Ⅰ、大腸直腸癌類癌幹細胞之因子探討
(Ⅰ-圖一) SCNN1B 基因的 mRNA 在臨床檢體類癌幹細胞中的
表現量比在貼盤培養的細胞高。圖中為 SCNN1B 基因在編號 2796、3029 兩位不同病患檢體之貼 盤培養細胞 (Adherent, AD) 以及懸浮培養的類癌幹細胞 (Sphere, SP) 中，利用 RT-PCR 進行 mRNA 之表現量分析 (2796T, n=1；3029T, n=1)。可以觀察到 SCNN1B 基因的 mRNA 在類癌幹細胞 (SP) 的組 别中有較高的表現量。定量則使用 Image J 軟體進行量化分析，以 GAPDH 作為 loading control，將貼盤細胞的結果作為標準值，比較同 組之中類癌幹細胞的量化數值，結果即為 SCNN1B 基因之 mRNA 在 類癌幹細胞中的相對表現量。一般檢體培養之細胞並不足以做到三重
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複的結果，但此處培養的編號 2796T 之細胞已有較穩定的生長狀況，
故能進行較多次的實驗。(GAPDH 以及 SCNN1B 的 cDNA 長度皆約 為 300 bp)
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A
B
(Ⅰ-圖二) HCT116 細胞株中，SCNN1B 的表現量在類癌幹細
胞中高於貼盤細胞。A.為 SCNN1B 基因的 mRNA 在 HCT116 細胞株表現的情況，我 們選擇抽取同一代數培養相同天數的貼盤以及懸浮細胞之 RNA 來做 RT-PCR 分析，可以 觀察到在懸浮培養的類癌幹細胞 (SP) 中，
SCNN1B 的表現量高於貼盤細胞 (AD)。B.為 HCT116 細胞株在經過
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重複三次以上之獨立實驗後之定量結果統計分析，結果顯示 SCNN1B 基因的 mRNA 在懸浮培養的類癌幹細胞中表現量高於貼盤細胞並達 到了具有統計意義的顯著差異。 (以 Image J 軟體進行量化分析，
GAPDH 作為 loading control，將貼盤細胞的結果作為標準值，比較同 組之中類癌幹細胞的量化數值)。重複至少三次獨立實驗之後，將其 量化數據做統計分析並繪出圖表，使用之統計方式為Student’s T- test (***：p<0.005)。
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A
B
(Ⅰ-圖三) HT-29 細胞株中，SCNN1B 的表現量在貼盤細胞微
中高於類癌幹細胞細胞但並未達到顯差。A.為 SCNN1B 基因的 mRNA 在 HT-29 細胞株表現的情況，我們 選擇抽取同一代數培養相同天數的貼盤以及懸浮細胞之 RNA 來做 TR-PCR 分析，可以看到在貼盤細胞 (AD) 中，SCNN1B 的表現量高 於懸浮培養的類癌幹細胞 (SP)。B.為 HT-29 細胞株在經過重複三次 以上獨立實驗後的定量結果統計分析，可以看到 SCNN1B 基因的
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mRNA 在貼盤細胞 (AD) 中表現量高於懸浮培養的類癌幹細胞 (SP)，但是並未達到顯著差異。重複至少三次獨立實驗之後，將其量 化數據做統計分析並繪出圖表，使用之統計方式為Student’s T- test。
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A
B
(Ⅰ-圖四) SCNN1B 基因的 mRNA 在 HCT116 細胞株連續繼代
培養三代之表現量比較A.將 HCT116 細胞株連續培養三代，分別抽取每代之 RNA 進行 RT-PCR 之結果圖 B.RT-PCT 之結果分析圖，從結果可觀察到從第一 代繼代到第三代，HCT116 細胞株中相較於貼盤細胞 (AD) SCNN1B 基因的表現量在類癌幹細胞 (SP) 中有上升的趨勢，並且在第三代達
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到顯差。重複至少三次獨立實驗之後，將其量化數據做統計分析並繪 出圖表，使用之統計方式為Student’s T- test (*：p<0.05)。
