，皆為仿效瑞特氏症病患. 常見的點突變方式所生產出來的小鼠，例如：A140V、T158A、R168X、T308X 等方式，將 Mecp2 基因的這些位點上替換胺基酸，使基因無法正常的製造 MeCP2 蛋白，這類型點突變的方式所造成的瑞特氏症表徵較基因剔除小鼠輕微，其突變方式也較為接近瑞特氏症病患的模式 (Li & Pozzo-Miller, 2012)。. 三、. Mecp2 條件缺失小鼠此種小鼠之 Mecp2 缺失為利用 Cre/loxP 重組酶系統所產生，其原理為若以帶有. 不同啟動子 cre 基因轉殖鼠與帶有 Flox 序列的 Mecp2 基因轉殖鼠互交，可產生特定區域或神經元缺少 MeCP2 之子代。例如利用 CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II)做為 Cre 重組酶的啟動子 (promoter)時，可產生只在前腦缺失 Mecp2. 4.

(14) 的小鼠(Gemelli et al., 2006); 利用 Sim1 (Single-minded homolog 1)做為 Cre 重組酶的啟動子時，則可使 Mecp2 的缺失只發生在下視丘 (Fyffe et al., 2008); 利用 Th (tyrosine hydroxylase)或 Pet-1 做為 Cre 重組酶的啟動子時，則分別產生只在單胺類神經元或是血清素神經元中缺乏 Mecp2 的小鼠 (Samaco et al., 2009); 而利用 Viaat (vesicular inhibitory amino acid transporter)做為 Cre 重組酶的啟動子，則產生只在 GABAergic 神經元中缺乏 Mecp2 的小鼠 (Chao et al., 2010)。各種不同 Mecp2 剔除與突變的小鼠皆表現與瑞特氏症相似的症狀，因此研究人員運用這些基因轉殖的小鼠模式來研究瑞特氏症的致病機轉與療癒。. 第三節：瑞特氏症模式小鼠的療癒一、. 基因治療在瑞特氏症模式小鼠中常見的治療方式為基因治療，即給予瑞特氏症模式小鼠所. 缺少的 Mecp2，主要可分為兩種：全身性 (systemic)給予 Mecp2 或是特定細胞 (cell-type specific)給予 Mecp2 (Li & Pozzo-Miller, 2012)。由於瑞特氏症病患為 MECP2 缺失所造成的疾病，且小鼠研究發現，Mecp2 表現在全身各處，先前研究指出藉由 Cre/loxP 重組酶系統，將 Mecp2 基因帶有 STOP codon 的瑞特氏症模式小鼠在出生後三到四週時以有表現 cre-ER 的雄性小鼠給予 Tamoxifen (一種雌激素受體的拮抗劑)的方式達到約 80%的神經細胞重新表現 Mecp2 即可顯著改善瑞特氏症相類似的病症，例如存活率、步態、呼吸、陣顫與體重等指標，甚至對於腦波 (Electroencephalography)也能有所改善 (Guy et al., 2007; Lang et al., 2014; Robinson et al., 2012) ; 或是以週邊方式給予帶有 Mecp2-cDNA 的腺病毒 (AAV9)轉染 Mecp2 基因剔除小鼠，讓全身的 Mecp2 能夠在受轉染的細胞中重新表達，如此對於瑞特氏症相類似症狀也都有顯著的改善 (Garg et al., 2013)。利用 Cre/loxP 重組酶系統使特定細胞的 Mecp2 基因恢復，主要用來檢視 MeCP2 蛋白在各個腦區或是特定細胞族群所扮演的角色，例如只在腦幹與脊髓恢復 Mecp2 表現可以改善自主神經的失能與延長壽命 (Ward et al., 2011); 在兒茶酚胺. 5.

(15) (catecholaminergic)神經元上恢復 Mecp2 表現可以延長壽命、改善瑞特氏症相類似症狀與大腦皮質的癲癇樣放電 (Lang et al., 2012)。另外，在寡突膠細胞中恢復 Mecp2 也同樣有延長壽命、改善運動活力以及後肢蜷縮的刻板行為之效果 (Nguyen et al., 2013)。. 二、. 藥物治療瑞特氏症的病患目前尚無單一藥物可以治療，常見的治療方法皆為對不同的症狀. 給予不同的藥物治療，例如：選擇性血清素回收抑制劑 (selective serotonin reuptake inhibitor)改善血清素的缺乏、Beta 受體阻斷劑 (Beta blockers)改善心律不整、抗癲癇藥物(antiepileptics)控制癲癇的發作、乙醯左旋肉鹼 (Acetyl-l-caritine)改善心臟自主神經失調，以及褪黑激素改善睡眠 (Briggs, 2013)。而為了研究其它更有療效的藥物，科學家們開始研究各類型的瑞特氏症小鼠模式的大腦，檢測由於 Mecp2 缺失所造成的分子改變與神經迴路異常，例如 BDNF 為最早先被科學家們發現屬於正向的 Mecp2 下游基因，即缺少了 MeCP2 蛋白後，BDNF 會因為轉錄功能受到阻礙進而減少其表現量 (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003)。而最近科學家們發現 BDNF 對於強化突觸功能與其下游路徑和類胰島素生長因子 (Insulin-like growth factor 1, IGF-1)相仿，其下游路徑皆經由磷脂酸肌醇激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase)/絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酵素 (Akt)與絲分裂蛋白酶 (mitogen-activated protein kinase)路徑，也在瑞特氏症模式小鼠中發現其表現量有所缺失(Mellios et al., 2014)。MeCP2 蛋白的缺失也造成某些神經傳導素的減少，例如：在 Mecp2 基因剔除小鼠的紋狀體與腹側中腦皆發現多巴胺的減少 (Gantz et al., 2011; Kao et al., 2013)。而 GABAergic 神經元若缺少 MeCP2 就會造成合成酶 (Gad1/2)及 GABA 的生合成量的減少 (Chao et al., 2010)。此外，MeCP2 的缺失也造成腦中特定受體的改變，例如：μ 型類鴉片受體 (μ-opioid receptors, MOR1)在紋狀體有顯著減少、而第二型多巴胺受體 (dopamine d2 receptor, DRD2)在紋狀體則有顯著的增加 (Kao et al., 2013)。. 6.

