第二章 材料與方法
第三節 基因轉殖鼠之基因型鑑定
一、 基因組去氧核醣核酸 (Genomic DNA)之萃取
小鼠出生後 3 週離乳時剪取尾端 3~5 mm 長度之組織，放入 300 ul 溶解緩衝 液 (Lysis Buffer，含有 0.5M Tris-HCl、0.1M EDTA、0.1M NaCl 及 1%SDS)中，
加入 1.5ul 蛋白酶 K (proteinase K, Amresco)後，於 55℃置放至少 4 小時，使組 織完全溶解於緩衝液中。而後加入 3 ul 核醣核酸酶 (RNaes, Amresco)，於 37℃
反應 30 分鐘將 RNA 去除。加入 100 ul 蛋白質沉澱液 (protein precipitation solution, Promega)，混合均勻後放置冰上 5 分鐘，以 13000 r.p.m.高速離心 10 分鐘，將 300 ul 上清液抽取出後放入新管，此溶液即含有要萃取之 DNA。之後
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色體互換 (Homologus recombination)之原理得到點突變之小鼠，使第 158 個 胺基酸由 T 變為 A (Goffin et al., 2012)，所有小鼠皆運用 PCR 技術來完成小 鼠基因型鑑定。PCR 反應條件如下：進行 94℃5 分鐘，再以 94℃30 秒、60℃40 秒及 72℃60 秒循環 35 次後，進行 72℃5 分鐘。反應完成後，Mecp2 T158A 點 基因突變鼠之 PCR 產物將會在 1.5%電泳凝膠上分離出 691bp 之片段。
3. Dlx5/6-Cre 基因轉殖鼠之基因型鑑定：Dlx5/6-Cre 基因轉殖鼠是在 Dlx5/6 啟動 子後插入 Cre 基因重組酶之基因轉殖鼠 (Monory et al., 2006)。所有小鼠皆使 用 PCR 技術來完成基因型鑑定。PCR 反應條件如下：進行 94℃3 分鐘，再以 94℃30 秒、64℃60 秒及 72℃60 秒循環 35 次後，進行 72℃5 分鐘。反應完成 後，Cre 基因轉殖小鼠之 PCR 產物將會在 1.5%電泳凝膠上分離出 320bp 之片 段。
4. Flox-Mecp2 基因轉殖鼠之基因型鑑定：Flox-Mecp2 基因轉殖鼠是在 Mecp2 基 因的 exon3 前後插入 loxP 序列之基因轉殖鼠 (Chen et al., 2001)。所有小鼠皆
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immobility time)、停留在中心區域的時間比例 (% time in central arena)。並利用 two-way ANOVA 與 Bonferroni post hoc 事後分析來比較經由不同藥物處理與不同基 因突變的小鼠各組之間表現的差異。 小鼠的測試。並利用 two-way ANOVA 與 Bonferroni post hoc 事後分析來比較經由不 同藥物處理與不同基因突變的小鼠各組之間表現的差異。
三、 加速滾輪測試 (accelerating rotarod, RTR)
在測試的第一天，小鼠會先在加速滾輪儀器上 (PanLab，Spain)以固定的 4 r.p.m.
