張鈞喆1、賴威安2、楊秋忠3、沈佛亭4,*
摘要
本研究針對菌株是否可在根表面拓殖特性進行探討，篩選具移動性、生成IAA 與ACC 脫氨酶的溶磷菌株，於甘藍菜、番茄、菠菜種子進行生物分析及三角瓶栽 試驗，瞭解菌株對種子發芽與幼苗生長的影響，並以螢光原位雜合與純系分離株 分子指紋分析確認接種菌株在植株根系的分布評估相容性，另於溫室中以盆栽試 驗探討接種菌株對三種作物生長的影響並評估菌株在微棲地環境中的適應性。測 試溶磷菌配合 3 種作物的種子生物分析與三角瓶栽試驗，結果顯示其中 2 株菌可 提高瓶栽甘藍菜地上部乾重、4 株菌可提高瓶栽番茄地上部乾重、3 株菌可提高瓶 栽菠菜地上部乾重，利用純系分離株BOX-PCR 分子指紋分析與 16S rRNA 基因螢 光探針EUB338 之雜合技術均顯示菌株於根系生長 30 天後仍可存活於根表面。經 相容性測試篩選出之菌株進行盆栽試驗，顯示可提高盆栽甘藍菜生質量具適應性 之菌種為Bacillus marisflavi 與 Pseudoarthrobacter niigatensis；可提高盆栽番茄生質 量具適應性之菌種為Brevundimonas albigilva 與 Gordonia hongkongensis；可提高盆 栽菠菜生質量具適應性之菌種為Bacillus xiamenensis 與 Paraburkholderia sacchari。
關鍵詞：微生物肥料、溶磷菌、甘藍、番茄、菠菜、基因螢光探針。
前言
微生物肥料於2010 年納入肥料管理法規範後，迄今市面商品二十餘支，為可 配合化學肥料與有機質肥料使用的新興農業資材。然而因微生物肥料內含活性菌
* 通訊作者：[email protected]
1 國立中興大學土壤環境科學系研究助理。台灣 台中市。
2 國立中興大學土壤環境科學系博士後研究員。台灣 台中市。
3 中央研究院院士、國立中興大學土壤環境科學系教授。台灣 台中市。
4 國立中興大學土壤環境科學系副教授。台灣 台中市。
溶磷菌與高磷需求作物之相容性研究
種，需依賴其固氮、溶磷、溶鉀活性的表現方能發揮效果，不同於添加化學肥料 或有機質肥料成分提供作物生長所需養分，菌株能否適應作物根圈或植體微棲地 環境並穩定存在，將直接影響微生物肥料施用的效果，其中菌株與作物的相容性 更是微生物接種能否成功的關鍵，但少有研究探討。土壤有益微生物的特性研究 依賴在實驗室培養條件下進行的分析，雖然透過培養可評估其促進作物生長的潛 力，但往往因現地環境與實驗室條件不同，導致在實驗室測試功能優良的微生物 進入盆栽或田間後表現不如預期，其中了解微生物接種後在作物根表面的拓殖與 內生特性是重要關鍵。
材料與方法
一、供試溶磷菌株篩選
自實驗室溶磷菌種庫中的分離株，經測定溶磷 (Nautiyal et al., 2000)， 挑選活 性較佳的菌株，進一步鑑定(Willems and Collins, 1993)，並且測定菌株的移動性、
IAA 與 ACC 脫氨酶生成能力，挑選表現較佳的菌株進行後續試驗。
(一) 將供試菌株接種於含不同濃度洋菜的肉汁平板培養基，觀察菌落擴散樣式得 知菌株是否具有移動性(Rashid and Kornberg, 2000)。
(二) 將供試菌株接種於含色胺酸的肉汁培養基，待培養後利用比色法測定培養液 中的IAA 含量(Gordon and Weber, 1951; Patten and Glick, 2002)，篩選可生成 IAA 的溶磷菌。
(三) 另以 ACC 作為培養基中的氮源，接種菌株培養後利用比色法測定培養液中的 α-酮丁酸含量得知菌株的 ACC 脫氨酶活性(Penrose and Glick, 2003)。
二、螢光原位雜合與純系分離株分子指紋分析技術建立
為追蹤接種菌株是否存在於根圈或植體表面，將建立螢光原位雜合與純系分 離株分子指紋分析技術。
(一) 針對目標菌株設計探針並以螢光標定後，考慮探針的偵測專一性與靈敏度進 行雜合反應條件最佳化。
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