(16) 對於上述各類型腦內分子的缺失，常用的治療方法為對於增加的分子給予抑制劑而減少的分子則給予促效劑。先前研究指出，以腹腔注射方式給予鞘氨醇磷酸受體調節劑 (Fingolimod)可以增加大腦皮質、海馬迴與紋狀體的 BDNF 的表現量，並且能夠改善 Mecp2 基因剔除小鼠的運動活力低下以及運動協調能力缺失，甚至延長壽命 (Deogracias et al., 2012)。而給予重組人類胰島素生長因子 (recombinant human IGF1, rhIGF1)則可以延長 Mecp2 基因剔除小鼠的壽命、改善運動活力、心率、呼吸、社交障礙與焦慮行為 (Castro et al., 2014)，而此 rhIGF1 使用在瑞特氏症病患上也顯著地改善行為表現以及呼吸異常 (Khwaja et al., 2014)。由於瑞特氏症患者發病晚期也表現類似巴金森氏症的運動障礙，因此部份科學家研究多巴胺系統的恢復對於瑞特氏症模式小鼠的運動行為改善，例如以腹腔注射的方式給予左旋多巴 (levodopa)與多巴脫羧酶 (dopamine decarboxylase, DDC)抑制劑，發現能夠延長壽命以及減輕運動障礙 (Szczesna et al., 2014)。瑞特氏症病患先前在精神疾病診斷與統計手冊第四版 (DSM-IV)被歸類於泛自閉症 (autism spectrum disorder)，有許多臨床用藥都是依照症狀給予適當的藥物，常見的藥物皆為 GABA 的促效劑 (Briggs, 2013)，主要用來改善焦慮的症狀。先前研究指出，以腹腔注射方式給予瑞特氏症模式小鼠 GABA 的回收抑制劑 (NO-711)可以有效改善其偶發性的窒息症狀 (Abdala et al., 2010)。另有研究指出，從出生後一個月開始以加入動物飲水方式持續給予 GABA 的回收抑制劑 Tiagabine (為一抗驚厥藥物)，發現不論是利用敞箱測驗或是滾輪測驗皆無改善小鼠運動行為的跡象，然而，卻因為增加了突觸間的 GABA 濃度而得以延長 Mecp2 基因剔除小鼠的壽命 (El-Khoury et al., 2014)。. 第四節：實驗目的與策略現行研究以瑞特氏症模式小鼠進行周邊或中樞給藥已可部分改善症狀並延長壽命，但給予 GABA 促效劑卻只能改善呼吸障礙與延長壽命，而無法改善運動障礙，其原因尚須進一步探討。. 7.

(17) 先前研究指出，以 GABA 回收抑制劑給予 Mecp2 基因剔除小鼠，並未看到行為上的改善效果，可能是因為增加了突觸間的 GABA 總量，因此活化突觸前 GABAB 受體，進而回饋抑制 GABA 的釋放 (Shrivastava et al., 2011)，所以無法偵測到行為改善的效果。因此，我們嘗試選擇只作用在 GABAA 受體的促效劑，厚朴生藥 (cortex Magnoliae, How-Poh, HP)或是和厚朴酚合成的純化物 (以下簡稱 MH101)，測試其是否可有效改善運障礙。再者，先前文獻亦指出和厚朴酚可穿過血腦障壁 (Blood-brain barrier)，所以我們採用管餵 (gavage)或是腹腔注射 (Intraperitoneal injection, i.p.) 周邊給藥的方式投予不同瑞特氏症模式小鼠藥物，並比較這些小鼠在接受藥物處理前後的運動活力與運動協調能力。運動活力的觀察以「敞箱測驗」來分析其移動距離與速度等參數，至於運動協調能力，我們利用「平衡桿行走測驗」或「加速滾輪測驗」來測試，其中加速滾輪亦可分析運動學習能力。為進一步瞭解瑞特氏症模式小鼠的運動障礙是否能夠被厚朴生藥改善，本實驗中使用三種不同瑞特氏症模式小鼠，分別為 Mecp2 基因剔除小鼠、模仿瑞特氏症病患的 Mecp2T158A 點突變小鼠與在 GABA 神經元剔除 Mecp2 的條件缺失小鼠。有鑒於先前藥物治療的方式皆針對瑞特氏症模式小鼠大腦中所缺失的特定分子，來恢復其表現量以達到改善類似瑞特氏症的運動障礙與其他表徵，根據本實驗室先前的研究發現，Mecp2 基因剔除小鼠的 μ 型類鴉片受體 (MOR1)在前端紋狀體 (rostral straiatum)有顯著的減少，而第二型多巴胺受體 (DRD2) 在前端紋狀體有顯著的增加，我們因此推論若以 μ 型類鴉片受體的促效劑 (DAMGO) 來增加前端紋狀體中 MOR1 的訊號傳遞或以第二型多巴胺受體的拮抗劑 (Raclopride) 來減少前端紋狀體中 DRD2 的訊號傳遞，有可能改善運動障礙或是其他瑞特氏症表徵。本研究也因此檢測在前端紋狀體投予 DAMGO 或 Raclopride 對正常小鼠的運動活力、運動協調及運動學習能力的影響。本研究之成果可望有助於未來針對瑞特氏症之運動障礙開發出新的治療策略。. 8.

(18) 第二章. 材料與方法. 第一節. 實驗藥物. 一、. 厚朴生藥與和厚朴酚合成純化物厚朴生藥 (cortex Magnoliae, How-Pow, HP)與和厚朴酚合成純化物 (MH101)皆. 為 GABAA 受體促效劑且可穿過血腦障壁 (Fried & Arbiser, 2009)，兩者皆由國立政治大學神經科學研究所詹銘煥博士提供。厚朴生藥在使用前以 3%DMSO 溶解，並以生理食鹽水配製為 100 mg/ml，以試管振盪器充分搖晃均勻後立即進行管餵 (gavage)給藥。和厚朴酚合成純化物則溶於玉米油，分裝數小管保存於-20℃冰箱，於使用前以生理食鹽水稀釋配製為 1 mg/ml，充分混合均勻後進行腹腔注射 (i.p.)給藥。. 二、. DAMGO 與 Raclopride DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin)為 μ 型類鴉片受體促效劑. (Sigma, E7384)；Raclopride (3,5-Dichloro-N- (1-ethylpyrrolidin-2-ylmethyl) -2-hydroxy-6-methoxybenzamide (+)-tartrate salt) 為第二型多巴胺受體拮抗劑 (Sigma, R121)，皆溶於滅菌生理食鹽水後分裝保存於-20℃冰箱，使用前再將藥物以生理食鹽水稀釋至適當濃度。其中，DAMGO 配製為 20 與 100 ng/ul (Sugino et al., 2012)，而 Raclopride 則配製為 1 與 10 ng/ul (Klinker et al.,2013) 。在使用孔徑 0.22 um 過濾器 (Miliipore)將藥物過濾後，吸取 100 ul 注入植入式給藥膠囊 (Alzet® osmotic pump, 1007D)中，然後裝上長約 3 公分之引流導管與導管前端銜接的腦內注射導管(brain infusion kit, Alzet)，並將組裝好的膠囊浸泡於無菌生理食鹽水中室溫靜置 16 小時，在植入體內前於 37℃加熱 30 分鐘。此腦內注射導管以立體定位手術（stereotaxic surgery, 見第五節）植入待測小鼠的前端紋狀體時，連接其上的給藥膠囊則植入小鼠的背部皮下，於吸收體液後，給藥膠囊將可連續七天以每小時 0.5 ul 的速率穩定將藥物輸出至目標腦區。. 第二節. 實驗動物. 本實驗所採用之野生型雄性小鼠為 C57BL/6JNar 品系，於國家動物中心所購得。 Mecp2 基因剔除小鼠、Mecp2 T158A 點突變小鼠、Dlx5/6-Cre 基因轉殖鼠、Flox-Mecp2 基因轉殖鼠以上基因轉殖鼠之種源均來自於美國賓州大學遺傳學系，皆以 C57BL/6J 品系小鼠回交六代以上，確保基因背景回復至>99% 之 C57BL/6J 品系，方使用於行 9.

