Ⅰ、The role of SCNN1B in stemloid of colorectal cancer
Ⅱ、Establishment of Cellular Live-Imaging Model for drug Absorption
研究生：林芷彤
Chih- Tung Lin
指導教授：賴韻如 博士
Yun- Ju Lai, Ph. D.
中華民國 107 年 7 月
致謝
能夠拿到這個學位要感謝很多人，這兩年間受到了很多人的幫 助，老師循循善誘的教導、同學夥伴的照顧還有家人父母的無條件支 持，真的非常感謝許多幫助我的人。研究並不是一條很好走的路，總 是要面多許許多多的挫折，對於平時鬆鬆散散的我沒什麼毅力的我來 說，這並不是一件容易的事情，想到實驗可能做不出來、家人失望的 面孔、不知道怎麼解釋的結果，這些壓力常常讓我想要放棄，但是面 對自己賭的這口氣，說甚麼都不能鬆掉，這是對於自己的一個挑戰，
也是希望可以看到一個不一樣的自己。
學著怎麼去安排每天的事情，學著去訂定一個目標，然後強迫自 己要去完成，每天都有不一樣的挑戰不一樣的挫折或者是成就感，可 以為了一個小小的結果開心大半天，也可以因為做不出結果而苦惱個 三五天，雖說很累很煩有時候壓力也很大，但不得不說真的很充實很 好玩。充實的日子過得飛快，轉眼已經兩年了，有很多很多感觸但卻 不知道怎麼用文字表達，跟實驗室的夥伴一起忙的火熱朝天也好，一 起吃飯閒聊也好，總結這兩年歡樂是大於辛苦的，大家也都要準備自 己規劃的未來前進，不過這分情誼應該適用遠都不會散的。
感謝台灣大學丁俞文老師提供的幫助，以及丁老師實驗室同學們 的幫忙，感謝台灣科技大學林柏廷老師在數據分析給我的建議以及教
導，感謝台灣大學醫學院余明俊老師在實驗儀器上的幫助，感謝台大 醫院黃約翰醫師、梁金銅醫師以及王助理所提供的病患檢體，感謝林 榮耀老師實驗室的各位學長們給我實驗的建議跟幫助。
真的十分開心可以進入賴韻如老師的研究室，很謝謝老師不厭其 煩的教導以及給予我的所有建議跟指教，感謝已經畢業的丹玉學姊給 我的關心跟建議，也很謝謝實驗室學長姐學弟妹們 (瑞真學姊、文善 學姊、信益、栩茵、幗瑛、宜翔、庭如、亭均、茂峻) 不離不棄的包 容，你們給我的關心總是能夠讓我在挫折中有繼續下去的動力，很謝 謝你們對我的照顧，讓我有這麼歡樂的研究生活，很高興能夠認識你 們。最後感謝願意無條件支持我的家人們，這兩年學到了很多也成長 了不少，謝謝大家。
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Ⅰ-1-3 SCNN1B (Sodium channel epithelial 1 beta subunit) ... 8
Ⅰ-2 研究材料與研究方法 ... 10
Ⅰ-2-5 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR ) ... 13
II
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縮寫表
縮寫 全名
AA Antibiotic- Antimycotic
ADME absorption, distribution, metabolism, excretion AJCC American Joint Committee on Cancer
bFGF basic fibroblast growth factor ACN Acetonitrile
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CRC Colorectal cancer
CRCSCs Colorectal cancer stem cell CSCs cancer stem cell
DBD DNA binding dimain
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA deoxyribonucleic acid EA ethyl acetate
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGF epidermal growth factor
FBS Fetal bovine serum
GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase HP High pressure
HPLC high performance liquid chromatography HS High speed
LC-MS/MS Liquid chromatography-tandem mass spectrometry MCT Medium Chain Triglyceride
MEM NEAA MEM Non-Essential Amino Acids miRNA Micro RNA
mRNA Messenger RNA
NCI National Cancer Institute
NHGRI National Human Genome Research Institute P/S Penicillin- Streptomycin
PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction
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RNA Ribonucleic acid RNA-Seq RNA Sequencing
RT-PCR reverse transcription-PCR
SCNN1B Sodium channel epithelial 1 beta subunit SDS Sodium dodecyl sulfate
TCGA The Cancer Genome Atlas
TEER Transepithelial/transendothelial electrical resistance TNM Tumor-node-metastasis
UICC Union for International Cancer Control
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Ⅰ、大腸直腸癌類癌幹細胞因子之探討
摘要
大腸癌 (colorectal cancer, CRC) 又稱為大腸直腸癌或結腸直腸 癌，由於其預後效果並不理想，即便經過治療，仍常發生轉移及復發 的情形。「癌幹細胞 (cancer stem cells, CSCs)」為腫瘤細胞中極少部 分類似幹細胞特性的細胞。然而這些細胞與腫瘤的發生、轉移、抗藥 性以及復發擁有密切的關係。目前常用於辨識癌幹細胞的生物標記，
如：CD133、CD44 等，但這些生物標記仍備受爭議。本研究中我們 利 用 腫 瘤 病 人 的 新 鮮 檢 體 培 養 得 來 之 貼 盤 細 胞 與 懸 浮 細 胞 球 (tumorsphere) 進行微陣列分析 (microarray assay)，實驗結果發現 SCNN1B 基因的表現量在類癌幹細胞中有較一般癌細胞多的趨勢；且 在大腸癌細胞株的繼代培養中亦觀察到相同的現象。因此，我們期望 透過研究 SCNN1B 對大腸癌幹細胞 (colorectal cancer stem cells, CRCSCs) 的影響，藉以找出大腸癌治療標靶的新穎生物標記。
關鍵字：大腸直腸癌、癌幹細胞、類癌幹細胞、標靶治療、SCNN1B
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Abstract
Colorectal cancer (CRC), also known as colon cancer, is the third most common cancer in Taiwan. Its prognosis is poor because of high rates of recurrence and metastasis. Cancer stem cells (CSCs) are few percentages of cells in a tumor which have characteristic of stem cell.
