Ⅰ、SCNN1B於大腸直腸癌類癌幹細胞之角色探討 / Ⅱ、建立藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統

全文

(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. Ⅰ、SCNN1B 於大腸直腸癌類癌幹細胞之角色探討 Ⅱ、建立藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統 Ⅰ、The role of SCNN1B in stemloid of colorectal cancer Ⅱ、Establishment of Cellular Live-Imaging Model for drug Absorption. 研究生：林芷彤 Chih- Tung Lin. 指導教授：賴韻如博士 Yun- Ju Lai, Ph. D.. 中華民國 107 年 7 月.

(2) 致謝能夠拿到這個學位要感謝很多人，這兩年間受到了很多人的幫助，老師循循善誘的教導、同學夥伴的照顧還有家人父母的無條件支持，真的非常感謝許多幫助我的人。研究並不是一條很好走的路，總是要面多許許多多的挫折，對於平時鬆鬆散散的我沒什麼毅力的我來說，這並不是一件容易的事情，想到實驗可能做不出來、家人失望的面孔、不知道怎麼解釋的結果，這些壓力常常讓我想要放棄，但是面對自己賭的這口氣，說甚麼都不能鬆掉，這是對於自己的一個挑戰，也是希望可以看到一個不一樣的自己。學著怎麼去安排每天的事情，學著去訂定一個目標，然後強迫自己要去完成，每天都有不一樣的挑戰不一樣的挫折或者是成就感，可以為了一個小小的結果開心大半天，也可以因為做不出結果而苦惱個三五天，雖說很累很煩有時候壓力也很大，但不得不說真的很充實很好玩。充實的日子過得飛快，轉眼已經兩年了，有很多很多感觸但卻不知道怎麼用文字表達，跟實驗室的夥伴一起忙的火熱朝天也好，一起吃飯閒聊也好，總結這兩年歡樂是大於辛苦的，大家也都要準備自己規劃的未來前進，不過這分情誼應該適用遠都不會散的。感謝台灣大學丁俞文老師提供的幫助，以及丁老師實驗室同學們的幫忙，感謝台灣科技大學林柏廷老師在數據分析給我的建議以及教.

(3) 導，感謝台灣大學醫學院余明俊老師在實驗儀器上的幫助，感謝台大醫院黃約翰醫師、梁金銅醫師以及王助理所提供的病患檢體，感謝林榮耀老師實驗室的各位學長們給我實驗的建議跟幫助。真的十分開心可以進入賴韻如老師的研究室，很謝謝老師不厭其煩的教導以及給予我的所有建議跟指教，感謝已經畢業的丹玉學姊給我的關心跟建議，也很謝謝實驗室學長姐學弟妹們 (瑞真學姊、文善學姊、信益、栩茵、幗瑛、宜翔、庭如、亭均、茂峻) 不離不棄的包容，你們給我的關心總是能夠讓我在挫折中有繼續下去的動力，很謝謝你們對我的照顧，讓我有這麼歡樂的研究生活，很高興能夠認識你們。最後感謝願意無條件支持我的家人們，這兩年學到了很多也成長了不少，謝謝大家。.

(4) 目錄縮寫表............................................................................................................................ 1 Ⅰ、大腸直腸癌類癌幹細胞因子之探討.................................................................... 3 摘要................................................................................................................................ 3 Abstract .......................................................................................................................... 4 Ⅰ-1 緒論 ....................................................................................................................... 5 Ⅰ-1-1 大腸直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) .................................................... 5 Ⅰ-1-2 癌幹細胞假說 (Cancer stem cell theory) ................................................ 7 Ⅰ-1-3 SCNN1B (Sodium channel epithelial 1 beta subunit) ................................ 8 Ⅰ-2 研究材料與研究方法 ......................................................................................... 10 Ⅰ-2-1 細胞培養(Cell culture) ........................................................................... 10 Ⅰ-2-1.1 貼盤細胞培養 .............................................................................. 10 Ⅰ-2-1.2 懸浮細胞培養 .............................................................................. 10 Ⅰ-2-2 初級細胞培養 (Primary cell culture) .................................................... 11 Ⅰ-2-3 細胞及組織 RNA 萃取 (RNA extraction from cell line and tissue) ..... 12 Ⅰ-2-4 RNA 定量 ................................................................................................ 13 Ⅰ-2-5 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR ) .............................................................................................. 13 Ⅰ-2-6 細胞蛋白質萃取 ..................................................................................... 14 Ⅰ-2-7 數據資料庫分析 ..................................................................................... 15 Ⅰ-2-8 統計結果分析 ......................................................................................... 15 Ⅰ-3 結果 ..................................................................................................................... 16 Ⅰ-3-1 SCNN1B 其 mRNA 在檢體培養的類癌幹細胞中表現量高於同為檢體培養之貼盤細胞.................................................................................................. 16 Ⅰ-3-2 SCNN1B 其 mRNA 在大腸癌細胞株的表現差異 ................................ 16 Ⅰ-3-3 繼代培養的細胞株，其 SCNN1B 基因 mRNA 之差異 ...................... 17 Ⅰ-3-4 SCNN1B 基因在 p53 突變之細胞株 DLD-1 的表現量 ........................ 17 Ⅰ-3-5 SCNN1B 基因表現量多寡對於大腸癌病患存活率的影響.................. 18 Ⅰ-4 討論 ..................................................................................................................... 19 Ⅱ、建立藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統...................................................... 22 摘要.............................................................................................................................. 22 Abstract ........................................................................................................................ 23 Ⅱ-1 緒論 ..................................................................................................................... 24 Ⅱ-1-1 口服藥物在體內的吸收 ......................................................................... 24 Ⅱ-1-2 研究藥物吸收常用之模型 ..................................................................... 25 Ⅱ-1-2.1 非生物藥物吸收模型 .................................................................. 26 Ⅱ-1-2.2 體內藥物吸收模型 ...................................................................... 26 I.