轉速訓練 30 秒。小鼠回到原飼養籠等待 30 分鐘後，開始接受加速滾輪測試，此時滾 輪轉速設定為 5 分鐘內從 4 r.p.m.加速到 40 r.p.m.。小鼠每天會有 3 次的測試，每次
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測試間隔為 30 分鐘，連續測試 4 天。其中只在第一天測驗前，會先進行一次的固定轉 速的訓練。每當小鼠從滾輪上掉落後，機器會自動記錄掉落的時間與當時的轉速，再 從每天測試三次的結果數值取出中位數 (median)來進行統計分析。並利用 two-way ANOVA 與 Bonferroni post hoc 事後分析來比較經由不同藥物處理與不同基因突變的 小鼠各組之間表現的差異。
四、 行為實驗之統計分析
所有厚朴生藥、和厚朴酚合成純化物與 DAMGO/Raclopride 藥物處理之行為測驗、
體重皆使用 two-way ANOVA 分析、Bonferroni post-hoc 事後分析與 Student-t test 來檢測不同基因型的小鼠在藥物操弄下實驗組與控制組之表現差異。
第五節 腦部藥物注射之立體定位手術
首先使用嚙齒動物麻醉機 (matrix vip 3000, Midmark)將異氟醚 (isoflurane, Baxter U.S.)以每分鐘氣化 5 毫升的汽化速率，將小鼠麻醉後，將其頭皮上的毛髮以電 動剃刀去除，再將小鼠固定於立體定位儀 (stereotaxic apparatus, KOPF)上，並將麻 醉機的汽化速率調降至每分鐘氣化 1.5 毫升，確保其呼吸平順。將小鼠頭皮劃開後，
使用 1%雙氧水將其頭蓋骨消毒並清除血漬，依據前囟門 (Bregma)位置定位出座標前 後 (AP) +1.5 mm，左右 (ML) -0.5 mm 的位置，以迷你電鑽 (Octopus)將頭骨鑽一小 洞，再用針頭將腦膜挑破，並在前端固定一小螺絲，然後將給藥膠囊塞入小鼠背部皮 下，再將膠囊之注射導管以立體定位儀埋入上述座標並插至深度 (DV) -3.5 mm 處。
最後使用牙粉 (dental cement, Tempron)，將腦部注射導管固定在小鼠頭上，待牙科 膏乾燥硬化後，將小鼠由立體定位儀上取下，並以電暖器加熱防止失溫直到麻醉消退，
其後每天觀察並記錄體重以確認其術後恢復良好。
第六節 免疫組織染色
一、 腦組織的灌流固定與切片
使用異氟醚氣體麻醉小鼠後，將小鼠固定於一平板上，以鑷子夾起胸腔表皮後，
剪開胸腔及橫隔膜，露出心臟。利用幫浦 (MasterFlex, USA)將生理食鹽水灌流入左 心室 3 分鐘，確認移除全身血液後，再以固定液 4%多聚甲醛 (paraformaldehyde, Sigma)灌流十分鐘。取出灌流完成之鼠腦浸泡於固定液中，在 4℃進行後固定
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（post-fixation）至少 16 小時，再浸泡於 30% 糖水 (sucrose in PBS)中兩天，再將 腦組織急速冷凍儲存於-80℃冰櫃中。腦組織切片時，利用冷凍切片機 (S3050, Leica) 以冠狀切面切出厚度20μm 的切片，保存於含有 0.1%的疊氮化鈉 (sodium azide, Merck)的 0.1M 磷酸鹽緩衝液 (phosphate buffer, PB)中，直到進行組織染色。
二、 免疫組織染色
將組織切片以 0.1M 磷酸鹽緩衝鹽水 (phosphate buffered saline ,PBS)清洗 3 次，
而後浸泡在於 0.2%Triton X-100/PBS 溶液中 10 分鐘將細胞穿孔，再放入 10%甲醇 (Methanol)/3%過氧化氫 (H2O2)混合液中去除內生性過氧化物酶 (peroxidase)。清洗 3 次後，以 3%山羊血清 (Normal goat serum)溶液去除背景，再加入初級抗體反應至 少 16 小時。初級抗體為 polyclonal rabbit anti-c-Fos antibody (1:10k,
Millipore,#PC38) 。反應完成後，先以 0.1M PBS 清洗 4 次，再放入二級抗體中反應 2 小時。二級抗體分別為 biotinylated goat anti-rabbit 及 biotinylated horse anti-mouse (1:500, Vector)。反應完後以 0.1M PBS 清洗 4 次，然後於 Avidin-Biotin Complex (Vector)溶液中反應兩小時將訊號放大。以 0.1M 鈉鉀磷酸鹽緩衝液 (Na-K PB)清洗 2 次後，浸泡於含有二氨基聯苯胺 (Diaminobenzidine, DAB)/銨鎳硫酸鹽 (Nickel ammonium sulfate) 的緩衝液中，加入 0.06% H2O2呈色。呈色完畢後，以 0.1M Na K PB 溶液將組織切片清洗完全，貼到載玻片上，經由酒精 (ethanol)與二甲苯 (Xylene, Merck)脫水後 ，以封片膠蓋上蓋玻片。最後，利用正立顯微鏡 (Axio Imager D2, Zeiss, Germany)觀察組織切片，並以 CCD 相機 (C10600，Hamamatsu, Japan)拍照存檔與 分析。