(19) 為實驗。小鼠之飼育條件為 12:12 小時晝夜循環 (白晝時間為早上８點到晚上 8 點)，溫度維持在 21-23℃，濕度維持在 50-70％，飼養期間供應充足的無菌飼料與無菌二次水。本研究中所有小鼠飼育與動物實驗之操作方法均遵循國立政治大學動物實驗管理小組 (Institutional Animal Care and Use Committees , IACUC) 所制訂之規範。. 第三節. 基因轉殖鼠之基因型鑑定. 一、. 基因組去氧核醣核酸 (Genomic DNA)之萃取小鼠出生後 3 週離乳時剪取尾端 3~5 mm 長度之組織，放入 300 ul 溶解緩衝液 (Lysis Buffer，含有 0.5M Tris-HCl、0.1M EDTA、0.1M NaCl 及 1%SDS)中，加入 1.5ul 蛋白酶 K (proteinase K, Amresco)後，於 55℃置放至少 4 小時，使組織完全溶解於緩衝液中。而後加入 3 ul 核醣核酸酶 (RNaes, Amresco)，於 37℃ 反應 30 分鐘將 RNA 去除。加入 100 ul 蛋白質沉澱液 (protein precipitation solution, Promega)，混合均勻後放置冰上 5 分鐘，以 13000 r.p.m.高速離心 10 分鐘，將 300 ul 上清液抽取出後放入新管，此溶液即含有要萃取之 DNA。之後加入同體積的異丙醇 (Isopropanol, Sigma)混合均勻，置於冰上 5 分鐘，進行 DNA 之析出。再以 13000 r.p.m.高速離心 5 分鐘後，移除所有上清液，接著加入 800 ul 70%乙醇，去除殘留的有機物質。再以 13000 r.p.m.高速離心 5 分鐘，移除乙醇並開蓋讓多餘的液體揮發後，加入 200 ul 保存緩衝液 (TE buffer，含有 10 mM Tris-HCl 及 1 mM EDTA)，置放於 50℃水浴槽至少 2 小時讓 DNA 回溶，最後保存至 4℃。. 二、. 聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR). 1. Mecp2 基因剔除小鼠之基因型鑑定: Mecp2 基因剔除小鼠是剔除 Mecp2 基因上包含外顯子 3 與外顯子 4 基因片段的轉殖鼠 (Guy et al., 2001)。所有小鼠皆運用 PCR 技術來完成小鼠基因型鑑定。PCR 反應條件如下：進行 94℃5 分鐘，再以 94℃30 秒、64℃45 秒及 72℃45 秒循環 35 次後，進行 72℃5 分鐘。反應完成後，Mecp2 基因剔除鼠之 PCR 產物將會在 1.5%電泳凝膠上分離出 458bp 之片段。. 2. Mecp2 T158A 點突變小鼠之基因型鑑定：Mecp2T158A 點基因突變鼠是利用同源染. 10.

(20) 色體互換 (Homologus recombination)之原理得到點突變之小鼠，使第 158 個胺基酸由 T 變為 A (Goffin et al., 2012)，所有小鼠皆運用 PCR 技術來完成小鼠基因型鑑定。PCR 反應條件如下：進行 94℃5 分鐘，再以 94℃30 秒、60℃40 秒及 72℃60 秒循環 35 次後，進行 72℃5 分鐘。反應完成後，Mecp2 T158A 點基因突變鼠之 PCR 產物將會在 1.5%電泳凝膠上分離出 691bp 之片段。 3. Dlx5/6-Cre 基因轉殖鼠之基因型鑑定：Dlx5/6-Cre 基因轉殖鼠是在 Dlx5/6 啟動子後插入 Cre 基因重組酶之基因轉殖鼠 (Monory et al., 2006)。所有小鼠皆使用 PCR 技術來完成基因型鑑定。PCR 反應條件如下：進行 94℃3 分鐘，再以 94℃30 秒、64℃60 秒及 72℃60 秒循環 35 次後，進行 72℃5 分鐘。反應完成後，Cre 基因轉殖小鼠之 PCR 產物將會在 1.5%電泳凝膠上分離出 320bp 之片段。 4. Flox-Mecp2 基因轉殖鼠之基因型鑑定：Flox-Mecp2 基因轉殖鼠是在 Mecp2 基因的 exon3 前後插入 loxP 序列之基因轉殖鼠 (Chen et al., 2001)。所有小鼠皆運用 PCR 技術來完成基因型鑑定。PCR 反應條件如下：先進行 94℃3 分鐘，再以 94℃30 秒、55℃45 秒及 72℃45 秒循環 35 次後，進行 72℃5 分鐘。反應完成後，野生型小鼠及 Flox-Mecp2 基因轉殖鼠之 PCR 產物將會分別在 1.5% 電泳凝膠上分離出 180bp 及 280bp 之片段。表一 : 基因型鑑定之引子序列 Mecp2 基因剔除鼠 (如附錄圖一 A) Mecp2. T158A. 點. 基因突變鼠 (如附錄圖一 B) Dlx5/6-Cre 基因轉殖鼠 (如附錄圖一 C) Flox-Mecp2 基因轉殖鼠 (如附錄圖一 D). 前置引子 1. 前置引子 2. 反置引子. 產物長度 (bp). 文獻. 5’-GACCCC TTGGGACT GAAGTT -3’. 5’-CCATGC GATAAGCTT GATGA-3’. 5’-CCACCCTC CAGTTGGTTTA -3’. WT : 411 bp -/y Mecp2 : 458 bp. (Guy et al., 2001). 5’-GGATTGT GGAAAAGC CAG-3’. 5’-ATGACCTGG GCAGATGTGG TAG-3’. WT : 620 bp T158A Mecp2 : 691 bp. (Goffin et al., 2012). 5’-ACGAACA CAGCGAAA GGAC T-3’. 5’-CAGGTTCTT GCGAACCTCA T-3’. WT : 250 bp Cre : 320 bp. (Monory et al., 2006). 5’-CACCACA GAAGTACTA TGATC-3. 5’-CTAGGTAAG AGCTCTTGTT GA-3’. WT : 180 bp Flox :280 bp. (Chen et al., 2001). 11.