(5) Ⅱ-1-2.3 體外藥物吸收模型 ...................................................................... 27 Ⅱ-1-3 藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統 ................................................. 28 Ⅱ-2 研究材料與研究方法 ......................................................................................... 29 Ⅱ-2-1 細胞培養 ................................................................................................. 29 Ⅱ-2-2 活細胞即時影像觀測系統模型建立 ..................................................... 30 Ⅱ-2-2.1 細胞製備 ...................................................................................... 30 Ⅱ-2-2.2 薑黃素乳化液 .............................................................................. 30 Ⅱ-2-2-3 共軛焦顯微鏡拍攝.............................................................................. 31 Ⅱ-2-3 傳統藥物吸收體外模型 ......................................................................... 31 Ⅱ-2-3.1 以 Transwell 培養細胞 ................................................................ 31 Ⅱ-2-3.2 跨膜電阻的測量及計算 .............................................................. 32 Ⅱ-2-3.3 HPLC 樣品的製備 ........................................................................ 33 Ⅱ-2-4 HPLC ........................................................................................................ 33 Ⅱ-2-4 統計分析 ................................................................................................. 34 Ⅱ-3. 結果 ................................................................................................................... 35 Ⅱ-3-1 U373-MG 細胞株之前測試驗 ................................................................ 35 Ⅱ-3-2 Caco-2 細胞株之前測試驗 ..................................................................... 35 Ⅱ-3-3 Caco-2 對於薑黃乳化液之吸收 ............................................................. 36 Ⅱ-3-4 傳統 Transwell 方法實測細胞吸收 ....................................................... 38 Ⅱ-3-4.1 傳統藥物研究模型 ....................................................................... 38 Ⅱ-3-4.2 HPLC 之檢測結果 ........................................................................ 39 Ⅱ-4. 討論 ................................................................................................................... 40 Ⅲ、圖表...................................................................................................................... 44 Ⅳ、參考文獻.............................................................................................................. 66. II.

(6) 縮寫表縮寫 AA ADME AJCC bFGF ACN cDNA CRC CRCSCs CSCs DBD DMEM DMSO DNA EA EDTA EGF FBS GAPDH HP HPLC HS LC-MS/MS MCT MEM NEAA miRNA mRNA NCI NHGRI P/S PBS PCR. 全名 Antibiotic- Antimycotic absorption, distribution, metabolism, excretion American Joint Committee on Cancer basic fibroblast growth factor Acetonitrile Complementary deoxyribonucleic acid Colorectal cancer Colorectal cancer stem cell cancer stem cell DNA binding dimain Dulbecco's Modified Eagle Medium Dimethyl sulfoxide deoxyribonucleic acid ethyl acetate Ethylenediaminetetraacetic acid epidermal growth factor Fetal bovine serum Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase High pressure high performance liquid chromatography High speed Liquid chromatography-tandem mass spectrometry Medium Chain Triglyceride MEM Non-Essential Amino Acids Micro RNA Messenger RNA National Cancer Institute National Human Genome Research Institute Penicillin- Streptomycin Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction 1.

(7) RNA RNA-Seq RT-PCR SCNN1B SDS TCGA TEER TNM UICC. Ribonucleic acid RNA Sequencing reverse transcription-PCR Sodium channel epithelial 1 beta subunit Sodium dodecyl sulfate The Cancer Genome Atlas Transepithelial/transendothelial electrical resistance Tumor-node-metastasis Union for International Cancer Control. 2.

(8) Ⅰ、大腸直腸癌類癌幹細胞因子之探討. 摘要大腸癌 (colorectal cancer, CRC) 又稱為大腸直腸癌或結腸直腸癌，由於其預後效果並不理想，即便經過治療，仍常發生轉移及復發的情形。「癌幹細胞 (cancer stem cells, CSCs)」為腫瘤細胞中極少部分類似幹細胞特性的細胞。然而這些細胞與腫瘤的發生、轉移、抗藥性以及復發擁有密切的關係。目前常用於辨識癌幹細胞的生物標記，如：CD133、CD44 等，但這些生物標記仍備受爭議。本研究中我們利用腫瘤病人的新鮮檢體培養得來之貼盤細胞與懸浮細胞球 (tumorsphere) 進行微陣列分析 (microarray assay)，實驗結果發現 SCNN1B 基因的表現量在類癌幹細胞中有較一般癌細胞多的趨勢；且在大腸癌細胞株的繼代培養中亦觀察到相同的現象。因此，我們期望透過研究 SCNN1B 對大腸癌幹細胞 (colorectal cancer stem cells, CRCSCs) 的影響，藉以找出大腸癌治療標靶的新穎生物標記。關鍵字：大腸直腸癌、癌幹細胞、類癌幹細胞、標靶治療、SCNN1B. 3.

(9) Abstract Colorectal cancer (CRC), also known as colon cancer, is the third most common cancer in Taiwan. Its prognosis is poor because of high rates of recurrence and metastasis. Cancer stem cells (CSCs) are few percentages of cells in a tumor which have characteristic of stem cell. These cells are related to tumor initiation, metastasis, drug resistance, and relapse. Some biomarkers of CSCs have been found, such as CD133 and CD44. However, these biomarkers are still controversial. To identify more representative genes in regulation of colorectal cancer stem cells (CRCSCs), we performed microarray analysis and identify SCNN1B that expresses higher in tumor spheres than in adherent cancer cells derived from patients’ fresh specimens . We also observed the same phenomenon in CRC cell lines, HCT116 and DLD-1, and the tumorspheres derived from these cells for three passages. By studying the effects of SCNN1B on CRCSCs, we may identify a biomarker that serves as a new target in cancer therapy. Key words: Colorectal cancer (CRC), cancer stem cells (CSCs), cancer stemloids, target therapy, SCNN1B. 4.

(10) Ⅰ-1 緒論. Ⅰ-1-1 大腸直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) 大腸直腸癌 (Colorectal cancer, CRC)，俗稱為大腸癌，可能罹患部位囊括了盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸以及直腸，依照癌症發生的部位不同可分為大腸癌以及直腸癌，而其組織型態的不同也有不同的分類 (如：腺癌、鱗狀細胞癌、淋巴癌等)。大腸癌通常源自於良性腫瘤，隨著時間的演變最終形成惡性腫瘤[1]，大腸癌在全球發生率高居第三，在台灣大腸癌的罹患率也是居高不下，根據 2017 年衛生福利部國民健康署統計，大腸癌第九度蟬聯台灣男性國人十大癌症榜首，女性則是僅次於乳癌位居第二，罹患的人數相比於去年也有所增加[2, 3]，且罹患的年齡層也有逐漸下降的趨勢[4-8]。大腸癌晚期的治癒率極低，預後效果並不理想，容易轉移及復發，儘管隨著醫療科技的進步，癌症的治療成效和患者的生活品質也得到了一定的改善與提升，但是大腸癌晚期的患者，仍面臨癌症復發與轉移的難題[9, 10]。目前國內對於大腸癌的診斷方式有很多，諸如：大腸鏡、核磁共振、電腦斷層掃描、糞便潛血檢查、肛門指診等[11, 12]，然而這些診 5.