三、 cFos 細胞計數定量分析
經由和厚朴酚合成純化物處理後的組織切片為每 24 片挑一片，挑選出 Bregma 1.18 與 0.14 mm 處的切片做定量分析。首先，在前腦前端 (Bregma 1.18mm)之切片 選取扣帶腦回 (cingulate cortex, Cg)、初級運動皮質 (motor cortex, M1)、梨狀皮質 (piriform cortex, PC)、內背側紋狀體 (dorsal-medial striatum, dmST); 而在前腦後端 (Bregma 0.14 mm)之切片則選取 Cg、初級感覺皮質 (primary somatosensory cortex, S1)、PC、dmST 與外背側紋狀體 (dorsal-lateral striatum, dlST)來計算細胞數目。細
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胞數目之定量，是在皮質各腦區 (Cg, M1, PC, S1)的相同位置處選取一個 100 x 100 um 的矩型區域，並計算此面積中所包含的 cFos＋細胞總數。而由於 dmST 與 dlST 之 cFos＋細胞較稀疏，故在 20 倍物鏡的相同視野下，計算整個視野內的紋狀體中所觀察 到的 cFos＋細胞總數。最後利用 two-way ANOVA 及 Bonferroni post hoc 事後分析來 檢測是否藥物處理對特定腦區之神經活性 (cFos+細胞數)有所影響。
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第三章 結果
第一節 厚朴生藥對 Mecp2 基因剔除公鼠運動障礙之影響
本實驗所使用的一個月大的雄性 Mecp2 基因剔除小鼠，為目前研究瑞特氏症最常 被使用的動物模型之一，此小鼠模式具有運動能力低下與運動協調能力低下的表徵 (Guy et al., 2001)。我們利用此基因剔除小鼠來測試給予厚朴生藥 (cortex Magnoliae, How-Pow, HP)是否能對於運動活力與運動協調障礙有所改善。
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圖一、厚朴生藥對於 Mecp2 基因剔除小鼠的敞箱活動力之影響。(A) 實驗流程示意圖。
一個月大的 Mecp2 基因剔除公鼠(KO)及同胎之野生型小鼠(WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥(HP)或生理食鹽水(Saline)共 14 天，在投藥前及 7 天、14 天後分析待 測鼠之敞箱活動力。(B) 待測鼠進行敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 待測鼠於敞 箱測試之平均速度。(D) 待測鼠於敞箱測試時靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在 敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean ± SEM 表示 *, p < 0.05; **, p < 0.01, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post-hoc test。
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圖二、厚朴生藥對於 Mecp2 基因剔除小鼠的平衡桿行走測試表現之影響。 (A) 實驗 流程示意圖。一個月大的 Mecp2 基因剔除公鼠 (KO)及同胎之野生型小鼠 (WT)接受 管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥 (HP)或生理食鹽水 (Saline)共 14 天，在投藥前及 7 天、
14 天後分析待測鼠之平衡桿行走表現。 (B)為待測鼠於平衡桿上行走到達標的所花的 時間。(C)為到達標的之速度。柱狀圖以 mean ± SEM 表示。**, p < 0.01; ***, p < 0.001, repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
20 症患者的模式小鼠 (Goffin et al., 2012; Chao & Zoghbi, 2012)。基於前節之實驗結果：
厚朴生藥給予七天即可有效改善 Mecp2 基因剔除小鼠運動協調之缺陷，我們推測厚朴
