儀器規格

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第九節、 腦區分離技術

本論文實驗共分離三種腦區，分別為海馬迴、杏仁核和小腦。腦區分離技術 是參考 Seibenhener 和 Wooten 研究文獻(Seibenhener and Wooten, 2012)。在實驗 完後一個小時(Garelick et al., 2009)，利用二氧化碳昏迷小鼠，接著使用手術剪 刀將其頭顱剪下。再來剪開頭皮裸露出頭蓋骨，利用小手術剪刀將頭蓋骨翻開，

取出整個鼠腦。取出後先將其浸泡至一倍的 phosphate buffered saline(80g NaCl, 2g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4g KH2PO4 pH=7.2)，並且放置在冰上 3 至 5 分鐘。接 下來先將腦稍微擦乾，將腦剖成左右半腦，分別將海馬迴、杏仁核和小腦分離 取下。腦區取下後冰至-80°C 冰箱以利於之後分析。

第十節、 血液樣本採集

血液樣本採法是參考 Wu 等人的研究文獻(Wu et al., 2003b)。在實驗後 60 分 鐘，利用二氧化碳昏迷小鼠，接著使用手術剪刀將其胸腔剪開，利用針管將心 臟的血抽至抽至針頭內。接著將血液注入到 1.5ml 滅菌過離心管，在 12000rpm、

4°C下離心 5 分鐘，然後取出上清液冰至 80°C 冰箱以利於之後分析。

第十一節、 高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

一、 儀器規格

本實驗所使用的高效液相層析儀包括 S1122 HPLC pump、S5200 Autosampler 和 VT-03 electrochemical flow cell。所使用的 column 為 Alltima C18(Sykam Corp.)。幫浦流速為 1 ml/min，碳電極設在 0.51v，參考電極為 Ag/AgCl，固定 相(stationary phase)為 U-Bondapak C18 precolumn。每次注入的樣本量為 20µl。

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二、 分析方法

高效液相層析法是參考 Norcross 等人的研究文獻(Norcross et al., 2008)。首先 將要分析的樣本加入含 0.4 mM Na2S2O4之過濾酸溶液(70 mg/L in perchloric acid, Sigma Company Corp.)中加以稀釋。本實驗所使用的流動相(mobile phase)組成包 含[13.8 g/L NaH2PO4ŸH2O (Merk Corp.), 160 mg/L sodium octane sulfonate (Merk Corp.), 10 mg/L EDTAŸ2H2O (Merk Corp.), 100 ml/L MeOH (Merk Corp.), 149.2 mg/L KCl (J.T.Baker Corp.)] ，再利用 NaOH 或是 H3PO4調整 pH=3.0。在分析實 驗樣本前會先以 20%甲醇沖洗 column 和樣本注射管半個小時，待機器穩定後，

則開始分析實驗樣本。本實驗主要是分析血液中的血清素， 分析時間大概在 25 到 30 分鐘。 參考樣本(standard)由血清素鹽酸(hydrochloride)三種濃度 0.02 mg/kg、0.004 mg/kg、 0.0008 mg/kg(Sigma Chemical Company)和過濾酸溶液按 比例混合加以稀釋而成，實驗血液樣本則為 50µl 血液和 200µl 過濾酸溶液混和 稀釋而成，最後透過 HPLC 分析軟體 Clarity(Data Apex Corp.)加以積分分析。分 析結果匯入至 EXCEL 製作參考樣本曲線並繪成回歸曲線方程式(Y=18403x-6.6624, R²=0.99)。實驗血液樣本結果最後以此回歸曲線方程式換算後得到樣本 血液中血清素濃度。

第十二節、 西方點墨法(Western Blotting)

一、 蛋白質萃取及定量分析

在樣本腦區取下後， 收取至 1.5ml 滅菌過離心管，加入適量含有蛋白酶抑制

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polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

