溶磷菌溶磷效率特性之評估

徐妤瑄¹、黃政華^2,*

摘要

磷肥常為影響作物產量的重要因子之一，作物接種溶磷菌常作為提高作物磷 吸收的策略，故商品化的溶磷菌肥料已因應市場而產生。本研究計畫目的在於評 估本研究主要探討培養基種類對溶磷菌溶磷活性和有機酸分泌的影響，並評估 4 種市售溶磷菌肥料對促進莧菜生長和磷吸收的效應。本研究使用12 株菌株和 4 種 溶 磷 培 養 基 ， 培 養 基 包 含 AFS3183-1 培養基 (蔗糖或葡萄糖)、NBRIP 及 Pikovskaya’s medium (PVK)，以評估培養基對溶磷活性、培養基 pH、菌數落和有 機酸分泌量的影響。盆栽試驗使用鹼性和酸性土壤，鹼性土壤施用之商品化溶磷 菌肥料為PSB2 和 PSB3，酸性土壤施用之溶磷菌肥料為 PSB1 和 PSB4，分別探討 溶磷菌肥料對莧菜生長和磷吸收的影響。結果顯示，培養基種類顯著影響溶磷菌 之溶磷活性，供試菌株中以Pseudomonas grimontii CHB 1107 之溶磷活性為最高，

其培養於AFS3183-1 以葡萄糖為碳源之溶磷活性達 7946 g/mL/day。整體而言，

溶磷菌培養於PVK 培養基之溶磷活性顯著高於培養於其他培養基者，其可能由於 PVK 培養基所含的養分較高有關，且僅此培養基含酵母抽出物。培養基之 pH 與 溶磷活性呈顯著負相關 (r = -0.75, P < 0.0001)，顯示酸性環境有助於培養基中磷酸 三鈣之溶解。培養基種類顯著影響溶磷菌菌株分泌有機酸的種類和濃度，供試菌 株分泌之有機酸濃度以2-ketogluconic acid、gluconic acid 及 pyruvic acid 為較高，

且溶磷菌分泌此三種酸的濃度與溶磷活性呈顯著負相關，其中2-ketogluconic acid 有最高之相關係數達 0.66。盆栽試驗顯示，半量化學肥料+PSB3 和半量化學肥料+

滅菌PSB3 之莧菜植株乾重顯著高於半量化學肥料者達 125-140%。然而，等量 PSB3 化學肥料處理之植株乾重顯著高於半量化學肥料者達83.6%，顯示該溶磷菌肥料中

* 通訊作者：[email protected]

1 國立中興大學土壤環境科學系碩士班學生。台灣。台中市。

2 國立中興大學土壤環境科學系副教授。台灣。台中市。

溶磷菌溶磷效率特性之評估

所含養分的效應遠大於溶磷菌本身促進植株生長之效應。相反的，半量化學肥料 +PSB2 和半量化學肥料+滅菌之 PSB2 並未顯著促進植株生長。半量化學肥料+PSB3 處理和半量化學肥料+滅菌 PSB3 處理之植株磷吸收量顯著高於半量化學肥料者達 54.8-73.9%，但等量 PSB3 化學肥料處理之植株磷吸收量亦顯著高於半量化學肥料 者達 41.0%，顯示該溶磷菌肥料中所含的磷肥可能為顯著增加植株磷吸收量之主 要原因。然而，半量化學肥料+PSB2 處理之植株磷吸收量顯著高於半量化學肥料+

滅菌之PSB2 達 38.0%，顯示此溶磷菌肥料可顯著增加植株磷吸收量。與半量化學 肥料相較，酸性土壤施用半量化學肥料+PSB1 或半量化學肥料+PSB4 皆顯著降低 莧菜植株乾重。此外，酸性土壤施用半量化學肥料+PSB1 或半量化學肥料+PSB4 皆未能顯著增加磷吸收量，顯示酸性土壤施用溶磷菌肥料促進莧菜生長和磷吸收 之效益較低。培養基種類影響溶磷菌之溶磷活性分析，商品化溶磷菌功效不ㄧ，

而原料中養分含量可能顯著影響其肥功效。

關鍵詞：磷肥、溶磷菌、微生物肥料。

前言

磷是植物生長所需的巨量養分之一，其佔植體乾重約 0.2%，但磷常為限制植 物生長的養分 (Alori et al. 2017)。一般而言，土壤的總磷含量約為 0.05% (w/w)，

但其中可供植物吸收利用的磷僅佔 0.1%。傳統上，施用化學磷肥以避免作物缺 磷，但施用的磷肥常易被固定於土壤中而降低其有效性，且過量施用磷肥亦產生 環境汙染。因此，如何增進土壤中磷的有效性、促進作物產量及減少磷肥從土壤 中損失的環境汙染是重要的研究議題。

土壤中可溶解無機磷或分解有機磷的微生物，可增加土壤中磷的有效性，增 加 植 物 的 磷 吸 收 量 ， 此 類 微 生 物 可 稱 為 溶 磷 微 生 物 (phosphorus solubilizing microorganisms) (Sharma et al. 2013；Alori et al. 2017)。溶磷菌肥料為我國微生物 肥料類之主要登記品目 (品目編號 8-03)，其溶磷活性乃分析單位體積 (重量) 之溶 磷菌肥料，在單位時間內將難溶性含磷無機礦物 (磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵或磷礦 石粉) 分解為水溶性磷之量，其尚未包含分解有機磷之微生物。澳洲對溶磷菌之檢

溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊

測已包含溶磷定量和磷酸酶活性的分析，以確保溶磷菌肥料之功效 (Deaker et al.