(11) 斷方式依然存在著缺失，例如：肛門指診是最簡單的檢查方式，但可能因為醫生的主觀判斷有誤導致誤診；由於腫瘤並非隨時都在出血，肛門附近疾病以及腸胃道相關疾病，如：痔瘡、潰瘍或腸胃發炎等，也會造成糞便潛血的狀況，故檢查出糞便潛血並不能完全確診為大腸癌；大腸鏡則因為腸道內有許多皺褶及彎曲，大腸鏡的視野容易出現死角造成誤判，所以目前大腸癌的診斷常用多種檢查方式確保診斷的準確性。大腸癌的診斷結果則以國際臨床分期系統，國際癌症聯盟 (Union for International Cancer Control, UICC) 所建立的 TNM (Tumor-node-metastasis) 分期系統，以及美國癌症聯合委員會 (American Joint Committee on Cancer, AJCC) 依照癌症病理狀態所作之分期系統來做為診斷癌症的分期依據[13]。大腸癌的治療方式通常根據分期結果來選擇。目前的治療方式主要以外科手術為主，再輔以化學治療、放射治療、標靶治療等[14-16]。儘管隨著醫療科技的進步以及品質的提升，已有許多藥物被用來做為臨床的治療用藥，像是 Fluorouracil[17]、Irinotecan[18]、Oxaliplatin[19] 等，但化學治療以及放射性治療的副作用極強，依照患者的身體狀況也可能出現不同的徵狀，使病人的情況更為複雜，且隨著大腸癌的階段推進，治療的效果會越來越差，復發與轉移的情況也可能一再的發生。 6.

(12) 本研究的目標希望可以找出大腸癌幹細胞的新穎生物標記，希望能夠使診斷更為精確並提升大腸癌的治療品質及效果。. Ⅰ-1-2 癌幹細胞假說 (Cancer stem cell theory) 近年來，研究癌症的學者們認為在腫瘤細胞中有一小群細胞擁有幹細胞的特性，如：自我更新 (Self- renew)、不對稱複製 (asymmetric division) 等，因此被稱為「癌幹細胞」(cancer stem cell) [20]。這些細胞只需要少數存在即可造成腫瘤的產生，所以也稱「腫瘤生成細胞」 (tumor initiation cell)。這些癌幹細胞被認為與腫瘤的產生、癌症的轉移、復發以及抗藥性有密切的關係[21]，因此引起癌症治療相關研究的關注，希望可以藉由殺死癌幹細胞，達到完全治療癌症的效果。目前普遍認為癌幹細胞的標記為：CD133、CD44 等[22] 。但是這些分子並不只有在癌幹細胞中出現。如：CD133，也表現在正常組織表面，因此懷疑其專一性不夠，故不足以作為大腸癌幹細胞的生物標記[23]。另外有研究顯示，從腫瘤組織中可以分離出 CD133 ＋. 和 CD133－兩種細胞，而實驗證明這兩種細胞都可以形成腫瘤，只是. CD133＋細胞的侵略性要強於 CD133－細胞[24, 25]。所以希望透過本研究，能夠針對大腸直腸癌幹細胞找出專一性更高的癌幹細胞標記，藉以提升大腸癌的診斷準確性、治療效果及品質。 7.

(13) Ⅰ-1-3 SCNN1B (Sodium channel epithelial 1 beta subunit) SCNN1B 蛋白質是上皮細胞鈉離子通道的一個次單元，該鈉離子通道是由三個次單元組成，分別是 α、β 跟 γ，或者是 δ、β 跟 γ，由於這個離子通道會受到 Amiloride 的抑制，所以又稱為 Amiloridesensitive sodium channel[26, 27]。不同於在神經細胞的鈉離子通道利用細胞膜兩邊所形成的電位差導致離子通道開啟，這種組合型的離子通道只需要這三種次單元組合便能形成，與膜電位差並無關係。此種離子通道常出現在腎臟、肺臟及腸道等器官，對於滲透壓以及血壓的調節有很重要的作用，這種非因電位差啟動的鈉離子通道 (NON-voltage-gated) 若其中組成的一個次單元喪失功能或者損毀，將會導致血壓的相關疾病[28]。目前對於 SCNN1B 是否還有其他功能，或者是在體內機制中扮演甚麼角色仍然需要更進一步的研究。由於先前實驗室將從台大醫院所取得的大腸癌患者檢體進行初級培養，將培養出的貼盤細胞以及懸浮培養的類癌幹細胞球收取其 RNA 進行 microarray 分析，發現 SCNN1B 基因在類癌幹細胞的表現量高於一般癌細胞。在腸道中 SCNN1B 所屬的鈉離子通道是比較常出現的一種通道蛋白質，希望能夠藉由研究 SCNN1B 在大腸癌幹細 8.

(14) 胞中扮演的調控角色，更加了解大腸癌幹細胞的機制，並期望 SCNN1B 可以成為辨識大腸癌幹細胞或治療大腸癌的關鍵。. 9.

(15) Ⅰ-2 研究材料與研究方法. Ⅰ-2-1 細胞培養(Cell culture) Ⅰ-2-1.1 貼盤細胞培養將大腸癌細胞株 HCT116、HT-29 及 DLD-1 培養於 10 公分細胞培養皿 (FALCON, 353003) 中，並使用含有 10%胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS, A6806-11, NQBB)、1% P/S 抗生素 (PenicillinStreptomycin, Pen-Strep, 15140-122, Gibco) 的 RPMI 1640 (23400-021, Gibco) 培養液，以 5% CO2、37℃的條件在培養箱中培養。. Ⅰ-2-1.2 懸浮細胞培養大腸癌的類癌幹細胞 (tumorsphere) 為將貼盤細胞培養於不含胎牛血清的 DMEM/ F-12 (12400-024, Gibco) 培養液，另外加入 1% P/S 抗生素 (Penicillin- Streptomycin, Pen-Strep, 15140-122, Gibco)、1X B-27 (12587-010, Gibco)、10 ng/mL 表皮生長因子 (Epidermal growth factor, EGF, PHG0-314, Gibco) 以及 10 ng/ mL 鹼性纖維母細胞生長因子 (Basic fibroblast growth factor, bFGF, 13256-029, Gibco)，置於 6. 10.

