林素禎1,*、林姿君2、簡宣裕3
摘要
高品質的微生物肥料才能在田間提高植物營養元素的吸收及促進植物生長，
而政府的品質管控有助於微生物肥料產品在田間獲得更好和更一致的結果，而且 還可以從市場上去除品質差的產品，進而提高農民的信心。本文將介紹農業試驗 所於 2017 年與 2018 年購買市面上販售的溶磷菌肥料產品，進行溶磷菌有效活 菌數、雜菌率、溶磷環、溶磷活性及菌種鑑定，其檢測方法參考農糧署公告的微 生物肥料檢驗項目之檢驗方法。由 2017 年檢測結果可知，農業試驗所由市面上 購得的 14 個溶磷菌肥料產品只有 5 個皆符合農糧署微生物肥料規定，合格率為 36%。由 2018 年檢測結果可知，16 個市售溶磷菌肥料產品只有8個皆符合農糧署 微生物肥料規定，合格率為 50%。上述檢測結果為國內微生物肥料產品上市以來 第一次全面性的微生物肥料產品之品質分析，該分析資料可提供農糧署在微生物 肥料產品品質管控以及未來微生物肥料法規修改之參考。
關鍵詞：微生物肥料、溶磷菌、品質管控。
前言
農委會農糧署自 2008 年起推動合理化施肥至 2014 年止，經由合理施用化 學肥料，每年業已減少化學肥料施用量 10.7%，平均每年約減少 12 萬公噸 (農委 會農糧署農業統計年報 91-103 年, http://www.afa.gov.tw)，未來擬利用有機質肥料
* 通訊作者：[email protected]
1 農委會農業試驗所農業化學組助理研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所農業化學組計畫助理。台灣 台中市。
3 農委會農業試驗所農業化學組前研究員。台灣 台中市。
市售溶磷菌肥料產品品質分析
與微生物肥料之施用，期能再次降低化學肥料之施用量。
微生物肥料 (biofertilizer) 的商業化生產始於 1895 年，在美國和英國開始生 產豆科植物用的根瘤固氮菌接種劑，到了 1993 年，根瘤固氮菌接種劑在世界各 大洲許多國家都有生產 (Brockwell & Bottomley 1995)。化學肥料與有機質肥料可 用肥料成分來標示其肥分之高低，而微生物肥料中除了固氮菌可直接提供作物氮 肥外，其他種類的微生物肥料都是藉由增進土壤營養狀況或改良土壤之理化、生 物性質，而增加作物產量及品質者，所以微生物肥料的必要檢驗項目與化學肥料 及有機質肥料迥然不同。印度在 1996 年提出了溶磷菌與固氮菌 (Azospirillum) 的 產品標準規範，標準規範中包括菌種名稱、出廠時之菌數、保存期限到期時之菌 數、雜菌率、保存期限、pH值、水分含量、定量的活性指標、載體種類、載體大 小定量指標 (Ghosh et al. 2001)。目前國內的微生物肥料產品登記時需提供菌種名 稱、出廠時之目標菌株有效活菌數、活性、大腸桿菌群、雜菌率、保存期限等，
但微生物肥料產品規格中無定量的微生物肥料活性與載體大小之規定，且無需提 供微生物肥料的肥 (功) 效試驗報告。
Catroux 等人 (2001) 報導指出世界各地 90% 的豆科根瘤菌沒有實際的效 果，主要是因產品的品質很差。Herrmann等人 (2013) 報導指出 65 個微生物產品 中，只有 37% 的產品中是“純的”微生物菌劑，而其他 63% 被雜菌污染，且 40% 產品中沒有指標微生物。法國根瘤菌產品品管法規最嚴格，每粒種子的菌數 需在 106 以上，且從出廠到儲架期間皆需無污染，其產品每季使用前皆需經過檢 定 (Herrmann et al. 2013)。
微生物肥料品質好壞直接影響到施用效果，目前我國微生物肥料產品販售前 需先取得農糧署許可證號才能進行販售，而要取得農糧署許可證號，微生物肥料 產品必須要先經過檢驗單位檢驗合格。目前微生物肥料產品檢驗之採樣都是取剛 製造完成之產品，而微生物肥料產品從出廠到儲架期間，其品質在保存期限內是 否還能維持，則有待國內政府機關定期抽樣檢驗才能知道實際狀況。從 2018 年 起，農糧署及各縣市政府開始進行微生物肥料產品抽樣與檢驗，希望能在微生物 肥料產品品質上進行把關。農業試驗所在 2017 與 2018 兩年間，購買市售溶磷 菌肥料產品進行檢驗，本文中將介紹這些溶磷菌肥料產品根據農糧署公告的微生 物肥料檢驗項目之檢驗結果。