(21) 第四節. 小鼠行為測試. 一、. 敞箱測試 (open field test, OFT) 將小鼠放進透明的壓克力箱 (40cm x 40cm x 25cm)中，以監視錄影器錄下影像。. 厚朴生藥與和厚朴酚合成純化物實驗記錄 16 分鐘，使用 smart 軟體 (V 2.5, PanLab, Spain)分析 3 分 30 秒至 15 分 30 秒共 12 分鐘的影像 ; 而植入式給藥膠囊手術的小鼠記錄 33 分鐘的影像，使用軟體分析 1 分 30 秒至 31 分 30 秒共 30 分鐘的影像。分析項目包含總移動距離 (Total distance)、平均速度 (V.avge)、靜止不動的時間百分比 (% immobility time)、停留在中心區域的時間比例 (% time in central arena)。並利用 two-way ANOVA 與 Bonferroni post hoc 事後分析來比較經由不同藥物處理與不同基因突變的小鼠各組之間表現的差異。. 二、. 平衡桿行走測試 (beam walking test, BWT) 首先將一 80 公分長的，直徑 1.5 公分寬的圓棒平放且用兩個高 60 公分的平檯分. 別架於平衡桿前端與後端各 5 公分使平衡桿中間保持 70 公分的長度皆騰空架高，並在平衡桿騰空處上每 10 公分標示出一刻度，並在前端 5 公分處放置一個黑色外觀的盒子且在其正面開一高 8 公分，寬 5 公分的一個小門讓老鼠可以進入盒內躲藏，在第一天的測試前先訓練所有小鼠都能行走於平衡桿上，總共會分為 4 次訓練，第 1 次先將小鼠放置到平衡桿上 10 公分處讓小鼠自行爬行到盒子內，當小鼠到達盒子後開始計時 30 秒，時間結束後再將小鼠放回原鼠籠休息 1 分鐘後在進行下一趟訓練，第 2 至 4 次皆以不同距離但相同方法訓練，距離分別為 20 公分、40 公分、60 公分，接受 4 次訓練完後再將小鼠放回原鼠籠休息 30 分鐘後再進行測試，測試方式為將小鼠放置於騰空平衡桿標示 60 公分處，利用計時器計算小鼠到達標的所花時間，一天測兩次時間間隔為 20 分鐘，且在測試不同小鼠時會將標的盒子使用 70%酒精消毒擦拭才進行下一隻小鼠的測試。並利用 two-way ANOVA 與 Bonferroni post hoc 事後分析來比較經由不同藥物處理與不同基因突變的小鼠各組之間表現的差異。. 三、. 加速滾輪測試 (accelerating rotarod, RTR) 在測試的第一天，小鼠會先在加速滾輪儀器上 (PanLab，Spain)以固定的 4 r.p.m.. 轉速訓練 30 秒。小鼠回到原飼養籠等待 30 分鐘後，開始接受加速滾輪測試，此時滾輪轉速設定為 5 分鐘內從 4 r.p.m.加速到 40 r.p.m.。小鼠每天會有 3 次的測試，每次. 12.

(22) 測試間隔為 30 分鐘，連續測試 4 天。其中只在第一天測驗前，會先進行一次的固定轉速的訓練。每當小鼠從滾輪上掉落後，機器會自動記錄掉落的時間與當時的轉速，再從每天測試三次的結果數值取出中位數 (median)來進行統計分析。並利用 two-way ANOVA 與 Bonferroni post hoc 事後分析來比較經由不同藥物處理與不同基因突變的小鼠各組之間表現的差異。. 四、. 行為實驗之統計分析所有厚朴生藥、和厚朴酚合成純化物與 DAMGO/Raclopride 藥物處理之行為測驗、. 體重皆使用 two-way ANOVA 分析、Bonferroni post-hoc 事後分析與 Student-t test 來檢測不同基因型的小鼠在藥物操弄下實驗組與控制組之表現差異。. 第五節. 腦部藥物注射之立體定位手術. 首先使用嚙齒動物麻醉機 (matrix vip 3000, Midmark)將異氟醚 (isoflurane, Baxter U.S.)以每分鐘氣化 5 毫升的汽化速率，將小鼠麻醉後，將其頭皮上的毛髮以電動剃刀去除，再將小鼠固定於立體定位儀 (stereotaxic apparatus, KOPF)上，並將麻醉機的汽化速率調降至每分鐘氣化 1.5 毫升，確保其呼吸平順。將小鼠頭皮劃開後，使用 1%雙氧水將其頭蓋骨消毒並清除血漬，依據前囟門 (Bregma)位置定位出座標前後 (AP) +1.5 mm，左右 (ML) -0.5 mm 的位置，以迷你電鑽 (Octopus)將頭骨鑽一小洞，再用針頭將腦膜挑破，並在前端固定一小螺絲，然後將給藥膠囊塞入小鼠背部皮下，再將膠囊之注射導管以立體定位儀埋入上述座標並插至深度 (DV) -3.5 mm 處。最後使用牙粉 (dental cement, Tempron)，將腦部注射導管固定在小鼠頭上，待牙科膏乾燥硬化後，將小鼠由立體定位儀上取下，並以電暖器加熱防止失溫直到麻醉消退，其後每天觀察並記錄體重以確認其術後恢復良好。. 第六節. 免疫組織染色. 一、. 腦組織的灌流固定與切片使用異氟醚氣體麻醉小鼠後，將小鼠固定於一平板上，以鑷子夾起胸腔表皮後，. 剪開胸腔及橫隔膜，露出心臟。利用幫浦 (MasterFlex, USA)將生理食鹽水灌流入左心室 3 分鐘，確認移除全身血液後，再以固定液 4%多聚甲醛 (paraformaldehyde, Sigma)灌流十分鐘。取出灌流完成之鼠腦浸泡於固定液中，在 4℃進行後固定. 13.

(23) （post-fixation）至少 16 小時，再浸泡於 30% 糖水 (sucrose in PBS)中兩天，再將腦組織急速冷凍儲存於-80℃冰櫃中。腦組織切片時，利用冷凍切片機 (S3050, Leica) 以冠狀切面切出厚度 20μm 的切片，保存於含有 0.1%的疊氮化鈉 (sodium azide, Merck)的 0.1M 磷酸鹽緩衝液 (phosphate buffer, PB)中，直到進行組織染色。. 二、. 免疫組織染色將組織切片以 0.1M 磷酸鹽緩衝鹽水 (phosphate buffered saline ,PBS)清洗 3 次，. 而後浸泡在於 0.2%Triton X-100/PBS 溶液中 10 分鐘將細胞穿孔，再放入 10%甲醇 (Methanol)/3%過氧化氫 (H2O2)混合液中去除內生性過氧化物酶 (peroxidase)。清洗 3 次後，以 3%山羊血清 (Normal goat serum)溶液去除背景，再加入初級抗體反應至少 16 小時。初級抗體為 polyclonal rabbit anti-c-Fos antibody (1:10k, Millipore,#PC38) 。反應完成後，先以 0.1M PBS 清洗 4 次，再放入二級抗體中反應 2 小時。二級抗體分別為 biotinylated goat anti-rabbit 及 biotinylated horse anti-mouse (1:500, Vector)。反應完後以 0.1M PBS 清洗 4 次，然後於 Avidin-Biotin Complex (Vector)溶液中反應兩小時將訊號放大。以 0.1M 鈉鉀磷酸鹽緩衝液 (Na-K PB)清洗 2 次後，浸泡於含有二氨基聯苯胺 (Diaminobenzidine, DAB)/銨鎳硫酸鹽 (Nickel ammonium sulfate) 的緩衝液中，加入 0.06% H2O2 呈色。呈色完畢後，以 0.1M Na K PB 溶液將組織切片清洗完全，貼到載玻片上，經由酒精 (ethanol)與二甲苯 (Xylene, Merck)脫水後，以封片膠蓋上蓋玻片。最後，利用正立顯微鏡 (Axio Imager D2, Zeiss, Germany)觀察組織切片，並以 CCD 相機 (C10600，Hamamatsu, Japan)拍照存檔與分析。. 三、. cFos 細胞計數定量分析經由和厚朴酚合成純化物處理後的組織切片為每 24 片挑一片，挑選出 Bregma. 1.18 與 0.14 mm 處的切片做定量分析。首先，在前腦前端 (Bregma 1.18mm)之切片選取扣帶腦回 (cingulate cortex, Cg)、初級運動皮質 (motor cortex, M1)、梨狀皮質 (piriform cortex, PC)、內背側紋狀體 (dorsal-medial striatum, dmST); 而在前腦後端 (Bregma 0.14 mm)之切片則選取 Cg、初級感覺皮質 (primary somatosensory cortex, S1)、PC、dmST 與外背側紋狀體 (dorsal-lateral striatum, dlST)來計算細胞數目。細. 14.