(16) 公分 non- coating 的細胞培養皿 (16021-6S, Alpha plus) ，以 5% CO2、 37℃的條件在培養箱中進行懸浮培養。. Ⅰ-2-2 初級細胞培養 (Primary cell culture) 我們從台灣大學醫學院附設醫院外科部 (IRB-form No. 1033703499) 取得其所提供的大腸癌患者組織檢體後，先用含有 1% P/S 抗生素的磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (Phosphate buffered saline, PBS, 00-300, Invitrogen) 沖洗數次，並泡在含有 1% P/S 抗生素的 PBS 中，將檢體剪碎直到近似漿狀，將剪成漿狀的檢體加入裝有 25 mL ~ 35 mL 酵素液 (Enzyme solution, 5 mL 0.25% Trypsin- EDTA、1 mL 膠原蛋白酶、以 PBS 加至 100 mL)的錐形瓶中，將經過消毒的磁石攪拌棒 (Stir bar) 放入錐形瓶，移至加熱攪拌器上以 30℃ ~ 40℃攪拌 30 ~ 60 分鐘，將攪拌過後的錐形瓶斜放讓細胞碎塊沉澱，取上清液離心，將離心下來的細胞分別用含有 20% FBS 的 RPMI 1640 加上含有 20% FBS 的 DMEM 培養液以及 DMEM/ F-12 加入 1X B-27、10 ng/mL EGF 以及 10 ng/mL bFGF 的培養液回溶，在 5% CO2、37℃的條件下培養貼盤及懸浮細胞。上述的細胞培養中抗生素除了 1% P/S 之外，另外會再加入 100 μg/mL Gentamicin (15750-60, Gibco) 以及 1X antibioticantimycotic (AA, 15240-062, Gibco) 兩種抗生素。 11.

(17) Ⅰ-2-3 細胞及組織 RNA 萃取 (RNA extraction from cell line. and tissue) 將貼盤細胞的培養液移除後，用 PBS 清洗兩遍，加入 500 μL Trypsin，並在 37℃培養箱中反應 3 到 5 分鐘，加入 1.5 mL 培養基中和反應後離心，而懸浮細胞則將細胞液收集到 15 mL 離心管中，以 1,000 rpm 離心 1 分鐘去除培養液，加入 200 μL Trypsin，在 37℃培養箱中反應 3 到 5 分鐘，加入等量 Trypsin inhibitor 終止反應後離心，取 500 μL 的 TRIzol (15596-018, Invitrogen)與去除上清液的細胞混勻。腫瘤組織則將從台大取得的腫瘤檢體取三分之一泡在 500 μL 的 TRIzol (15596-018, Invitrogen) 中，用組織研磨棒進行研磨 3 到 5 分鐘。將已經混好 500 μL TRIzol 的細胞或檢體，於室溫下在 shaker 上搖晃 10 分鐘，加入 100 μL 的氯仿 (918001, J.T.Baker)，震盪 40 秒，以 4 ℃、13,200 rpm 離心 20 分鐘，取最上層的澄清液置入新的微量離心管中 (約 200 ~ 250 μL)，加入等體積的異丙醇 (Isopropanol, A10335-0500, Bionovas)，輕輕搖晃十到十五下，置於-20℃冰箱一個晚上使 RNA 析出，之後以 4℃、13,200 rpm 離心 20 分鐘去掉上清液， 12.

(18) 並加入 200 μL 70%的酒精清洗，重複此步驟清洗兩次後，於無菌操作台風乾，風乾後加入 10 μL 滅菌過後的二次水，以 56℃加熱 10 分鐘回溶，並保存於-80℃冰箱中。. Ⅰ-2-4 RNA 定量萃取後的 RNA 利用分光光度計 (Spectrophotometer ND-1000, Nano Drop)，來測量濃度 (ng/µL) 以及檢視 RNA 品質，OD260/OD280 為純度的判定標準，OD260/OD230 則為 RNA 鹽類污染的情形，我們用來做後續實驗所使用的 RNA，其 OD260/OD280 > 1.8，OD260/OD230> 2.0。. Ⅰ-2-5 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription. Polymerase chain reaction, RT-PCR ) 將定量後的 RNA 取 2 μg，並加水稀釋至 0.2 μg/mL 再加入 1 μL Random primer (Genestar)，並以 70℃加熱 10 分鐘，使 primer 跟 RNA 結合。加入 14 μL Reverse transcriptase buffer (RNase inhibitor、 HiScript I Reverse Transcriptase、1mM dNTP) 於 37℃水浴槽反應 1 小時，保存於-20℃。取 2 μg cDNA，加入 23 μL PCR Buffer (12.5 μL Taq 2x Master Mix Red, 1.5 mM MgCl2、1.25 μL Enhancer、forward and reverse primer 各 13.

(19) 0.5 μL、8.25 μL 二次水)，充分混和之後置於聚合酶連鎖反應器中反應，反應條件為：Stage 1：95℃、2 分鐘；Stage 2：95℃、30 秒；60℃、 30 秒；72℃、30 秒重複 45 個 cycle；Stage 3：72℃、7 分鐘，結束後溫度停留在 4℃暫存。PCR 反應完成後，利用 DNA 電泳來確認結果，條件為：1% Agarose gel (Agarose Low EEO, Bionovas)，100 V, 35 分鐘。. Ⅰ-2-6 細胞蛋白質萃取將貼盤細胞的培養液移除後，用 PBS 清洗兩遍，加入 500 μL Trypsin，並在 37℃培養箱中反應 3 到 5 分鐘，加入 1.5 mL 培養液中和反應後離心將細胞收下，而懸浮細胞連同培養液收至離心管當中，用 1,000 rpm 離心 1 分鐘去掉培養液，加入 100 μL SDS lysis buffer (1%Sodium dodecyl sulfate、pH6.8 60 mM Tris-HCl) 混勻。檢體部分則在醫院時先將腫瘤組織塊放入含有 500 μL SDS lysis buffer，利用滅菌後的組織研磨棒及電動攪拌器研磨 10 到 15 分鐘 (沒有馬上處裡則保存於-80℃冰箱中)。將混於 SDS lysis buffer 中的細胞或檢體置於 95℃加熱板上 3 到 5 分鐘，以 10 秒/次的頻率進行超音波震盪兩次，讓細胞膜構造可以完全震碎，定量蛋白質含量或保存於-80℃冰箱中。 14.