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
材料與方法
農業試驗所於2017年與2018年購買市面上販售的溶磷菌肥料產品，進行溶磷 菌有效活菌數、雜菌率、溶磷環、溶磷活性等之檢測及菌種鑑定，其檢測方法參 考農糧署公告的 ｢肥料檢驗項目之檢驗方法」，溶磷菌有效活菌數及溶磷活性檢驗 方法編號為AFS3183-1，雜菌率檢驗方法編號為AFS3802-1，溶磷菌肥料產品之菌 種鑑定方法編號為AFS3001-1。另外，目前國內在微生物肥料限制事項中只有大腸 桿菌群檢測，2017年農業試驗所委託弘光科技大學食品與化妝品品質檢驗與分析 中心檢測市售14個溶磷菌肥料產品之大腸桿菌群、大腸桿菌與沙門氏菌，其檢驗 方法參考衛福部公告食品微生物之檢驗方法 (大腸桿菌群之檢驗、大腸桿菌之檢驗 及沙門氏桿菌之檢驗)。本文中溶磷菌肥料產品各項的檢測方法簡述於下。
溶磷菌有效活菌數、雜菌率及溶磷環測定
取10 g (或10 mL) 溶磷菌肥料產品放入容積250 mL已滅菌三角瓶中，加入90 mL已滅菌之冷稀釋液中，即為10倍稀釋檢液 (亦稱 10-1 稀釋度檢液)。上述冷稀 釋液為生理食鹽水，其配製方法如下：將 8.5 g NaCl 溶解於蒸餾水中，然後稀釋 定量成 1 L 經滅菌後備用。將裝有10倍稀釋檢液之三角瓶置於迴轉振盪器上，以 30℃，200 rpm 轉速振盪 20 min，使其混合均勻。振盪後，樣品若為粒劑，需於 桌面靜置30 s後，再行稀釋。吸取 1 mL 之 10 倍稀釋檢液，移入 9 mL 冷稀釋液 之螺旋試管中，振盪均勻，即為 102 倍稀釋檢液 (亦稱10-2稀釋度檢液) 。依序稀 釋至所需稀釋度。本操作需製作不添加溶磷菌肥料產品之空白對照組。取0.1 mL 適當稀釋度之菌檢液置於培養基表面中央處 (若預估菌液之活菌數為109 CFU mL-1，則採用105–107倍稀釋檢液；依此類推) ，立即取滅菌之玻璃塗抹棒，將菌 液均勻塗抹在培養基表面。確認培養基表面無菌液流動後，將培養皿倒置於生長 箱內30℃黑暗培養，分別於第3 d、第 7 d、第 14 d及第 28 d，選擇每皿菌落數在 25–250之稀釋度計算菌落數，溶磷菌有效活菌數 ＝ 平均菌落數 (CFU 皿-1) × 稀釋倍率 / 稀釋菌液量 (g 皿-1或 mL皿-1)。雜菌係指不屬於微生物肥料目標菌種 (溶磷菌) 之其他微生物，依菌落特徵判定雜菌數，計算微生物肥料雜菌率，雜菌 率 ＝ 雜菌數 × (雜菌數 + 溶磷菌數)-1 × 100%。溶磷菌菌落周圍可形成透明
市售溶磷菌肥料產品品質分析
環，測量溶磷菌菌落形成透明環之直徑，以每一菌落最長與最短之直徑，取其平 均值代表溶磷菌菌落之溶磷環直徑。上述溶磷菌培養基如表1所示，每個直徑 9 cm 培養皿有 13 mL 培養基，平板培養基厚度約 2 mm。
溶磷活性
取 1 g (或 1 mL) 溶磷菌肥料產品加入 100 mL 液體培養基中，在 30℃， 200 rpm 培養箱中振盪培養 4 d，另取1 g (或1 mL) 經滅菌處理之溶磷菌肥料產品為對 照組。上述溶磷菌液體培養基之組成不含瓊脂 (agar)，其餘與表1相同。培養後，
將培養液置於高速離心機中離心20 min (5℃ 配合 27000 x g 條件)，然後取澄清 液，並以0.45 μm濾膜過濾。取定量濾液 (磷約100 μg–900 μg) 移至50 mL量液瓶 中，加入10 mL混合試劑，以去離子水稀釋定量，混勻並靜置1 h後，以波長420 nm 分光光度計測定磷濃度。磷標準曲線製作方法如下：取0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、
20 mL及 25 mL 之 50 mg L-1磷標準溶液，分別加入50 mL量液瓶中，並各加入10 mL混合試劑後以去離子水稀釋定量至50 mL，混勻後即為0 mg L-1、5 mg L-1、10 mg L-1、15 mg L-1、20 mg L-1及25 mg L-1 之磷濃度，靜置1 h後，以分光光度計測定，