2011)。然而，培養時間和培養基之碳源是否影響溶磷活性之判讀則有待研究。

溶無機磷活性、溶磷圈測試、磷酸酶、有機酸分析及吲哚乙酸 (IAA) 常作為 評估溶菌磷之促進作物磷吸收量之指標，唯國內溶磷菌肥料僅考量溶無機磷活 性，其他溶磷能力指標是否可納入溶磷菌肥料溶磷活性之檢驗項目則需進一步研 究。此外，某些溶磷菌可耐高鹽害土壤之環境，且能表現溶磷能力，有利於增加 鹽鹼土的有效性磷，促進磷之吸收 (Zhu et al. 2011)。因此，土壤或作物接種溶磷 菌是增加植物磷吸收量和降低化學磷肥施用量的可行策略之一。雖然溶磷菌可施 用於土壤或根圈以促進磷的有效性，但有關土壤環境因子如何影響溶磷菌之功效 的研究未臻完善。接種於土壤的溶磷菌可能隨時間而降低其族群密度 (Zeng et al.

2017)，故定期施用溶磷菌微生物以維持溶磷菌之溶磷功效可能有其必要性。再者，

雖然螢光蛋白標定方法常用於追蹤特定溶磷菌 (Wang et al. 2017)，但有關如何定 量土壤溶磷菌之族群則需進一步研究，以確定溶磷微生物是否可在土壤中生存。

一般測定溶磷活性之溶磷培養基碳源以葡萄糖為主，唯我國測定溶磷活性之 培養基以蔗糖為碳源，但溶磷培養基之碳源可能影響溶磷菌的溶磷活性 (Nautiyal et al. 2000)。本研究主要探討培養基種類對溶磷活性和有機酸分泌的影響，並評估 四種市售溶磷菌肥料對促進莧菜生長和磷吸收的效應。

材料與方法

一、溶磷菌之溶磷活性評估 (一) 供試菌株

本研究共使用12 株菌株，包含為 Bacillus、Microbacterium

、

(二) 培養基

本研究所使用的培養基成分如表2 所示，包含 NBRIP、Pikovskaya’s medium (PVK) 及我國溶磷菌分析法 AFS3183-1 所使用之培養基。三種培養基之主要差異 為碳源，AFS3183-1 所使用之碳源為蔗糖，NBRIP 及 PVK 以葡萄糖為碳源。因此，

溶磷菌溶磷效率特性之評估

本研究亦將 AFS3183-1 所使用之蔗糖改為等量之葡萄糖，以評估同ㄧ培養基中不 同碳源之差異，故本研究共使用四種培養基。

表1. 本研究所使用之菌株

Strain Species Source CHB 1065 Bacillus aryabhattai This study CHB 1107 Pseudomonas grimontii This study CHB 1122 Pseudomonas libanensis This study CHB 1128 Bacillus marisflavi This study CHB 1228 Paenibacillus sp. This study CHB 1257 Bacillus subtilis This study CHB 1264 Microbacterium testaceum This study CHB 1404 Bacillus amyloliquefaciens This study

CHB 1285 Bacillus subtilis Commercial phosphate solubilizing biofertilizer (PSB)1 CHB 1286 Bacillus licheniformis Commercial PSB2

CHB 1287 Bacillus safensis Commercial PSB3 CHB 1288 Bacillus amyloliquefaciens Commercial PSB4

表2. 本研究所使用之培養基及其組成

Component PVK NBRIP AFS3183-1

--- g/L ---

Glucose 10 10 —

Sucrose — — 10

Ca3(PO4)2 5 5 5

(NH4)2SO4 0.5 0.5 —

NH4NO3 0.27

NaCl 0.2 — —

MgSO4‧7H2O 0.1 0.25 0.1

MgCl2‧6H2O — 0.5 —

KCl 0.2 0.2 0.2

Yeast extract 0.5 — —

MnSO4‧4H2O 0.002 — 0.001

FeSO4‧7H2O 0.002 — 0.001

溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊

(三) 菌株培養

於 250 mL 三角燒瓶中分別配製含 100 mL 之上述四種液體培養基，每 100 mL 含 0.5 g 之磷酸三鈣。將細菌培養於 NA 培養基上 28℃ 2 d，以無菌去離子水 洗下菌落，將液體培養基接種1 mL 含 10⁸ CFU/mL 之菌落懸浮液，使液體培養基 中之最終溶磷菌濃度為10⁶ CFU/mL。將培養基置於 28℃ 震盪培養 (200 rpm) 4 d 後，分析定溶液pH 值變化、菌落數、可溶性磷含量、有機酸含量及種類。