(20) Ⅰ-2-7 數據資料庫分析本研究中利用 OncoLnc[29]進行 SCNN1B 基因與大腸癌患者的存活率分析，並利用 UALCAN[30]進行 SNN1B 在大腸癌病患檢體的 mRNA 表現量分析。OncoLnc 以及 UALCAN 包含來自 TCGA (The Cancer Genome Atlas) 資料庫中 21 種癌症病患的生存數據，以及 TCGA 的 mRNA 與 miRNA 的 RNA-Seq 表達數據。TCGA 蒐集了大量臨床癌症病患組織的資料庫，是目前臨床癌症研究中比較完整的數據資料庫[31]。. Ⅰ-2-8 統計結果分析 PCR 電泳結果使用 Image J 軟體進行量化分析，以 GAPDH 作為 loading control，將貼盤細胞的結果作為標準值，比較同組之中類癌幹細胞的量化數值，即為 SCNN1B 基因之 mRNA 在類癌幹細胞中的相對表現量 (GAPDH 以及 SCNN1B 的 PCR 產物長度皆約為 300 bp)。統計分析方法使用 Student’s T- test 分析比較兩組間的顯著差異。. 15.

(21) Ⅰ-3 結果. Ⅰ-3-1 SCNN1B 其 mRNA 在檢體培養的類癌幹細胞中表現量高於同為檢體培養之貼盤細胞因為實驗室先前的 microarray 分析僅取一個病人的檢體做比較，為檢測 SCNN1B 在懸浮的類癌幹細胞表現較一般癌細胞多的現象不僅限於單一檢體，我們將其他同樣由台大醫院提供的病患檢體，做貼盤以及懸浮細胞培養，抽取 RNA 做反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR ) 分析，其結果也顯示 SCNN1B 基因的 mRNA 在懸浮培養的類癌幹細胞 (Sphere, SP) 中表現量高於貼盤培養的細胞 (Adherent, AD) (Ⅰ-圖一)。. Ⅰ-3-2 SCNN1B 其 mRNA 在大腸癌細胞株的表現差異由於病患的檢體數量有限，所以我們選用兩株大腸癌的細胞株， HCT116、HT-29，分別培養出兩株細胞的貼盤細胞以及懸浮類癌幹細胞球，萃取其 RNA 以 RT- PCR 分析，觀察 SCNN1B 的 mRNA 在貼盤及類癌幹細胞球中的表現量差異。發現在 HCT116 細胞株中， SCNN1B 的表現量在類癌幹細胞有高於貼盤細胞的趨勢 (Ⅰ-圖二 A) 16.

(22) 並且達到具有統計意義的顯著差異 (Ⅰ-圖二 B)。而 HT-29 細胞株則未觀察到與 HCT116 相同的結果，其 SCNN1B 的 mRNA 在貼盤細胞的表現量並未低於懸浮培養的癌幹細胞球，甚至有上升的趨勢，但是未達到顯差 (Ⅰ-圖三)。. Ⅰ-3-3 繼代培養的細胞株，其 SCNN1B 基因 mRNA 之差異為了確認我們所培養的類癌幹細胞具有自我繁衍的特性 (Selfrenewal)，確認隨著代數的增加類癌幹細胞的幹細胞特性能夠維持，我們將培養的貼盤細胞以及類癌幹細胞進行繼代培養，萃取其 RNA 做表現量的比較 (Ⅰ-圖四 A)，同樣可以觀察到 SCNN1B 基因在類癌幹細胞中有高於貼盤細胞的表現量，並在第三代達到了具有統計意義的顯差 (Ⅰ-圖四 B)。. Ⅰ-3-4 SCNN1B 基因在 p53 突變之細胞株 DLD-1 的表現量由於 HCT116 以及 HT-29 這兩株大腸癌細胞株最主要的差異在於 HCT116 是 p53 wild type 的大腸癌細胞株，而 HT-29 則是 p53 突變的大腸癌細胞株，從上面的結果我們懷疑 p53 的突變是否跟 SCNN1B 在大腸癌幹細胞中的表現有關係，因此我們進一步檢測另一株 p53 突變的大腸癌細胞株，DLD-1，來驗證我們的觀察。. 17.

(23) 從實驗結果中我們觀察到 DLD-1 細胞株與 HCT116 細胞株有相同的趨勢，SCNN1B 基因的 mRNA 在類癌幹細胞中都有相較於貼盤細胞高的表現量 (Ⅰ-圖五)。. Ⅰ-3-5 SCNN1B 基因表現量多寡對於大腸癌病患存活率的影響美國國家癌症研究所 National Cancer Institute (NCI) 與國家人類基因體研究所 National Human Genome Research Institute (NHGRI) 在 2005 年開始合作美國癌症基因體圖譜計畫 The Cancer Genome Atlas (TCGA) [32]，蒐集許多癌症病患的臨床治療紀錄、腫瘤組織及其對應正常組織，進行定序以及生物資訊的分析，將這些定序結果以及分析結果整合後於網站提供查詢及下載服務[31]。本研究利用 OncoLcn[29]以及 UALCAN[30]進行 TCGA 數據庫的搜索，分析 SCNN1B 基因對於大腸癌患者的影響，從結果顯示在癌症檢體當中 SCNN1B 的表現量低於正常的組織 (Ⅰ-圖六 A)。隨著大腸癌階段的推進，SCNN1B 的表現量有上升的趨勢 (Ⅰ-圖六 B)。我們進一步做表現量與病患的存活率分析，發現 SCNN1B 基因表現量較高的組別其存活率相較於表現量較低的組別有降低的趨勢，但尚未達到統計上的顯著意義 (Ⅰ-圖六 C)。 18.

(24) Ⅰ-4 討論因為檢體的樣本數不足，能夠提供我們實驗的次數太少，導致統計出來的標準差太大，故無法達到顯著差異，但在檢體都有觀察到相同的趨勢，在懸浮培養的類癌幹細胞中 SCNN1B 基因 mRNA 的表現量較貼盤細胞高。所以希望日後可以取得更多的檢體來進行實驗，期望能夠讓我們所發現的結果更具有信服力。從 TCGA 的資料中可以發現，雖然 SCNN1B 基因的表現量在腫瘤組織中的表現並未高於正常組織 (Ⅰ-圖六 A)，但隨著大腸癌病程的推進，表現量有逐漸增加的趨勢 (Ⅰ-圖六 B)。統計資料中所顯示的 SCNN1B 基因表現量是以整個腫瘤的細胞所分析的，並未區分一般癌細胞或是癌幹細胞，而癌幹細胞在腫瘤細胞當中只占少數，所以才看到 SCNN1B 基因的表現量在腫瘤組織中的表現量較正常組織低。前人研究表示，癌幹細胞跟腫瘤的引發有密切的關係，隨著癌症的進程，不僅大腸癌的治癒率越來越低，復發以及轉移的機率也會越來越高，這或許是因為腫瘤當中癌幹細胞的數量越來越多的關係，所以也可以觀察到隨著大腸癌的階段推進，SCNN1B 基因的表現量有逐漸上升的趨勢。從存活率分析中發現，SCNN1B 基因表現量較高的大腸癌患者其存活率有低於表現量較低的患者的趨勢，不過沒有達到統計意 19.