此實驗乃利用蛋白質之間分子量之差異，在由丙烯醯胺與甲叉雙丙烯醯胺 (methylene-bisacrylamide)形成孔洞之膠體中進行分離。測完樣本液蛋白質濃度 後，取 50µg 蛋白質量和蛋白質樣品緩衝液(35mM Tris-HCl pH=7.0, 1mM EDTA, 2% SDS, 0.002% bromophenol blue, 5.76mM β-mercaptoethanol)於 95°C 加熱 5 分 鐘，接著放在冰上 1 分鐘，最後以最高轉速離心 1 分鐘。接著把配好的樣本液 注於 10% SDS-PAGE(Thermo Scientific)。完成後，再以電泳緩衝液(running buffer , 50mM Tris , 380mM glycine, 0.1% SDS)，以 90V 進行上層 stacking gel 電 泳約 30 分鐘，待通過上層膠後，以 130V 進行下層 separating gel 電泳約 2 小時。

在進行轉移之前，會先以 methanol 浸泡 membrane(Millipore)大約 30 秒，再和 濾紙一起浸泡轉移緩衝液(transfer buffer, 25mM Tris, 192mM glycine, 10%

methanol)，完後以轉移緩衝液在 70V 、240mA 進行轉移約 2 小時。在進行轉移 完後，以 5%牛奶(anchor, 安佳脫脂奶粉)進行 blocking 約 1 小時，完後即可加入 初級抗體。本實驗所使用抗體為 rabbit anti-phospho-(Ser/Thr) PKA substrate antibody(1:2000, Cell Signaling) 、 rabbit anti-phospho-PKAc(Thr197) antibody(1:2000, Cell Signaling)、rabbit anti-PKAα/β/γ cat (H-56) antibody(1:2000, Santa Cruz) 、rabbit anti-actin antibody(1:15000, Thermo Scientific)，皆以 tris-buffered saline and tween 20(TBS-T, 50mM Tris, 150mM NaCl, 0.05% tween 20 pH=7.6)稀釋成所需濃度，在 4°C 下放過夜。第二天用 TBS-T 沖洗 3 次每次 10

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在室溫下反應 1 小時，再以 TBS-T 沖洗 3 次每次 10 分鐘。最後加入 ECL kit 呈 色 劑 (1:1, 2 ml/membrane, Thermo Scientific) 反 應 約 1 分 鐘 即 可 。 接 著 將 membrane 放置在壓片夾(Okamoto Manufacturing Corp.)中，並利用 X-光片(Fuji Corp.)在暗房內曝光，最後以壓片機(Kodak X-OMAT 2000) 將 X-光片洗出。

第十三節、 統計分析

本實驗結果數據利用 EXCEL 和 StatPlus 統計軟體進行分析。本論文中實驗在 比較單一實驗組與單一對照組之間差異時，利用 Student’s t-test 統計方式來進行 分析，當實驗組別為三組或是三組以上時，則使用 StatPlus 軟體中的單因子變 異數分析變異數分析(One-way analysis of variance with repeated measure, one-way ANOVA)進行統計分析。

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第三章 實驗結果

第一節、 飲食操弄對於小鼠體重及食量變化之影響

在小鼠成長至 6 到 8 週後，控制組別持續維持每天給予充分的飲食(fed ad libitum)，卡路里節制組則開始進行卡路里節制，飲食量減為控制組別的 60%，

而高脂肪組則把食物換成高脂肪食物，並且也是每天給予充分的食量。三個組 別在飲食操弄下持續 6 到 10 週，並且在操弄期間每天測量小鼠體重變化量及飲 食量。在 6 週的體重及食量監測下，控制組別前後體重變化量為增加 20.7%，

高脂肪組別前後體重變化量為增加 28.4%，卡路里節制組別前後體重變化量為 減少 19.9%(圖六 A)。在飲食操弄後從第 6 天起卡路里節制組別因受到食量控制 的影響體重開始顯著比控制組別和高脂肪組別低，並且隨著食量控制的天數增 加，持續擴大差距。而控制組別和高脂肪組別之間體重則沒有任何顯著上的差 異。