(24) 胞數目之定量，是在皮質各腦區 (Cg, M1, PC, S1)的相同位置處選取一個 100 x 100 um 的矩型區域，並計算此面積中所包含的 cFos＋細胞總數。而由於 dmST 與 dlST 之 cFos＋細胞較稀疏，故在 20 倍物鏡的相同視野下，計算整個視野內的紋狀體中所觀察到的 cFos＋細胞總數。最後利用 two-way ANOVA 及 Bonferroni post hoc 事後分析來檢測是否藥物處理對特定腦區之神經活性 (cFos+細胞數)有所影響。. 15.

(25) 第三章結果第一節. 厚朴生藥對 Mecp2 基因剔除公鼠運動障礙之影響. 本實驗所使用的一個月大的雄性 Mecp2 基因剔除小鼠，為目前研究瑞特氏症最常被使用的動物模型之一，此小鼠模式具有運動能力低下與運動協調能力低下的表徵 (Guy et al., 2001)。我們利用此基因剔除小鼠來測試給予厚朴生藥 (cortex Magnoliae, How-Pow, HP)是否能對於運動活力與運動協調障礙有所改善。一個月大的雄性 Mecp2 基因剔除小鼠於每天下午六點以管餵方式給予 100 mg/kg 厚朴生藥，於連續十四天給藥過程中，每七天進行一次敞箱測試與平衡桿行走測試來當做運動活力與運動協調能力之指標。待測鼠於給藥前先進行行為測試，以作為給藥前後運動能力比較之基準點，並於給藥 14 天之行為測試後隔天進行灌流取腦 (如圖一 A)。在給藥前 (pretest)的敞箱測試中，Mecp2 基因剔除小鼠的總移動距離 (Total traveled distance) 相較於野生型小鼠較為減少 (如圖一 B, genotype effect : F(1,24)=21.13 , p = 0.001)，平均速度 (average velocity，V-avg) 也較野生型小鼠低下 (如圖一 C, genotype effect : F(1,24) = 19.7, p = 0.0002)，而靜止不動的時間百分比 (percentage of resting time, %RT) 則較野生型小鼠高 (如圖一 D, genotype effect : F(1,24) = 16.9 ,p = 0.0004)，代表焦慮程度的中央區停留時間百分比 (percentage of time in central arena) 則較野生型小鼠為少 (如圖一 E, genotype effect : F(1,24) = 6.083, p = 0.0212)，顯示 Mecp2 基因剔除小鼠有相似於瑞特氏症之運動活力低下的表徵。前測後，將待測鼠分為四組如下，分別投予不同之藥物：1. 野生型小鼠施打生理食鹽水 (控制組) 2. 野生型小鼠施打厚朴 (實驗組) 3. Mecp2 基因剔除小鼠施打生理食鹽水 (控制組) 4. Mecp2 基因剔除小鼠施打厚朴 (實驗組)。結果發現，在給予藥物後每七天所做的行為測試中，野生型小鼠在給藥七天與十四天後控制組與實驗組的敞箱測試的總移動距離、平均速度、靜止不動時間與焦慮程度均無顯著差異(如圖一 B - E, p > 0.05)，顯示厚朴生藥並不影響正常小鼠之敞箱活動力。而在 Mecp2 基因剔除小鼠給藥七天後發現，控制組的總移動距離與平均速度相較於給藥前有降低的趨勢，而實. 16.

(26) 驗組則維持於與打藥前相同的運動活力表現 (如圖一 B, C; p > 0.05)，然而在靜止不動時間與焦慮程度則沒有受到藥物影響 (如圖一 D,E; p > 0.05)。但此改變的趨勢只在給藥後七天，而給藥十四天後，Mecp2 基因剔除小鼠的敞箱活動力與控制組相較並無顯著差異，且其運動活力與野生型小鼠相較則仍然較為低下 (如圖一 B; genotype effect: F(1,24) = 10.98, p = 0.0029)。此結果顯示投予厚朴生藥雖無法將 Mecp2 基因剔除小鼠運動活力低下的表徵恢復至野生型小鼠的水準，但在投予藥物七天相較於 Mecp2 基因剔除控制組鼠則有改善活力的趨勢。此外，我們使用平衡桿行走測試實驗來檢測 Mecp2 基因剔除小鼠的運動協調能力。在給藥前 Mecp2 基因剔除小鼠在平衡桿上行走到目標區的時間較野生型小鼠顯著較長 (如圖二 B, genotype effect : F(1,24) = 34.14, p = 0.001)，且在平衡桿上之移動速度也較野生型小鼠慢 (如圖二 C, genotype effect : F(1,24) = 32.45, p < 0.0001)，顯示 Mecp2 基因剔除小鼠有運動協調功能的缺失。值得注意的是，在 Mecp2 基因剔除小鼠在投予厚朴生藥七天後，到達標所花的時間顯著的較其控制組鼠少(如圖二 B; p < 0.01)，而移動速度雖無統計上的差異但也有改善的趨勢 (如圖二 C; p > 0.05); 然而在給藥十四天後，其平衡桿行走測試之表現又恢復到給藥前的水準 (如圖二 B,C; p > 0.05)。此結果顯示，時間的推移對於 Mecp2 基因剔除小鼠的類瑞特氏症運動障礙日趨嚴重的影響可能大於藥物的改善效果。而投予厚朴生藥七天或十四天後，並未影響野生型小鼠於平衡桿上行走到達標的時間與移動速度 (如圖二 B,C; p > 0.05) 綜合上述之結果，Mecp2 基因剔除小鼠連續投予十四天的厚朴生藥後，並無法顯著改善運動活力，但是在第七天測試時，相較於只施打生理食鹽水的待測鼠的確有改善的趨勢。在平衡桿行走測試中，Mecp2 基因剔除小鼠在連續投予厚朴生藥七天後，於平衡桿上行走到達標的的時間相較於其控制組小鼠顯著的縮短，顯示厚朴生藥可明顯改善 MeCP2 缺失所造成的運動協調缺損。然而，投藥十四天後，所有待測鼠的行為皆明顯惡化，可能是因為 Mecp2 基因剔除小鼠所產生的運動障礙表徵太過嚴重，以至於藥物無法產生明顯的改善效果。為進一步證明厚朴生藥對於運動障礙之療效，我們接下來使用其他瑞特氏症模式小鼠來檢測藥物對運動行為之影響。. 17.