(25) 義上的顯差[33] (Ⅰ-圖六 C)。然而大腸癌越到晚期的患者，其治療不僅效果不甚理想，更易復發甚至轉移。目前所知 SCNN1B 是組合型鈉離子通道的成員之一，鈉離子通道在腫瘤的進程當中扮演著重要角色，能夠透過改變細胞內離子濃度、細胞質 pH 值、改變細胞膜電位，甚至參與細胞週期等方法來調控腫瘤細胞的生長週期，與腫瘤的侵襲、轉移等現象有密切的關係[33-36]，有的鈉離子通道可能與腫瘤細胞的生長速度有關聯[37]，而前人研究發現在腫瘤中的離子通道蛋白相較於一般細胞會有較高的表現量[38]，這當中是否有甚麼機制在影響 SCNN11B 基因表現量的增加，這些問題都還要在之後的研究中進一步的去探討。目前所得的結果顯示 SCNN1B 在檢體及大腸癌細胞株 HCT116 所培養出的類癌幹細胞中都有較高的表現量 (Ⅰ-圖一、圖二)，但 SCNN1B 基因 mRNA 的表現量在 HT-29 衍生出來的類癌幹細胞球中有下降的趨勢，但並未達到顯著差異(Ⅰ-圖三)。HCT116 以及 HT-29 都是大腸癌的細胞株，不一樣的地方在於 HCT116 是 p53 wild type，而 HT-29 則是 p53 突變型的大腸癌細胞株，因推測是由於 p53 突變的關係導致 SCNN1B 基因的 mRNA 表現量有如此趨勢，所以本研究以另一 p53 突變的大腸癌細胞株 (DLD-1)進行相同的實驗，發現 SCNN1B 在 DLD-1 中 mRNA 的表現量與 HCT116 有相同的趨勢 (Ⅰ20.

(26) 圖五)。因 DLD-1 與 HT-29 皆為 p53 突變的大腸癌細胞株，只是突變的位置不同，DLD-1 為 S241F 的突變[39])，但兩者都是在 p53 與 DNA 交互作用的部分(DNA binding domain, DBD)突變而失去 p53 蛋白質的功能。除 p53 的突變外，此二細胞的染色體套數也不相同，DLD-1 大多維持雙套染色體，但 HT-29 為多套，因此其不具功能的 p53 蛋白質是過度表現的，另外其不受調控的基因比之 DLD-1 也更多。前人研究表示 p53 蛋白的半衰期約只有 20 分鐘，但當 p53 基因出現點突變的時候，會使 p53 蛋白的半衰期延長至數個小時，較慢的降解速度導致 p53 在細胞中大量累積，並且這些點突變的 p53 蛋白會與正常的 p53 蛋白結合，使正常的 p53 蛋白失去功能[40]。因此是否大量不具功能的 p53 存在於 HT-29 細胞中導致 SCNN1B 的表現調控與其他細胞不同，或者在大腸癌細胞中調控 SCNN1B 的表現不是單純 p53 的調控而是另也其他蛋白質參與則需要更進一步的實驗探討。目前 SCNN1B 這個蛋白質的功能還沒有很深入的探討過，尚有許多機制值得探討，根據上述實驗結果，若有更多的實驗以及檢體來進一步實驗，SCNN1B 蛋白仍具有潛力繼續研究開發作為人類大腸癌幹細胞的生物標記。. 21.

(27) Ⅱ、建立藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統. 摘要一直以來，在臨床上給予藥物最常用的方式是口服給藥，因為口服給藥是最為經濟且安全的，並被認為是病患對於藥物吸收最理想的方式，口服給藥的方式藥物會通過腸道吸收以及血管運送進入人體循環，上皮細胞對於藥物的吸收程度以及藥物對於內皮細胞的穿透能力，被認為是對於藥效影響的指標。目前在臨床研究上有許多方法可以用來偵測藥物在體內以及體外的吸收程度，但這些方法大部分是建立在間接的化學分析或者物理波長的吸光度測定上，因此本研究透過建立一個活細胞即時影像系統，觀察藥物吸收以及藥物進入細胞的過程。利用計算藥物螢光的強度，我們可以偵測藥物或生物活性配方的吸收效率，而我們也成功的在加藥半小時內觀察到薑黃素在 Caco-2 細胞的吸收情形。此外，我們也觀察到經過高速均質後的薑黃素乳化劑吸收的效率比單純脂質包裹的薑黃素來得高。關鍵字：口服給藥、藥物吸收、Caco-2、薑黃素. 22.

(28) Abstract Oral administration is the most common method in taking clinical medicine. It is also the safest, most convenient, and economical way. By oral administration, drug is absorbed by digestive system and enter circulatory system. In the study of drug absorption, it is important to evaluate the relationship of these oral drug formulations and the efficiency of absorption. The level of drug absorption in the epithelial cells and the ability of penetration through the endothelial cell are two important factors that determine the final effects of a drug. Until now, there are many methods to evaluate the drug absorption levels in vitro and in vivo. However, majority of these assays were established on indirect chemical analysis assays or physical wavelength absorbance assay. Therefore, we established a cellular live-imaging model to observe the process of drug absorption and penetration in live cells using real-time microscopy. By measuring the intensity of bio-fluorescence of the drug or a labeled micelle, we can determine the efficiency of the cellular absorption of a specific drug or a formula. Here we successfully observed the curcumin absorption by colon cancer cells Caco-2 in half hour after treatment.. Furthermore,. the. curcumin. with. high-speed. homogenized-emulsion showed the better cellular absorption compared to the lipid-wrapped one. Key words: Oral administration, Drug absorption, Caco-2, Curcumin. 23.