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(Ⅰ-圖五) SCNN1B 基因的 mRNA 在 DLD-1 細胞株連續繼代
培養三代，類癌幹細胞之表限量相較於貼盤細胞有較高的趨 勢。此為 p53 突變之大腸癌細胞株 DLD-1 連續培養三代後，分別抽 取每代之 RNA 進行 RT-PCR 分析之結果，可以觀察到 SCNN1B 基因 在經過繼代培養後在懸浮培養的類癌幹細胞 (SP) 中表現量皆高於 貼盤細胞 (AD)，這樣的結果與在 HCT116 細胞株所觀察到的結果有 相同的趨勢。
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A
B
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C
(Ⅰ-圖六) SCNN1B 基因的在對於臨床病患的影響。
A.利用 TCGA 資料庫中的統計資料進行大腸癌腫瘤檢體與正 常組織 SCNN1B 基因表現量的比較。由結果可知 SCNN1B 在大腸 癌患者腫瘤組織中的表現量並沒有高於正常組織。(Normal, n=
41，Primary tumor, n= 286) B.將不同階段進程之大腸癌腫瘤檢體以 及正常組織做 SCNN1B 基因的表現量比較，雖說相較於正常組 織，腫瘤檢體的表現量並沒有比正常組織的高，但隨著癌症的進 程，SCNN1B 基因的表現量有上升的趨勢。(Normal, n= 41，Stage1, n= 45，Stage2, n= 110，Stage3, n= 80，Stage4, n= 39)
C. SCNN1B 對於臨床病患存活率的影響，將病患群體依照 SCNN1B 表現量多寡分為兩群並比較其存活率，可以看到相較於
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SCNN1B 基因表現量較低的組別，表現量較高組別的存活率有下 降的趨勢，但沒有達顯差。(Low, n= 220，High, n= 220)
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Ⅱ、建立藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統
(Ⅱ-表一) 薑黃素配方乳液粒徑大小與濃度
表為不同薑黃素濃度的配方乳液，經過高速均質 (HS) 以及不同 次數的高壓均質 (HP) 後之粒徑大小。本研究中所使用之配方乳液選 用薑黃素濃度 0.75%之 HS、HP1 以及 HP4 組別。(配方乳液相關數據 由台灣大學食品科學研究所丁老師實驗室林冠汝同學提供)
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B
(Ⅱ-圖一)藥物吸收活細胞即時影像系統之前測試驗
A. U373 細胞株加入 100 µM 薑黃素 DMSO 溶液後第 0 分鐘、15 分鐘以及 30 分鐘之吸收結果。薑黃素本身有自體綠螢光。未加薑黃 素時並沒有綠螢光訊號，在第 80 秒加了薑黃素 DMSO 溶液之後，螢 光信號在第 100 秒就出現在細胞中，直到 30 分鐘後都還有綠螢光的 信號。(拍攝時長 30 分鐘，每 10 秒鐘拍一張照片，總共有 176 張，
影片中每一秒播放 8 張照片，影片時長共 22 秒) B. Caco-2 細胞株加 入 100 µM 薑黃素 DMSO 溶液後第 0 分鐘、15 分鐘以及 30 分鐘之吸 收結果，在第 20 秒加了薑黃素 DMSO 溶液之後，螢光信號在第 40
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秒就出現在細胞中，直到 30 分鐘後都還有綠螢光的信號。(拍攝時長 30 分鐘，每 10 秒鐘拍一張照片，總共有 180 張，影片中每一秒播放 5 張照片，影片時長共 36 秒)
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(Ⅱ-圖二) Caco-2 對於不同粒徑大小的薑黃乳液吸收效率