(二) 建立各菌株的分子指紋，以 BOX-PCR 針對細菌短重複片段進行增殖反應，再 利用電泳分析得知不同菌株的基因型圖譜(Koeuth et al., 1995)。
三、種子生物分析與三角瓶栽試驗
於生長箱中分別以種子生物分析與三角瓶栽試驗評估菌株與作物的相容性。
(一) 先將已表面消毒的種子置於含菌液的濾紙上，待種子發芽 3-7 d 後測定發芽 率、胚根與胚莖長 (Lai et al., 2008)，篩選可促進種子發芽的菌株進行後續試 驗。
(二) 瓶栽試驗中，將接菌後的種子置於盛裝蛭石並添加植物養液 (Hoagland and Arnon, 1950) 的三角瓶中，於植物生長箱中培養，光照時間每日 13 小時，待 幼苗生長後分別於第10、20 與 30 d 進行生育性狀調查，另進行根部樣品的螢 光原位雜合 (Assumus et al., 1995) 與純系分離株分子指紋分析，解析菌株在 根圈或作物表面的拓殖特性。
四、溫室盆栽試驗
為了解菌株接種至複雜環境中對作物生長的影響與其在微棲地的適應性，於 溫室中進行盆栽試驗，設計不同處理進行比較。本試驗供試土壤來源為彰化福興 鄉玉米田土壤，土壤性質如表1 所示。
(一) 處理包括不施肥的對照組、全量化肥組、半量化肥組、半量化肥 + 磷酸三鈣 + 溶磷菌組，並以五重複進行。將接菌後的種子置於含土壤的盆栽中，待幼 苗生長後每兩週進行植株生育性狀調查，並於採收時進行生質量分析。
(二) 進行根圈、根表面菌體懸浮液的製備 (Matthyse and McMahan, 1998)，以螢光 原位雜合與純系分離株分子指紋分析，解析菌株在根圈與根系表面的拓殖特 性評估其在微棲地環境中的適應性。
表 1. 試驗土壤性質 pH EC
μS/cm O.M
%
N Ca Cu Fe K Mg Mn P Zn ---mg kg-1---
7.4 497 3.41 1604.80 5636.77 8.24 400.29 96.64 548.70 246.57 8.31 3.28
溶磷菌與高磷需求作物之相容性研究
結果與討論
一、供試溶磷菌株篩選
本研究測試菌株之移動能力IAA 產生以及 ACC deaminase 活性功能以作為研 究菌株根拓殖作用能力的參考與根據，表 2 為各菌株之移動能力、IAA 產生以及 ACC deaminase 活性的測試結果。
表2. 菌株功能性比較
Strain Motility Production of
Swimming Swarming Twitching IAA (μg ml-1) ACC deaminase (nmol –ketobutyrate ml-1)
Arthrobacter sp. OTO3C - - - 58.78 1.80
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
Production of Seed bioassay IAA
(μg ml-1) ACC deaminase
(nmol – ketobutyrate ml-1) Cabbage Tomato Spinach
Arthrobacter sp. OTO3C - 58.78 1.80 ○ ○
Motility：+ 表示具有Swimming, Swarming or Twitching能力；- 表示無移動能力；Seed bioassay：○ 表具促進生長功效
溶磷菌與高磷需求作物之相容性研究
將塗抹於NA 培養基的根圈細菌懸浮液生長的菌落以 BOX-PCR 的反應產物，
以電泳分析確認其是否與原接種菌株為同一菌株，結果如圖 2 所示，顯示所測試 之根圈細菌與接種的菌株為同一菌，其中菌株的螢光原位雜合分析如圖3 所示。
圖1. 瓶栽試驗接種溶磷菌對於甘藍菜 30 d 生長地上部乾重
圖2. 甘藍菜瓶栽培養 30 d 根中回篩菌株的 BOX-PCR 指紋圖譜
圖3. 甘藍菜瓶栽培養 30 d 根中回篩菌株的螢光原位雜合分析
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
(二) 番茄瓶栽試驗
將經種子發芽生物分析測試其對於番茄生長促進具有潛力之10 株溶磷菌菌株 S-NB-2、R-NB-5、R-NB-11、OT03C、OT03E、OT03G、W-NaCl-3、W-NaCl-5、