(27) 圖一、厚朴生藥對於 Mecp2 基因剔除小鼠的敞箱活動力之影響。(A) 實驗流程示意圖。一個月大的 Mecp2 基因剔除公鼠(KO)及同胎之野生型小鼠(WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥(HP)或生理食鹽水(Saline)共 14 天，在投藥前及 7 天、14 天後分析待測鼠之敞箱活動力。(B) 待測鼠進行敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 待測鼠於敞箱測試之平均速度。(D) 待測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示 *, p < 0.05; **, p < 0.01, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post-hoc test。. 18.

(28) 圖二、厚朴生藥對於 Mecp2 基因剔除小鼠的平衡桿行走測試表現之影響。 (A) 實驗流程示意圖。一個月大的 Mecp2 基因剔除公鼠 (KO)及同胎之野生型小鼠 (WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水 (Saline)共 14 天，在投藥前及 7 天、 14 天後分析待測鼠之平衡桿行走表現。 (B)為待測鼠於平衡桿上行走到達標的所花的時間。(C)為到達標的之速度。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。**, p < 0.01; ***, p < 0.001, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 19.

(29) 第二節. 厚朴生藥對 Mecp2 點突變公鼠運動障礙之影響. 本研究所使用之 Mecp2 點突變小鼠，是在全身 MeCP2 蛋白上之第 158 胺基酸位置由原本的蘇胺酸 (Threonine, T)置換成丙胺酸 (alanine, A)，此突變會造成 MeCP2 蛋白不穩定而衰減，行為上與 Mecp2 基因剔除小鼠同樣具有運動障礙之表徵，以病原學而言，此 Mecp2 點突變小鼠為一種較 Mecp2 基因剔除小鼠更接近於瑞特氏症患者的模式小鼠 (Goffin et al., 2012; Chao & Zoghbi, 2012)。基於前節之實驗結果：厚朴生藥給予七天即可有效改善 Mecp2 基因剔除小鼠運動協調之缺陷，我們推測厚朴生藥也應可改善 Mecp2 點突變小鼠之運動障礙。利用一個月大的 Mecp2 點突變公鼠於每天下午六點以管餵方式給予 100 mg/kg 厚朴生藥，給藥七天後進行敞箱測試與加速滾輪測試來當做運動活力與運動協調能力之指標。待測鼠於給藥前先進行行為測試，以作為給藥前後運動能力比較之基準點，並於給藥七天之行為測試後隔天進行灌流取腦 (如圖三 A)。由於平衡桿行走測試主要用來觀察運動協調能力，較不適用於運動學習能力之測量，因此我們改用加速滾輪來檢測小鼠的運動協調能力與運動學習能力。在給藥前的敞箱測試 (pretest)中，Mecp2 點突變小鼠的總移動距離相較於野生型小鼠顯著較低 (如圖三 B, genotype effect : F(1,24) = 22.56, p < 0.0001)，平均速度也較野生型小鼠顯著低下 (如圖三 C, genotype effect : F(1,24) = 11.66, p = 0.0003)，而靜止不動的時間則較野生型小鼠高 (如圖三 D, genotype effect : F(1,24) = 18.32, p = 0.0003)，且焦慮程度也較野生型小鼠高 (如圖三 E, genotype effect : F(1,24) = 7.506, p = 0.0114)，顯示 Mecp2 點突變小鼠也有相似於瑞特氏症之運動活力低下與焦慮的表徵。前測後，將待測鼠分為四組如下，分別投予不同之藥物：1. 野生型小鼠施打生理食鹽水 (控制組) 2. 野生型小鼠施打厚朴 (實驗組) 3. Mecp2 點突變小鼠施打生理食鹽水 (控制組) 4. Mecp2 點突變小鼠施打厚朴 (實驗組)。結果發現，野生型小鼠在給藥七天後控制組與實驗組的敞箱測試的總移動距離、平均速度、靜止不動時間與焦慮程度均無顯著差異 (如圖三 B-E, p > 0.05)，顯示厚朴生藥並不影響正常小鼠之敞箱活動力。而 Mecp2 點突變小鼠在給藥七天後，其敞箱測試之總移動距離、平均速度、靜. 20.

(30) 止不動時間與焦慮程度上，實驗組與控制組相較也均無顯著差異(如圖三 B-E, p > 0.05)，顯示連續七天給予厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的運動活力低下並無改善效果。我們進而以加速滾輪測試檢測 Mecp2 點突變小鼠的運動協調與運動學習能力。給藥前測試四天的結果，在第一天與第二天 Mecp2 點突變小鼠由滾輪掉落的延宕時間較野生型小鼠顯著較短(如圖四 A,G-type effect : F(1,78) = 6.42, p = 0.0176; Time effect: F(3,78) = 15.46, p < 0.0001)，顯示 Mecp2 點突變小鼠有運動協調能力的缺失。然而在給予厚朴生藥七天後，加速滾輪測試結果顯示，野生型小鼠無論是控制組或實驗組，由滾輪掉落的延宕時間皆無顯著差異 (如圖四 B, p > 0.05)，而 Mecp2 點突變小鼠的控制組與實驗組，由滾輪掉落的延宕時間也皆無差異 (如圖四 B, p > 0.05) 。此結果顯示，連續七天給予厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的運動協調缺損並無改善效果。. 21.

(31) 圖三、厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的敞箱活動力之影響。(A)為實驗流程示意圖。一個月大的 Mecp2 點突變公鼠(KI) 及同胎之野生型小鼠(WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥(HP)或生理食鹽水(Saline)前及 7 天後，分析待測鼠之敞箱活動力。(B) 敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 敞箱測試之平均速度。(D) 待測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。 *, p < 0.05; **, p < 0.01; repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 22.

(32) 圖四、厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的加速滾輪測試表現之影響。一個月大的 Mecp2 點突變公鼠(KI)及同胎之野生型小鼠(WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水(Saline)前及 7 天後，分析待測鼠在加速滾輪上之表現。(A) 給藥前連續四天，待測鼠於加速滾輪測試中掉落延宕之時間 (單位：秒)。(B) 給藥七天後，待測鼠於加速滾輪測試中掉落延宕之秒數。柱狀圖與曲線圖均以 mean ± SEM 表示。 *, p < 0.05; 統計分析以 repeated-measured two-way ANOVA/ Bonferroni post hoc test (A) 及 student-t test (B)進行組間比較。. 23.