These cells are related to tumor initiation, metastasis, drug resistance, and relapse. Some biomarkers of CSCs have been found, such as CD133 and CD44. However, these biomarkers are still controversial. To identify more representative genes in regulation of colorectal cancer stem cells (CRCSCs), we performed microarray analysis and identify SCNN1B that expresses higher in tumor spheres than in adherent cancer cells derived from patients’ fresh specimens . We also observed the same phenomenon in CRC cell lines, HCT116 and DLD-1, and the tumorspheres derived from these cells for three passages. By studying the effects of SCNN1B on CRCSCs, we may identify a biomarker that serves as a new target in cancer therapy.
Key words: Colorectal cancer (CRC), cancer stem cells (CSCs), cancer stemloids, target therapy, SCNN1B
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Ⅰ-1 緒論
Ⅰ-1-1 大腸直腸癌 (Colorectal cancer, CRC)
大腸直腸癌 (Colorectal cancer, CRC)，俗稱為大腸癌，可能罹患 部位囊括了盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸以及直腸，依 照癌症發生的部位不同可分為大腸癌以及直腸癌，而其組織型態的不 同也有不同的分類 (如：腺癌、鱗狀細胞癌、淋巴癌等)。大腸癌通常 源自於良性腫瘤，隨著時間的演變最終形成惡性腫瘤[1]，大腸癌在全 球發生率高居第三，在台灣大腸癌的罹患率也是居高不下，根據 2017 年衛生福利部國民健康署統計，大腸癌第九度蟬聯台灣男性國人十大 癌症榜首，女性則是僅次於乳癌位居第二，罹患的人數相比於去年也 有所增加[2, 3]，且罹患的年齡層也有逐漸下降的趨勢[4-8]。大腸癌晚 期的治癒率極低，預後效果並不理想，容易轉移及復發，儘管隨著醫 療科技的進步，癌症的治療成效和患者的生活品質也得到了一定的改 善與提升，但是大腸癌晚期的患者，仍面臨癌症復發與轉移的難題[9, 10]。
目前國內對於大腸癌的診斷方式有很多，諸如：大腸鏡、核磁共 振、電腦斷層掃描、糞便潛血檢查、肛門指診等[11, 12]，然而這些診
6 (American Joint Committee on Cancer, AJCC) 依照癌症病理狀態所作 之分期系統來做為診斷癌症的分期依據[13]。
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本研究的目標希望可以找出大腸癌幹細胞的新穎生物標記，希望 能夠使診斷更為精確並提升大腸癌的治療品質及效果。
Ⅰ-1-2 癌幹細胞假說 (Cancer stem cell theory)
近年來，研究癌症的學者們認為在腫瘤細胞中有一小群細胞擁有 幹細胞的特性，如：自我更新 (Self- renew)、不對稱複製 (asymmetric division) 等，因此被稱為「癌幹細胞」(cancer stem cell) [20]。這些細 胞只需要少數存在即可造成腫瘤的產生，所以也稱「腫瘤生成細胞」
(tumor initiation cell)。這些癌幹細胞被認為與腫瘤的產生、癌症的轉 移、復發以及抗藥性有密切的關係[21]，因此引起癌症治療相關研究 的關注，希望可以藉由殺死癌幹細胞，達到完全治療癌症的效果。目 前普遍認為癌幹細胞的標記為：CD133、CD44 等[22] 。
但是這些分子並不只有在癌幹細胞中出現。如：CD133，也表現 在正常組織表面，因此懷疑其專一性不夠，故不足以作為大腸癌幹細 胞的生物標記[23]。另外有研究顯示，從腫瘤組織中可以分離出 CD133
＋和 CD133－兩種細胞，而實驗證明這兩種細胞都可以形成腫瘤，只是 CD133＋細胞的侵略性要強於 CD133－細胞[24, 25]。
所以希望透過本研究，能夠針對大腸直腸癌幹細胞找出專一性更 高的癌幹細胞標記，藉以提升大腸癌的診斷準確性、治療效果及品質。
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Ⅰ-1-3 SCNN1B (Sodium channel epithelial 1 beta subunit)
SCNN1B 蛋白質是上皮細胞鈉離子通道的一個次單元，該鈉離子 通道是由三個次單元組成，分別是 α、β 跟 γ，或者是 δ、β 跟 γ，由 於這個離子通道會受到 Amiloride 的抑制，所以又稱為 Amiloride- sensitive sodium channel[26, 27]。