Caco-2 細胞株加入由台大食科所所提供之薑黃素乳液，乳液中薑 黃素濃度為 20 µM (0.75%)，經過不同均質程度形成不同的粒徑大 小，共五組，分別為 Curcumin (薑黃素粉末溶入中鍊三酸甘油脂中的 組別)、HS- Curcumin (經過高速均質)、HP1- Curcumin (經過 1 次高壓 均質)、HP4-Curcumin (經過 4 次高壓均質)以及 HP4 (經過 4 次高壓均 質，但不含薑黃素)，粒徑由大至小分別為 HS- Curcumin＞HP1- Curcumin＞HP4-Curcumin。“Curcumin”組為沒有經過均質化之控制 組，“HP4”則是做為沒有薑黃素之控制組，以證明乳液本身沒有螢光，60
螢光訊號來自薑黃素。從影片結果顯示，雖然螢光出現最快的組別是 HP4- Curcumin，但都滯留在邊緣，而螢光進入細胞內的速度最快的 是 HS- Curcumin 的組別，單就高壓均質組別的話，HP4-Curcumin 進 入細胞的效率則優於 HP1-Curcumin。(拍攝時長 30 分鐘，每 10 秒鐘 拍一張照片，總共有 180 張，影片中每一秒播放 5 張照片，影片時長 共 36 秒) (白線框出的部分為細胞；白色箭頭所指則為細胞內螢光出 現的地方；橘黃色箭頭所指為滯留在細胞膜之螢光信號)
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(Ⅱ-圖三) Caco-2 對於乳液吸收影像之螢光定量
將影像利用程式進行螢光定量後，將各組之螢光值以及其出現時 間點進行統計，並繪製圖表。A.將螢光訊號最早出現在細胞內的時間 記錄下來進行統計，可以觀察到未經過均質化的組別 (Curcumin) 到 了第 30 分鐘仍然沒有螢光信號出現在細胞內部，HP4-Curcumin 的組 別出現螢光的時間最早，但螢光進入細胞的時間晚於 HS-Curcumin，
HP1-Curcumin 螢光訊號則是三組配方乳液中最晚出現在細胞內部。
B.可以觀察到螢光的亮度 HP1-Curcumin 的組別低於 HS-Curcumin 以 及 HP4-Curcumin 的組別，而 HS-Curcumin 以及 HP4-Curcumin 的螢 光亮度卻沒有太大差異，未經過均質處理的 Curcumin 組別螢光量度 則 皆 低 於 其 餘 三 組 。 C. HS-Curcumin 、 HP1-Curcumin 以 及 HP4-Curcumin 螢光最大值出現的時間相差無幾，Curcumin 做為沒有 經過均質處理組別之對照組，雖然螢光量最大值出現的時間較其他組 早，但是螢光的強度卻是比較低的。(n=3)
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C
(Ⅱ-圖四)傳統研究藥物吸收之模型
A. Caco-2 細胞以 1×105顆∕well 的數量培養在 Transwell 中，第一 周每兩天換一次培養液，第二周開始每天換一次培養液，培養的第三 天開始每兩天測一次電阻值，第二周開始每天測一次點組值，並且利 用研究材料與方法中的式一以及式二算出每平方公分的單位電阻 值。統計圖是將 12well 每天測量的電阻值做平均後所得出的值，可 以看到在第三天電阻值就達到了約 560 左右，但在第二周電阻值就有 下降的趨勢，一直到第 19 天才慢慢回升，並在第 25 天達到達到實驗 所需之電阻值，故在第 25 天進行加藥。將統計完的數值 (原始數值) 每五天取一個點進行統計圖的繪製，可以清楚看到下降後再上升的趨 勢 (簡略數值)。B.使用 C18 管柱，以 0.1% H3PO4水溶液以及乙腈作
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為移動向，將體積流速設定為 1.5 mL/min，氘燈 (D2) 測量範圍設定 在 190-800 nm，計算在 425nm 的吸光度。將薑黃素分別配置成 0.3125、0.625、1、1.25、2.5 以及 5 ppm 的濃度進行 HPLC 分析，經 計算得出之波鋒面積繪製成標準曲線。C. 樣品經 EA 萃取風乾後，
用 DMSO 回溶並進行 HPLC 分析，將加藥後第 24 小時所測得之數據 進行分析並繪製圖表，可以觀察到 HS-Curcumin、HP4-Curcumin 以 及 HP1-Curcumin 的 組 別 都 有 被 細 胞 吸 收 ， HS-Curcumin 、 HP4-Curcumin 兩組吸收率並無明顯差異，而 HP1-Curcumin 的組別則 是薑黃素乳液中最差的，未經過均質處理的 Curcumin 組別則沒有被 吸收。
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