(33) 第三節. 厚朴生藥對 Mecp2 條件缺失公鼠運動障礙之影響. 由於紋狀體為運動控制的主要腦區，而瑞特氏症模式小鼠也具有相當嚴重的運動障礙，本次實驗選用另一種瑞特氏症模式小鼠，只剔除在前腦的 GABA 神經元上的 Mecp2，主要被剔除 Mecp2 基因的腦區為掌管運動控制的紋狀體 (Ohtsuka et al., 2008)，運用此小鼠模式來檢測在 GABA 神經元功能有所缺失的情況下，全身性給予厚朴生藥是否能夠改善運動功能的缺損。我們利用 Dlx5/6-cre 將帶有 Flox-Mecp2 的小鼠前腦中 GABA 神經元上的 Mecp2 基因剔除，得到 Mecp2 條件缺失小鼠 (conditional knockout mice, cKO; 基因型為 Mecp2flox/y; Dlx5/6-Cre/+)，並以其同胎非條件缺失小鼠 (control, Cnt’l; 基因型包括 Mecp2+/y; Dlx5/6-Cre/+; Mecp2flox+/y; +/+ ; Mecp2+/y; +/+) 做為其控制組。實驗使用一個月大的 Mecp2 條件缺失公鼠，於每天下午六點以管餵方式給予 100 mg/kg 厚朴生藥或生理食鹽水，給藥七天後進行敞箱測試與加速滾輪測試來當做運動活力、運動協調與運動學習能力之指標。待測鼠於給藥前先進行行為測試，以作為給藥前後運動能力比較之基準點，並於給藥七天之行為測試後隔天進行灌流取腦. (如圖五 A)。. 在給藥前的敞箱測試中，Mecp2 條件缺失公鼠的總移動距離相較於同胎非條件缺失公鼠顯著較短(如圖五 B, genotype effect : F(1,18) = 34.60, p < 0.0001)，平均速度顯著較慢(如圖五 C, genotype effect : F(1,18) = 26.50, p < 0.0001)，且靜止不動的時間也顯著較長(如圖五 D, genotype effect : F(1,18) = 15.43, p = 0.0010)。且由於此 Mecp2 條件缺失並不影響海馬迴或是杏仁核等掌控情緒的腦區 (Ohtsuka et al., 2008)，所以 Mecp2 條件缺失公鼠的焦慮表現並未明顯改變 (如圖五 E, p > 0.05)。這些結果顯示 Mecp2 條件缺失公鼠的確具有運動活力低下的表徵。前測之後，將待測鼠分為四組，分別投予不同之藥物如下：1.同胎非條件缺失公鼠施打生理食鹽水 (控制組); 2.同胎非條件缺失公鼠施打厚朴生藥 (實驗組); 3.Mecp2 條件缺失公鼠施打生理食鹽水 (控制組); 4. Mecp2 條件缺失公鼠施打厚朴生藥 (實驗組)。結果發現，同胎非條件缺失公鼠在給藥七天後控制組與實驗組的敞箱測試的總移動距離、平均速度、靜止不動時間與焦慮程度皆無顯著差異. 24. (如圖五 B-E, p > 0.05)，.

(34) 顯示厚朴生藥並不影響正常小鼠之敞箱活動力。而在 Mecp2 條件缺失公鼠給藥七天後的行為測試結果發現，實驗組的總移動距離與平均速度相較於控制組並沒有改善的效果 (如圖五 B-C, p > 0.05)，而靜止不動時間的百分比也並未改變 (如圖五 D, p > 0.05)，顯示連續七天給予厚朴生藥，對於 Mecp2 條件缺失公鼠的運動活力低下並無改善效果。我們接下來以，加速滾輪測試檢測 Mecp2 條件缺失公鼠的運動協調與運動學習能力。在給藥前連續測試四天的結果顯示，Mecp2 條件缺失公鼠的運動協調能力雖與正常鼠無顯著差異 (如圖六 A, genotype effect: F(1,60) = 2.47, p = 0.1319)，但是運動學習能力與同胎非條件缺失公鼠相比則有較差的趨勢 (圖六 A, genotype effect: F(1,60) = 2.47, p = 0.1319)。然而，在給予厚朴生藥七天後，同胎非條件缺失公鼠由滾輪上掉落的延宕時間與控制組相較無顯著差異 (如圖六 B, p > 0.05)，而 Mecp2 條件缺失公鼠的掉落延宕時間與控制組相較卻有增加的趨勢 (圖六 B, p = 0.0970, Student-t test)。因此，厚朴生藥對於正常鼠與 Mecp2 條件缺失公鼠的影響不同(如圖六 B, Interaction: F(1,19) = 5.66, p = 0.0280)，而其對於 Mecp2 條件缺失公鼠運動學習障礙可能有改善的效果。. 25.

(35) 圖五、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失公鼠的敞箱活動力之影響。(A)為實驗流程示意圖。一個月大的 Mecp2 條件缺失公鼠 (cKO)或同胎非條件缺失公鼠 (Cnt’l)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水 (Saline)共 7 天後，分析待測鼠之敞箱活動力。(B) 敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 箱測試之平均速度。(D) 敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 26.

(36) 圖六、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失公鼠的加速滾輪測試表現之影響。一個月大的 Mecp2 條件缺失公鼠 (cKO)或同胎非條件缺失公鼠 (Cnt’l)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水 (Saline)共 7 天後，分析待測鼠由滾輪上掉落的延宕時間 (單位：秒)。(A) 為給藥前連續四天加速滾輪測試之掉落延宕時間。(B) 給藥七天後加速滾輪測試掉落延宕之秒數。柱狀圖與曲線圖均以 mean ± SEM 表示。#, p < 0.1,以 repeated-measured two-way ANOVA (A) 與 Student-t test (B)進行統計分析。. 27.

(37) 第四節. 厚朴生藥對 Mecp2 條件缺失母鼠運動障礙之影響. 且由於瑞特氏症好發於女性孩童，所以我們也檢測 Mecp2 條件缺失母鼠的運動活力與運動協調學習能力是否也能經由厚朴藥物處理後達到改善的效果。由於瑞特氏症模式雌性小鼠發病的時間較雄性小鼠延遲 (Guy et al., 2001) ，所以此次實驗中所使用的 Mecp2 條件缺失母鼠選用的年紀為四到五個月大的小鼠。在此將檢測四到五個月大的 Mecp2 條件缺失母鼠，於每天下午六點以管餵方式給予 100 mg/kg 厚朴生藥，給藥七天後進行敞箱測試與加速滾輪測試來當做運動活力與運動協調能力之指標。待測鼠於給藥前先進行行為測試，以作為給藥前後運動能力比較之基準點，並於給藥七天之行為測試後隔天進行灌流取腦 (如圖七 A)。在給藥前的敞箱測試中， Mecp2 條件缺失母鼠的敞箱行為測試中的總移動距離顯著的較同胎非條件缺失母鼠低下 (如圖七 B, genotype effect : F(1,42) = 75.75, p < 0.0001)，平均速度也顯著的較同胎非基因缺失小鼠慢 (如圖七 C, genotype effect : F(1,42) = 25.47, p < 0.0001)，靜止不動的時間 Mecp2 條件缺失母鼠的控制組也顯著的較同胎非條件缺失母鼠來得多 (如圖七 D, genotype effect : F(1,42) = 19.31, p < 0.0001)，且焦慮程度也無顯著差異 (如圖七 E, genotype effect : F(1,42) = 0.74, p = 0.3948)，其結果顯示 Mecp2 條件缺失母鼠也具有運動活力低下表徵。前測後，將待測鼠分為四組如下，分別投予不同之藥物：1. 同胎非基因缺失母鼠施打生理食鹽水 (控制組) 2. 同胎非基因缺失母鼠施打厚朴 (實驗組) 3. Mecp2 條件缺失母鼠施打生理食鹽水 (控制組) 4. Mecp2 條件缺失母鼠施打厚朴 (實驗組)。結果發現，同胎非條件缺失母鼠在給藥七天後控制組與實驗組的敞箱測試的總移動距離、平均速度、靜止不動時間與焦慮程度皆無顯著差異. (如圖七 B-E, p > 0.05)，而 Mecp2. 條件缺失母鼠給藥七天後行為結果發現，控制組與實驗組的敞箱測試的總移動距離、平均速度、靜止不動時間與焦慮程度也皆無顯著差異 (如圖七 B-E, p > 0.05)，此結果顯示連續七天給予厚朴並無法改善 Mecp2 條件缺失母鼠的運動活力低下。加速滾輪測試檢測 Mecp2 條件缺失母鼠的運動協調與運動學習能力。在給藥前測試四天的結果，Mecp2 條件缺失母鼠的運動學習能力較同胎非基因缺失母鼠來得差. 28.