並製作標準曲線。依標準曲線所得之溶磷菌肥料產品磷濃度，計算磷含量。溶磷 活性是指單位重量 (體積) 溶磷菌肥料產品之溶磷菌，在單位時間內將難溶性磷分 表1. 溶磷菌固體培養基z
Table 1. Culture medium for phosphate-solubilizing bacteria
Composition Concentration (g/L) Company name
Sucrose 10 Choneye, Taiwan
NH4NO3 0.27 Katayama, Japan
KCl 0.2 Katayama, Japan
MgSO4‧7H2O 0.1 Katayama, Japan
FeSO4‧7H2O 0.001 Katayama, Japan
MnSO4‧4H2O 0.001 Merck, Germany
Agar 15 Becton, Dickinson and
Company，BD, USA
Ca3(PO4)2 5 Katayama, Japan
z Medium pH was adjusted to 7.0 ± 0.1, and then sterilized at 121℃ for 15 minutes.
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
解為水溶性磷之量μg (g (mL) × h (d) ) -1，溶磷活性 ＝ (溶磷菌肥料產品之培養液 所含水溶性磷量 (μg 瓶-1) – (滅菌的溶磷菌肥料產品之培養液所含水溶性磷量 (μg 瓶-1) ) / (使用溶磷菌肥料產品量 (mL 瓶-1 或 g 瓶-1) × 培養時間 (h或d))。上 述混合試劑的配製方法如下：將偏釩酸銨溶液移入1000 mL量液瓶中，快速攪拌，
並緩慢加入250 mL濃硝酸 (HNO3)，冷卻至室溫後，將鉬酸銨溶液倒入量液瓶中，
定量至1000 mL。上述鉬酸銨溶液為取25 g鉬酸銨 ( (NH4)6Mo7O24‧4H2O) 溶解於 400 mL去離子水中後備用；偏釩酸銨溶液為取1.25 g偏釩酸銨 (NH4VO3) 溶解於 300 mL 之沸騰去離子水中，冷卻至室溫供用；50 mg L-1 磷標準溶液製作為以 KH2PO4先於40℃下乾燥，正確稱取0.2197 g後，加入去離子水及25 mL 3.5 M硫酸 液，再加去離子水至1000 mL，此時磷濃度即為磷50 mg L-1，亦可採用市售磷標準 溶液。上述3.5 M硫酸液製作為緩慢將194 mL濃硫酸，加入500 mL去離子水中，再 稀釋為1000 mL，冷卻備用。
溶磷菌肥料產品之菌種鑑定
溶磷菌肥料產品目標溶磷菌菌體之基因組DNA (genomic DNA ) 分離：先將低 溫保存之目標溶磷菌菌體樣品進行十倍連續稀釋，取1 mL目標溶磷菌菌體樣品與9 mL滅菌水混合，製備10-1–10-8濃度之稀釋液，再取100 μL稀釋液，均勻塗抹於NA 培養基中，於30℃下恆溫培養約3–7 d。NB培養基中外加15 g L-1瓊脂後為NA培養 基。挑選單一菌落後，至少進行三次劃線分離，確定挑選之菌株為純系培養者。
將挑選之純系培養菌株分別接種至5 mL之NB液體培養基中，於30℃配合轉速180 rpm之恆溫振盪條件下，培養4 d。取1.5 mL之上述菌液加入一個經滅菌之2 mL微量 離心管中，再將微量離心管置入可控溫高速微量離心機中，於4℃配合10,000 x g 之條件下高速離心30 s，將菌體離心至微量離心管之管壁上。倒掉培養液後，再於
將挑選之純系培養菌株分別接種至5 mL之NB液體培養基中，於30℃配合轉速180 rpm之恆溫振盪條件下，培養4 d。取1.5 mL之上述菌液加入一個經滅菌之2 mL微量 離心管中，再將微量離心管置入可控溫高速微量離心機中，於4℃配合10,000 x g 之條件下高速離心30 s，將菌體離心至微量離心管之管壁上。倒掉培養液後，再於