(29) Ⅱ-1 緒論藥物吸收指的是藥物自體外或是給藥的部位，通過細胞的屏障進入體內代謝循環後到達目標部位的過程，而藥物的分子大小、極性、解離度、給予藥的方式、藥物劑型以及患者當下身體狀況等因素，都有可能導致藥物的吸收或藥效發揮所持續的時間有所變化。. Ⅱ-1-1 口服藥物在體內的吸收當藥物進入體內之後，基本的過程有四個階段，分別為吸收 (Absorption) 、分布 (Distribution) 、代謝 (Metabolism) 以及消除 (Excretion)。當口服藥物進入消化道經過小腸的吸收並進入肝臟，在許多種酵素反應中完成代謝的過程，分佈則是代謝後隨著血液進入體內循環將藥物送達目標器官，最後再排出體外。藥物在人體內的這四個動向簡稱為 ADME，在藥物動力學當中就是用量化的數據來表示藥物在體內的這四個過程，進而成為探討藥物開發的基礎[41]。小腸是人體吸收外來事物的一個屏障，也是體內主要的吸收器官，在人體內的長度大約是 2 到 6 公尺，絕大部分的吸收都在這裡進行[42, 43]，其吸收的能力主要依賴小腸細胞特殊分化的形狀及構造，表面有許多的皺褶，而其上皮細胞又分化出微絨毛，增加了食物或藥 24.

(30) 物與腸道接觸的面積[44]。小腸上皮由上皮細胞、杯狀細胞等多種細胞所構成，小腸的上皮細胞具有極性，分為 Apical side 以及 Basal side，利用 Tight junction 將腸道與體內分隔成兩邊，藥物或養分等只有通過小腸細胞或者穿過 Tight junction 才能進入體內[45]。當食物或藥物進入人體後，首先要通過小腸的細胞屏障才能進入體內的循環當中，而小腸對於藥物的吸收能力決定了藥物進到人體內的能力。藥物通過小腸進入人體的途徑主要有擴散、主動運輸、經由蛋白質運送等，而藥物進入人體之後還要克服酸鹼值變化、首關效應等影響，才能充分的發揮作用[46]。所以吸收不僅僅是藥物進入身體的第一個關卡，也是藥效發揮的一個重要的因素。故對於口服藥物吸收的研究在藥物開發上就顯得格外的重要。. Ⅱ-1-2 研究藥物吸收常用之模型以口服的方式給藥，藥物會通過腸道吸收再通過血管運送進入人體循環，最理想的情況是在藥物進入人體之後，既可以使藥物效果維持，又可以保護人體不受到藥物毒性的傷害。在人體對於藥物吸收的研究當中，藥物的口服方式是否有效、對於人體是否安全是很重要的，但是在人體的吸收代謝中藥效的持續性以及效果卻是不那麼容易被評估。 25.

(31) 在藥物吸收相關的研究當中，上皮細胞對於藥物的吸收程度以及藥物對於內皮細胞的穿透能力，這兩點目前被認為是對於藥物效果影響的指標[47]，並決定了口服藥物的生物利用度。因此在藥物的臨床測試上，藥物穿過小腸上皮的能力成為了藥物開發的重點[48, 49]。目前在藥物吸收研究上，已經有一套較為完整的研究模型，基本依照實驗模型的對象不同可分為非生物模型、體外模型以及體內模型[50]。. Ⅱ-1-2.1 非生物藥物吸收模型非生物模型主要是利用人工的方法來模擬人體的細胞膜，觀察藥物在此人工膜的通透性，來預測藥物在人體內的通透情況，利用藥物的物理性質，去評估藥物的吸收狀況[51]。但這種方法存在著不小的缺陷，由於人的細胞膜構造複雜，這種人工膜的模型只能模擬藥物直接穿透細胞膜的情況，並無法模擬主動運輸或者蛋白質運輸的情況[52]。. Ⅱ-1-2.2 體內藥物吸收模型由於藥物吸收的途徑多樣人工膜無法完全模擬，所以相對複雜的生物模型會以比較能夠完整的詮釋藥物在人體內的吸收情形[53]。體內的藥物吸收模型是利用活體動物或者動物的小腸組織來進行實 26.

(32) 驗，主要有原位腸段 (in situ gut segment) [54]、外翻腸段 (everted gut sacs) [55, 56]以及尤斯灌流 (ussing chamber) [57]等方法。. Ⅱ-1-2.3 體外藥物吸收模型由於動物模型受到多種因素侷限，且要花費許多的人力、財力以及時間，為了更加簡便的取得藥物吸收的實驗數據，細胞的模型在藥物吸收的研究上使用的比例越來越多，通常是讓細胞分化成具有極性以及小腸上皮部分功能的細胞單層膜，來模擬腸道的上皮結構，測定藥物在培養液中的濃度變化來做藥物吸收的評估。常用的細胞株包括 MDCK、HT-29、LLC-PK1、2/4/A1、IEC-18 以及 Caco-2 等[58]。上述細胞模型是將細胞放在 Transwell 中，待細胞分化成具有極性的細胞單層膜方可加藥進行實驗，相較於動物模型，這是一種相對簡單方便且最為通用的方法[59-61]。由於 Caco-2 這株細胞的特性是能夠在分化之後具有小腸上皮細胞所擁有的 Tight junction、微絨毛以及一些小腸上皮細胞可以分泌的酵素等特性，故最常被使用作為小腸吸收的細胞模型[62, 63]。因此在本研究當中，將會使用 Caco-2 作為本研究傳統藥物吸收的細胞模型所使用的細胞株。. 27.

(33) Ⅱ-1-3 藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統雖然在臨床研究上有上述許多方法來偵測藥物的吸收程度，但這些方法大部分是建立在間接的化學分析或者物理波長的吸光度測定上，例如：將藥物加入細胞的培養液當中，經過一定時間之後將細胞培養液分離出來進行成分分析，像是 high performance liquid chromatography (HPLC) 或是 liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) [64]，但這些方式都是較為抽象並且間接的測量方式。本研究利用雷射共軛焦顯微鏡作為工具，拍攝活細胞在吸收藥物的即時影像，藉此來觀察藥物進入細胞的情況以及效率。此模型所使用的細胞株為 Caco-2，由於 Caco-2 是藥物吸收研究中最常使用的細胞株；此次所測試之生物活性化合物為國立台灣大學食品科學系丁俞文教授所提供之薑黃素乳化液。薑黃素為薑黃萃取之色素，其臨床研究發現其具有抗發炎、抗腫瘤、抗真菌、抗細菌、保護神經細胞等生物活性，採用薑黃素的原因是由於其具有綠色自體螢光的特性，在雷射共軛焦顯微鏡的拍攝下可以清晰地看到螢光的分布以及移動狀況。. 28.