在飲食操弄期間，控制組別和高脂肪組別在食量的變化上沒有任何顯著上的 差異，控制組別平均每隻小鼠每天的食量大約為 3.5±0.06g，高脂肪組別平均每 隻小鼠每天的食量大約為 3.1±0.05g。卡路里節制組別食量則控制在平均每隻小 鼠每天 2.3±0.001g，大約為控制組別食量的 60%( 圖六 B)。

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(A)

(B)

0   5   10   15   20   25   30  

Week1   Week2   Week3   Week4   Week5   Week6  

Mice  Weight  (g)  

Control  Avg.  

CR  Avg.  

HF  Avg.  

+28.4%  

+20.7%  

Satrting  CR  

-­‐19.9%  

*  

3   4   5   6  

Control  Avg.  

CR  Avg.  

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組別在連續 6 週的體重變化。卡路理節制組自第 6 天起體重顯著比控制組和高 脂肪組低(B)圖顯示三種飲食操弄組別在連續 6 週平均每隻小鼠每天的食量。每 組 n=45，實驗結果以 One-Way ANOVA 統計方法計算，*表示 p<0.05。

第二節、 飲食操弄對於小鼠在 Elevated T Maze 作業中學習與記憶的影響

在小鼠進行飲食操弄後 6 到 10 週，首先利用 elevated t maze 作業去探討不同 的飲食狀況對於小鼠在學習能力與記憶能力表現有無差異。結果發現，在學習 能力的表現上卡路里節制組別的小鼠平均只需要 3.6±0.27 次即可學會在 300 秒 內都待在 enclosed arm 而不要跑出去 open arm，表現顯著比控制組別和高脂肪 組別來的好(Control : 6.5±0.36 ; HF : 8.2±0.45)，而高脂肪組別在學習能力上則顯 著差於控制組別(圖七 A, B)。另外，在學習階段利用危險指標可以作為輔助判 斷學習好壞的資訊。結果發現卡路里節制組別的小鼠平均危險指標為 0.79±0.05，

顯著優於控制和高脂肪組別，而控制組別又顯著比高脂肪組別好(Control : 0.6±0.05 ; HF : 0.27±0.07)(圖七 C)，結果符合實際的學習能力狀況。

而在小鼠測量完學習表現後 24 小時，再把小鼠放回到 enclosed arm 測量在

300 秒內其所待的時間作為記憶能力好壞的判斷。結果發現卡路里節制組別的

小鼠平均表現為 251.1±24.67 秒，顯著優於控制組別和高脂肪組別(Control : 148.88±34.11秒 ; HF : 137.68±33.03 秒)。然而，控制組和高脂肪組在記憶能力 表現上則沒有顯著上的差異(圖七 D)。

‧

Cumulative  Inhibitory   Avoidance  (seconds)  

Trials  

Learn in g  Performan ce   (trials)  

Control  

‧

(A)圖顯示三種飲食操弄組在學習階段的表現，以 cumulative inhibitory avoidance 表示。(B)圖顯示三種飲食操弄組在學習階段平均所需要的學習次數。(C)圖顯 示三種飲食操弄組在學習階段的危險指標。(D)圖顯示三種飲食操弄組在記憶階 段的表現，以 avoidance latency 表示。實驗結果以 mean±SEM 表示，每組 n=18，

統計結果以 One-way ANOVA 統計方法計算。*表示 p<0.05，**表示 p<0.01，

***表示 p<0.001。

Risk  In dex  

Control  

CR  

dance  Lantency   (secon

ds)  

Control  

CR     HF    

**   ***  

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第三節、 飲食操弄對於小鼠在 Passive Avoidance 作業中恐懼記憶的影響