OTPB4、OTPB9 以瓶栽試驗測試其接種於番茄種子對於植物生長的影響，經過 30 d 的生長經統計結果如圖 4 所示。結果顯示接種 S-NB-2、W-NaCl-3、R-NB-5 及 OT03C 對於番茄地上部乾重有明顯促進的效果，與未接種的處理相比較，分別提 高了28.4 %、13.5 %、18.4 %及 31.2 %。其餘菌株對於番茄地上部的乾重則沒有顯 著促進的效果甚至產生抑制生長的作用。
將塗抹於NA 培養基的根圈細菌懸浮液生長的菌落以 BOX-PCR 的反應產物，
以電泳分析確認其是否與原接種菌株為同一菌株，結果如圖 5 所示，表示所測試 之根圈細菌與接種的菌株為同一個菌株，其中菌株的螢光原位雜合分析如圖 6 所 示。
圖4. 瓶栽試驗接種溶磷菌對於番茄 30 d 生長地上部乾重
圖5. 番茄瓶栽培養 30 d 根中回篩菌株的 BOX-PCR 指紋圖譜
溶磷菌與高磷需求作物之相容性研究
(三) 菠菜瓶栽試驗
將經種子發芽生物分析測試其對於番茄生長促進具有潛力之10 株溶磷菌菌株 N13、OTPB4、OTA1-2A、OTA1-2I、S-NaCl-3、K-NaCl-5、W-NaCl-3、W-NaCl-5、
OT03D、OT03G 以瓶栽試驗測試其接種於番茄種子對於植物生長的影響，經過 30 d 的生長經統計結果如圖 7 所示。結果顯示接種 N13、OTPB4 及 S-NaCl-3 對於番 茄地上部乾重有明顯促進的效果，與未接種的處理相比較，分別提高了 94.8%、
34.2%和 30.0%。其餘菌株對於番茄地上部的乾重則沒有顯著促進的效果。
圖6. 番茄瓶栽培養 30 d 根中回篩菌株的螢光原位雜合分析
圖7. 瓶栽試驗接種溶磷菌對於菠菜 30 d 生長地上部乾重
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
四、溫室盆栽試驗 (一) 甘藍菜溫室試驗
(1) 甘藍菜溫室試驗統計結果分析
甘藍菜盆栽試驗於溫室生長60 d 及各處理生長比較情形如圖 8 所示，菌 A 為 OT03C Pseudoarthrobacter niigatensis、菌 B 為 K-NaCl-7 Bacillus marisflavi，可看 出甘藍菜外表型態添加菌液的處理有約略優於較半量化肥處理。圖 9 為甘藍菜地 上部平均鮮重統計分析，統計結果顯示全量化肥 (1CF) 為所有處理中地上部平均 鮮重最高的處理，而添加菌液的處理於統計結果上皆明顯優於半量化肥處理，並 具有顯著差異，結果顯示添加 OT03C Pseudoarthrobacter niigatensis、K-NaCl-7 Bacillus marisflavi 皆具有促進甘藍生長的效果，雖然無法達到全量化肥處理。
圖8. 甘藍於溫室 60 d 生長狀況
溶磷菌與高磷需求作物之相容性研究
(2) 甘藍菜溶磷菌適應性試驗結果
專一性之螢光探針觀察各菌株於甘藍根表面拓殖化的情形如圖10 所示，甘藍 接種OT03C Pseudoarthrobacter niigatensis，於圖 10-a 根圈微及圖 10-b 根表於專 一性螢光探針偵測下，OT03C 皆有被螢光顯微鏡偵測出，表示甘藍接種 OT03C 確
圖9. 甘藍生長 60 d 地上部平均鮮重
圖10. 菌株 OT03C、菌株 K-NaCl-7 根圈及根表螢光原位雜合結果
(a)OT03C 根圈 (b) OT03C 根表 (c) K-NaCl-7 根圈 (d) K-NaCl-7 根表
(a) (b)
(c) (d)
溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊
實存在於甘藍根圈及根表微生物相，但其螢光反應相較於其他處理弱，推論有可 能為微生物族群較少之因素。K-NaCl-7 Bacillus marisflavi 於專一性螢光探針偵測
實存在於甘藍根圈及根表微生物相，但其螢光反應相較於其他處理弱，推論有可 能為微生物族群較少之因素。K-NaCl-7 Bacillus marisflavi 於專一性螢光探針偵測