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止不動時間與焦慮程度上，實驗組與控制組相較也均無顯著差異(如圖三 B-E, p > 0.05)，
顯示連續七天給予厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的運動活力低下並無改善效果。
我們進而以加速滾輪測試檢測 Mecp2 點突變小鼠的運動協調與運動學習能力。給 藥前測試四天的結果，在第一天與第二天 Mecp2 點突變小鼠由滾輪掉落的延宕時間較 野生型小鼠顯著較短(如圖四 A,G-type effect : F(1,78) = 6.42, p = 0.0176; Time effect:
F(3,78) = 15.46, p < 0.0001)，顯示 Mecp2 點突變小鼠有運動協調能力的缺失。然而在
給予厚朴生藥七天後，加速滾輪測試結果顯示，野生型小鼠無論是控制組或實驗組，
由滾輪掉落的延宕時間皆無顯著差異 (如圖四 B, p > 0.05)，而 Mecp2 點突變小鼠的 控制組與實驗組，由滾輪掉落的延宕時間也皆無差異 (如圖四 B, p > 0.05) 。此結果 顯示，連續七天給予厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的運動協調缺損並無改善效果。
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圖三、厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的敞箱活動力之影響。(A)為實驗流程示意圖。
一個月大的 Mecp2 點突變公鼠(KI) 及同胎之野生型小鼠(WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥(HP)或生理食鹽水(Saline)前及 7 天後，分析待測鼠之敞箱活動力。(B) 敞箱測試 12 分鐘之總移動距離。(C) 敞箱測試之平均速度。(D) 待測鼠於敞箱測試時 靜止不動之時間百分比。(E) 待測鼠在敞箱中央區之停留時間百分比。柱狀圖以 mean
± SEM 表示。 *, p < 0.05; **, p < 0.01; repeated-measured two-way ANOVA, Bonferroni post hoc test。
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圖四、厚朴生藥對於 Mecp2 點突變小鼠的加速滾輪測試表現之影響。一個月大的
Mecp2 點突變公鼠(KI)及同胎之野生型小鼠(WT)接受管餵投予 100 mg/kg 厚朴生藥
(HP)或生理食鹽水(Saline)前及 7 天後，分析待測鼠在加速滾輪上之表現。(A) 給藥前 連續四天，待測鼠於加速滾輪測試中掉落延宕之時間 (單位：秒)。(B) 給藥七天後，待測鼠於加速滾輪測試中掉落延宕之秒數。柱狀圖與曲線圖均以 mean ± SEM 表示。
*, p < 0.05; 統計分析以 repeated-measured two-way ANOVA/ Bonferroni post hoc test (A) 及 student-t test (B)進行組間比較。
24 基因剔除，得到 Mecp2 條件缺失小鼠 (conditional knockout mice, cKO; 基因型為
Mecp2
flox/y; Dlx5/6-Cre/+25
顯示厚朴生藥並不影響正常小鼠之敞箱活動力。
而在 Mecp2 條件缺失公鼠給藥七天後的行為測試結果發現，實驗組的總移動距離 與平均速度相較於控制組並沒有改善的效果 (如圖五 B-C, p > 0.05)，而靜止不動時間 的百分比也並未改變 (如圖五 D, p > 0.05)，顯示連續七天給予厚朴生藥，對於 Mecp2 條件缺失公鼠的運動活力低下並無改善效果。
我們接下來以，加速滾輪測試檢測 Mecp2 條件缺失公鼠的運動協調與運動學習能 力。在給藥前連續測試四天的結果顯示，Mecp2 條件缺失公鼠的運動協調能力雖與正 常鼠無顯著差異 (如圖六 A, genotype effect: F(1,60) = 2.47, p = 0.1319)，但是運動學習 能力與同胎非條件缺失公鼠相比則有較差的趨勢 (圖六 A, genotype effect: F(1,60) =
我們接下來以，加速滾輪測試檢測 Mecp2 條件缺失公鼠的運動協調與運動學習能 力。在給藥前連續測試四天的結果顯示，Mecp2 條件缺失公鼠的運動協調能力雖與正 常鼠無顯著差異 (如圖六 A, genotype effect: F(1,60) = 2.47, p = 0.1319)，但是運動學習 能力與同胎非條件缺失公鼠相比則有較差的趨勢 (圖六 A, genotype effect: F(1,60) =