在小鼠進行飲食操弄後 6 到 10 週，利用另外一項行為作業 passive avoidance 來驗證飲食操弄對於恐懼記憶能力表現的影響。實驗結果發現在第 1 天的表現 上，三種飲食操弄對於小鼠進入 dark compartment 的時間沒有任何顯著上的差 異(Control : 23.27±3.75 秒 ; CR : 26.22±8.04 秒 ; HF : 35.61±9.32 秒)，代表食物 操弄並不會影響小鼠對於黑暗環境的偏好性(圖八 A)。在第一天小鼠進入 dark compartment被電擊後 24 小時，再把小鼠放回 white compartment 測量其在 300 秒內進入 dark compartment 的時間以作為記憶能力好壞的判斷。結果發現卡路 里節制組別的小鼠記憶能力表現為 246.06±12.71 秒，表現顯著優於控制組別和 高脂肪組別(Control : 149.14±21.83 秒 ; HF : 80.23±25.92 秒)，而控制組別和高脂 肪組別在記憶能力表現上沒有任何顯著差異(圖八 B)。

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圖八、飲食操弄對於小鼠在 Passive Avoidance 作業中記憶表現的影響。(A) 圖顯示在第 1 天三種飲食操弄組進入 dark compartment 的時間。(B)圖顯示三種 飲食操弄組在記憶階段的表現，以 avoidance latency 表示。實驗結果以 mean±SEM 表示，每組 n=14-15，統計結果以 One-way ANOVA 統計方法計算。

***表示 p<0.001。

Latency  To  Dark  Compartment   (seconds)  

1

^st

 Trial  

Avoidance  Latency  (seconds)  

2

^nd

 Trial  

Control   CR   HF  

***   ***  

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第四節、 飲食操弄對於小鼠在 Novel Object Recognition 作業中物體辨認記憶 的影響

在小鼠進行飲食操弄後 6 到 10 週，以第三個行為作業 novel object recognition

test 來證明飲食操弄對於小鼠物體辨認記憶能力表現的影響。本實驗共運用了

訓練後的四個時間點(0.5 小時、1、2 和 3 小時)分別測量記憶能力。實驗結果發 現控制組別在 0.5 小時、1 和 2 小時三個時間點，都能夠顯著的區分探索過的物 體和全新的物體(0.5 小時 : 43% vs 56% ; 1 小時 : 25% vs 75% ; 2 小時 : 37% vs

63%)，不過在 3 小時的時間點，則無法顯著區分探索過的物體和全新的物體

(59% vs 41%)。同時也代表控制組別對於物體辨認記憶可以維持到 2 小時。而 卡路里節制組別在四個時間點都可以顯著的區分探索過的物體和全新的物體(0.5 小時 : 37% vs 63% ; 1 小時 : 23% vs 77% ; 2 小時 : 22% vs 78% ; 3 小時 : 23% vs 77%)，顯示卡路里節制組別對於物體辨認記憶可以維持到 3 小時甚至是更長。

高脂肪組別則只有在 0.5 小時一個時間點能夠顯著區分探索過的物體和全新的 物體(33% vs 67%)，其他三個時間點都無法顯著區分(1 小時 : 51% vs 49% ; 2 小 時 : 54% vs 46% ; 3 小時 : 51% vs 49%)(圖九 A-B)。

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圖九、飲食操弄對於小鼠在 Novel Object Recognition 作業中記憶表現的影 響。(A)圖顯示三種飲食操弄組在四個不同時間點小鼠花在探索過的物體和全新

Percent  Of  Time  Spent  On  Object  

Time  spent  for  old  object   Time  spent  for  new  object  

*  

&&&   &&&  

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於控制組別，$$$表示 p<0.001。卡路里節制組別相較於高脂肪組別，&&&表示

於控制組別，$$$表示 p<0.001。卡路里節制組別相較於高脂肪組別，&&&表示

在文檔中 卡路里節制對於學習與記憶的影響 - 政大學術集成 (頁 40-0)