不同於在神經細胞的鈉離子通道利用細胞膜兩邊所形成的電位 差導致離子通道開啟，這種組合型的離子通道只需要這三種次單元組 合便能形成，與膜電位差並無關係。此種離子通道常出現在腎臟、肺 臟及腸道等器官，對於滲透壓以及血壓的調節有很重要的作用，這種 非因電位差啟動的鈉離子通道 (NON-voltage-gated) 若其中組成的一 個次單元喪失功能或者損毀，將會導致血壓的相關疾病[28]。目前對 於 SCNN1B 是否還有其他功能，或者是在體內機制中扮演甚麼角色 仍然需要更進一步的研究。
由於先前實驗室將從台大醫院所取得的大腸癌患者檢體進行初 級培養，將培養出的貼盤細胞以及懸浮培養的類癌幹細胞球收取其 RNA 進行 microarray 分析，發現 SCNN1B 基因在類癌幹細胞的表現 量高於一般癌細胞。在腸道中 SCNN1B 所屬的鈉離子通道是比較常 出現的一種通道蛋白質，希望能夠藉由研究 SCNN1B 在大腸癌幹細
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胞 中 扮 演 的調 控角 色 ， 更 加 了 解大 腸 癌 幹 細胞 的機 制 ， 並 期望 SCNN1B 可以成為辨識大腸癌幹細胞或治療大腸癌的關鍵。
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Ⅰ-2 研究材料與研究方法
Ⅰ-2-1 細胞培養(Cell culture)
Ⅰ-2-1.1 貼盤細胞培養
將大腸癌細胞株 HCT116、HT-29 及 DLD-1 培養於 10 公分細胞 培養皿 (FALCON, 353003) 中，並使用含有 10%胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS, A6806-11, NQBB)、1% P/S 抗生素 (Penicillin- Streptomycin, Pen-Strep, 15140-122, Gibco) 的 RPMI 1640 (23400-021, Gibco) 培養液，以 5% CO2、37℃的條件在培養箱中培養。
Ⅰ-2-1.2 懸浮細胞培養
大腸癌的類癌幹細胞 (tumorsphere) 為將貼盤細胞培養於不含胎 牛血清的 DMEM/ F-12 (12400-024, Gibco) 培養液，另外加入 1% P/S 抗生素 (Penicillin- Streptomycin, Pen-Strep, 15140-122, Gibco)、1X B-27 (12587-010, Gibco)、10 ng/mL 表皮生長因子 (Epidermal growth factor, EGF, PHG0-314, Gibco) 以及 10 ng/ mL 鹼性纖維母細胞生長 因子 (Basic fibroblast growth factor, bFGF, 13256-029, Gibco)，置於 6
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公分 non- coating 的細胞培養皿 (16021-6S, Alpha plus) ，以 5% CO2、 37℃的條件在培養箱中進行懸浮培養。
Ⅰ-2-2 初級細胞培養 (Primary cell culture)
我 們 從 台 灣 大 學 醫 學 院 附 設 醫 院 外 科 部 (IRB-form No.
1033703499) 取得其所提供的大腸癌患者組織檢體後，先用含有 1%
P/S 抗生素的磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (Phosphate buffered saline, PBS, 00-300, Invitrogen) 沖洗數次，並泡在含有 1% P/S 抗生素的 PBS 中，
將檢體剪碎直到近似漿狀，將剪成漿狀的檢體加入裝有 25 mL ~ 35 mL 酵素液 (Enzyme solution, 5 mL 0.25% Trypsin- EDTA、1 mL 膠原 蛋白酶、以 PBS 加至 100 mL)的錐形瓶中，將經過消毒的磁石攪拌棒 (Stir bar) 放入錐形瓶，移至加熱攪拌器上以 30℃ ~ 40℃攪拌 30 ~ 60 分鐘，將攪拌過後的錐形瓶斜放讓細胞碎塊沉澱，取上清液離心，將 離心下來的細胞分別用含有 20% FBS 的 RPMI 1640 加上含有 20%
FBS 的 DMEM 培養液以及 DMEM/ F-12 加入 1X B-27、10 ng/mL EGF 以及 10 ng/mL bFGF 的培養液回溶，在 5% CO2、37℃的條件下培養 貼盤及懸浮細胞。上述的細胞培養中抗生素除了 1% P/S 之外，另外 會再加入100 μg/mL Gentamicin (15750-60, Gibco) 以及 1X antibiotic-
FBS 的 DMEM 培養液以及 DMEM/ F-12 加入 1X B-27、10 ng/mL EGF 以及 10 ng/mL bFGF 的培養液回溶，在 5% CO2、37℃的條件下培養 貼盤及懸浮細胞。上述的細胞培養中抗生素除了 1% P/S 之外，另外 會再加入100 μg/mL Gentamicin (15750-60, Gibco) 以及 1X antibiotic-