(38) (圖八 A, Time effect: F(3,132) = 31.92, p < 0.0001, genotype effect: F(1,132) = 8.00, p=0.0070)，顯示 Mecp2 條件缺失母鼠有運動學習能力的缺失。然而在給藥七天後加速滾輪測試結果，同胎非條件缺失母鼠的控制組與實驗組，在滾輪上延宕掉落的時間皆無顯著差異 (如圖八 B, p > 0.05)，且在給藥後 Mecp2 條件缺失母鼠的實驗組與控制組仍無顯著差異 (如圖八 B, p > 0.05)，顯示厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失母鼠的運動學習能力缺失並沒有改善的效果。綜合以上所述，在四到五個月大的 Mecp2 條件缺失母鼠接受連續七天的厚朴處理後，並沒有看到類似於一個月大的雄性 Mecp2 條件缺失公鼠改善運動學習能力趨勢之效果。. 29.

(39) 圖七、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失母鼠的敞箱活動力之影響。(A)為實驗流程示意圖。四到五個月大的 Mecp2 條件缺失母鼠 (cKO)與同胎非條件缺失母鼠 (Cnt’l)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水 (Saline)前及 7 天後，分析待測鼠之敞箱活動力。(B) 敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 待測鼠於敞箱測試之平均速度。(D) 待測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 30.

(40) 圖八、厚朴生藥對於 Mecp2 條件缺失母鼠的加速滾輪測試表現之影響。四到五個月大的 Mecp2 條件缺失母鼠 (cKO)與同胎非條件缺失母鼠 (Cnt’l)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水 (Saline)前及 7 天後，分析待測鼠由滾輪上掉落的延宕時間。(A)為給藥前連續四天加速滾輪測試掉落延宕之秒數。(B)為給藥七天後加速滾輪測試掉落延宕之秒數。柱狀圖與曲線圖均以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 31.

(41) 第五節. 和厚朴酚合成純化物對 Mecp2 點突變公鼠運動障礙之影響. 為進一步驗證厚朴生藥對運動障礙的改善效果，我們接下來測試厚朴純化後的有效成分－和厚朴酚合成純化物 (MH101)是否對運動行為有所影響。根據先前研究和厚朴酚 (Honokiol)的使用方式(Fried et al., 2009)更改打藥的時間，以腹腔注射給予一個月大的 Mecp2 點突變公鼠 1 mg/kg MH101 90 分鐘後，進行行為測試 (如圖九 A)。待測鼠分為四個組別接受藥物處理，分別為 1.野生型小鼠施打生理食鹽水(控制組); 2.野生型小鼠施打 MH101 (實驗組); 3.Mecp2 點突變公鼠施打生理食鹽水 (控制組); 4.Mecp2 點突變公鼠施打 MH101 (實驗組)。在給藥前的敞箱測試中，Mecp2 點突變小鼠控制組與實驗組總移動距離顯著的較野生型小鼠低下 (如圖九 B, genotype effect : F(1,20) = 16.44, p = 0.0006)，平均速度無顯著差異(如圖九 C, genotype effect : F(1,20) = 2.15, p =0.1579)，靜止不動時間則顯著高於野生型小鼠 (如圖九 D, genotype effect : F(1,20) = 7.44, p = 0.0130)，且停留在中間區域時間百分比也顯著高於野生型小鼠 (如圖九 E, genotype effect : F(1,20) = 10.43, p = 0.0042)，結果顯示 Mecp2 點突變小鼠具有運動活力低下與焦慮之表徵。給藥後，野生型小鼠的控制組與實驗組之總移動距離、平均速度、靜止不動時間百分比與待在中間區域時間百分比皆無顯著差異 (如圖九 B-E, p > 0.05)，且 Mecp2 點突變小鼠給藥七天後行為結果發現，控制組與實驗組的移動總距離、平均速度、靜止不動時間的百分比與待在中間區域的時間也沒受到改變 (如圖九 B-E, p > 0.05)，此結果顯示，行為測試前九十分鐘給予 MH101 並無法改善 Mecp2 點突變小鼠的運動活力低下。而在連續四天給予 MH101 後 90 分鐘進行的加速滾輪測試中，Mecp2 點突變小鼠的掉落延宕時間與控制組並無顯著差異 (如圖十 A, p > 0.05)，而野生型小鼠在給與藥物後掉落延宕時間較其控制組鼠有較短的趨勢，甚至在第三天時達到顯著差異 (如圖十 A, p < 0.05)。此結果顯示給予和厚朴酚合成純化物並無法改善 Mecp2 點突變小鼠之運動學習與運動協調能力低下，甚至損害了野生型小鼠的運動協調與運動學習能力。. 32.

(42) 圖九、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 點突變小鼠的敞箱活動力之影響。(A)為實驗流程示意圖。一個月大的 Mecp2 點突變公鼠 (KI)與同胎野生型公鼠 (WT)接受腹腔注射投予 1 mg/kg 和厚朴酚合成純化物 (MH101)或生理食鹽水 (Saline) 前及五天後，分析待測鼠之敞箱活動力。(B) 待測鼠進行敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 待測鼠於敞箱測試之平均速度。(D) 待測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。*, p < 0.05; **, p < 0.01; repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 33.

(43) 圖十、和厚朴酚合成純化物對於 Mecp2 點突變公鼠的加速滾輪表現之影響。四到五個月大的 Mecp2 點突變公鼠 (KI)與同胎野生型公鼠 (WT)連續 4 天接受腹腔注射投予 1 mg/kg 和厚朴酚合成純化物 (MH101)或生理食鹽水 (Saline) 90 分鐘後，分析待測鼠由滾輪上掉落的延宕時間 (單位：秒)。曲線圖以 mean ± SEM 表示。#表示野生型小鼠控制組與實驗組之比較, *表示野生型小鼠控制組與 Mecp2 點突變小鼠控制組之比較。 #, p < 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。. 34.