(四) 培養基之 pH

將 5 mL 液體培養離心 (12000 x g) 以分離菌體，再以 pH 計測定上清液之 pH。

(五) 溶磷菌之菌數

取 1 mL 液體培養基以連續稀釋菌液，並取 100 l 稀釋液塗抹於個別培養溶 磷 菌 之 固 體 溶 磷 菌 培 養 基 進 行 培 養 ， 培 養 後 2-4 d 計 算 菌 落 形 成 單 位 (Colony-forming unit, CFU)。

(六) 溶液磷之分析

取1 mL 液體培養基，以 0.45 m 微濾膜過濾，濾液中的磷含量以鉬黃法測 定 (AFS3183-1)，以分光光度計測定 420 nm 之吸光值。磷標準線以磷含量分別為 0、1、3、5、10、15、20 及 25 mg/L 所測得之吸收值而得。

(七) 有機酸之 HPLC 分析

取 1 mL 液體培養基，以 0.22 m 微濾膜過濾至 HPLC 分析樣品瓶中。分析 葡萄糖酸 (Gluconic acid) 及 2-酮戊二酸 (2-ketogluconic acid) 之樣品需先和乙腈 以1:1 (v/v) 比例混合再進行過濾，但含有蔗糖之培養基則不需混入乙腈。葡萄糖 酸及2-酮戊二酸之 HPLC 分析條件為: 以 Shodex NH2管柱、移動相為3 mM 磷酸 鉀緩衝液 (pH 6.0) + 75% ACN (乙腈)、流速為 0.8 mL/min (0-10 min) 及 1.2 mL/min (10-25 min)、管柱溫度為 35℃及以 210 nm 為偵測波長。酒石酸 (Tartaric acid)、冰醋酸 (Acetic acid)、檸檬酸 (Citric acid)、蘋果酸 (Malic acid)、富馬酸 (Fumaric acid)、馬來酸 (Maleic acid)、甲酸 (Formic acid)、琥珀酸 (Succinic acid) 及草酸 (Oxalic acid)之分析條件為: 以 RPAQUEOUS-AR C30 管柱、移動相為 50 mM KH2PO4 (pH=2.8)、流速為 0.8 mL/min (0-10 min)及 1.2 mL/min (10-25 min)、

管柱溫度為 30℃及以 210 nm 為偵測波長，上述 HPLC 分析以 Hitachi Chromaster 5110 進行之。

溶磷菌溶磷效率特性之評估

二、市售溶磷菌肥料之功效評估 (一) 供試土壤

本研究之供試土壤共兩種，包含鹼性和酸性土壤。鹼性土壤採自彰化縣 大村鄉二林系土壤 (Eh4)，係為橄欖色至淡橄欖棕色，微鹼性粘板岩老沖積物沉積 而成之含石灰結核，排水不完全沖積土。該土壤之 pH1:1 為 8.04，電導度為 0.55 dS/m (土:水 = 1:1)，有效性磷 (Olsen P) 為 47.0 mg/kg，交換性鉀為 72.0 mg/kg，

交換性鈣為 1430 mg/kg，交換性鎂為 128 mg/kg。酸性土壤採自台中市龍井區陳 厝寮系土壤 (CCe7)，其為由洪積層發育而成的紅棕色紅壤，該土壤之 pH1:1 為 4.55，電導度為 0.38 dS/m (土:水 = 1:1)，有效性磷 (Bray-1 P) 為 22.8 mg/kg，交 換性鉀為 325 mg/kg，交換性鈣為 184 mg/kg，交換性鎂為 34.3 mg/kg。

(二) 供試市售溶磷菌肥料

鹼性土壤使用之商品化溶磷菌肥料PSB2 和 PSB3，酸性土壤所使用之商品化 溶磷菌肥料為PSB1 和 PSB4，唯先前試驗顯示，陳厝寮系土壤種植莧菜不利其生 長，即使添加溶磷菌亦生長不良，故該土壤預添加1%禽畜糞堆肥 [牛糞、雞糞、

豬糞、金針菇廢棄物和下腳料 (含粗糠、豬毛和雞毛) 之混合比例為 1:1:1:5:2 (w/w)]

以改善其土壤肥力和酸鹼值。

(三) 肥料處理

處理A: 全量化肥 (N:P2O5:K2O = 150:105:135 kg/ha) 處理B: 半量化學肥料 (N:P2O5:K2O = 75:52.5:67.5 kg/ha)

處理C: 半量化學肥料 + PSB3 (鹼性土讓) 或 PSB1 (酸性土壤) 處理D: 半量化學肥料 + PSB2 (鹼性土壤) 或 PSB4 (酸性土壤) 處理E: 半量化學肥料 + 滅菌之 PSB3 或 PSB1

處理F: 半量化學肥料 + 滅菌之 PSB2 或 PSB4

處理F: 半量化學肥料 + 滅菌之 PSB2 或 PSB4