(34) Ⅱ-2 研究材料與研究方法. Ⅱ-2-1 細胞培養 U373-MG 細胞作為本次實驗的前測細胞株。將細胞培養在含有 10%胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS, 10437-028, Gibco)、1% P/S 抗生素 (Penicillin- Streptomycin, Pen-Strep, 15140-122, Gibco) 的 RPMI1640 (23400-021, Gibco) 培養液，置於 10 公分細胞培養皿 (FALCON) 中，以 5% CO2、37℃的條件在培養箱中培養。 Caco-2 細胞株(感謝台灣大學食品科學研究丁俞文教授提供)培養在含有 10%胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS, 10437-028, Gibco)、1% P/S 抗生素 (Penicillin- Streptomycin, Pen-Strep, 15140-122, Gibco) 以及 1% MEM NEAA (MEM non- Essential amino acids, Gibco) 的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 12800-017, Gibco) 培養液，置於 10 公分細胞培養皿 (FALCON, 353003) 中，以 5% CO2、 37℃的條件在培養箱中培養。. 29.

(35) Ⅱ-2-2 活細胞即時影像觀測系統模型建立 Ⅱ-2-2.1 細胞製備將培養於 10 公分細胞培養皿的 Caco-2 細胞，用 PBS (Phosphate buffered saline, 00-300, Invitrogen) 潤洗一到兩次，加入 1 mL 胰蛋白酶 (0.25% Trypsin- EDTA, 25200-056, Gibco)，充分潤洗細胞後在室溫下反應 1 分鐘，去除多餘的胰蛋白酶，並在 37℃培養箱中反應 5 分鐘後加入 2 mL 培養液中和反應並將細胞打下來，計數細胞以 1×105 cell/mL 的濃度放入 35 mm 的 glass bottom culture dishes (MatTek, P35GC-0-14-C)，再加入 1.5 mL 含有 10% FBS、1% P/S 以及 1% MEM NEAA 的 DMEM 培養液，以 5% CO2、37℃的條件在培養箱中培養。. Ⅱ-2-2.2 薑黃素乳化液由台灣大學食品科學系丁俞文教授實驗室提供之薑黃素配方乳液，使用中鏈三酸甘油脂 (Medium-Chain Triglyceride, MCT) 為油相包裹薑黃素粉末，再以二次水 (d. d. water) 及 Tween 20-E 為水相融合，依照高速均質以及高速均質後再進行不同次數的高壓均質分成三種不同粒徑大小的組別，本研究選用薑黃素濃度 0.75%之 HS (只經過高速均質)、HP1 (高速均質後經過 1 次高壓均質)以及 HP4 (高速均質 30.

(36) 後經過 4 次高壓均質)之組別 (Ⅱ-表一)，將單純溶於中鏈三酸甘油脂之薑黃素、無薑黃素之 HP4 乳液、無薑黃素之中鏈三酸甘油脂作為對照組。. Ⅱ-2-2-3 共軛焦顯微鏡拍攝將 Caco-2 細胞放入 35 mm 的 glass bottom culture dishes 中培養兩天後，移除培養液並以 PBS 潤洗兩次，加入 1 mL 含 1% 1M HEPES 無酚紅培養液 (Phenol red free, DMEM/F12)，並利用共軛焦顯微鏡拍攝系統 (LSM-880, Zeiss) 在 37℃的環境中拍攝活細胞影像，並在開始拍攝後的第 20 秒加入 1 μL 薑黃素配方乳液，設定每 10 秒拍攝一次，共計 30 分鐘。. Ⅱ-2-3 傳統藥物吸收體外模型 Ⅱ-2-3.1 以 Transwell 培養細胞將孔徑大小 0.4 µm 的 Transwell (BD Falcon, 353180) 放入 12 孔盤當中，在 well 中加入 1 mL、 Transwell insert 中加入 200 µL 含有 10% FBS 以及 1% MEM NEAA 的 DMEM 培養液，充分潤洗 Transwell 的 PET Membrane，去除 insert 當中的培養液，將計數完成的細胞以. 31.

(37) 1×105 顆/0.5 mL/well 的量種入，搖勻之後放入 37℃培養箱中培養，每隔兩天更換一次培養液。. Ⅱ-2-3.2 跨膜電阻的測量及計算當細胞在 Transwell 培養後的第三天開始用跨膜電阻儀 (EVOM2, Epithelial. Volt/Ohm. Meter. for. TEER). 測量其. TEER. 值. (Transepithelial/transendothelial electrical resistance)，第一周每兩天測一次，第二周開始每天測一次，測量之前需先更換新的培養液，避免舊培養液中細胞的代謝物以及殘渣的影響，測量前先將電極浸泡在培養液中，使背景值相同縮小測量的誤差。將電極短的一端浸泡在 insert 中，長的一端則浸泡在 well 中，長短兩電極需要完全浸跑在培養液裡面。重複測量三次並記錄穩定數值，由於培養基本身也具有一定電阻值，且電阻值與面積成反比，故計算實際 TEER 值時，需要將測得的值先扣掉空白組 (只有 PET membrane，並沒有細胞) 之電阻值 (式一)，再將值乘以 Transwell insert 的有效面積 (細胞生長之面積，0.9 cm2, 12 well) (式二)，即可得到實際電阻值 (Ω．cm2)。 RTISSUE(Ω)= RTOTAL – RBLANK. (式一). TEERREPORTED= RTISSUE(Ω)× MAREA(cm2). (式二). 32.

(38) Ⅱ-2-3.3 HPLC 樣品的製備經過計算的實際電阻值大於等於 300 (Ω．cm2) 時，即可開始進行實驗，本次實驗總共有六組，分別是三個不同粒徑大小之薑黃素乳液 (表一)、空白組乳液 (不含薑黃素)、含有薑黃素之中鏈三酸甘油脂以及純中鏈三酸甘油脂，每組皆以 1：1000 之濃度加入細胞液當中，加入乳液的第 0 分鐘、10 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時以及 24 小時，分別取 150 µL 放入 1.5 mL 離心管中，如未馬上處理則冰入 -80℃冰箱保存。將乙酸乙酯 (ethyl acetate, EA) 以 2：1 的比例 (EA：2，培養基： 1) 加入收集好的培養液當中，Vortex 5 秒混勻，以 15,000 g 離心 10 分鐘，取出上層清液移入新的 1.5 mL 離心管當中，將蓋子打開置於抽風櫃中使 EA 完全揮發，冰入-80℃冰箱保存。. Ⅱ-2-4 HPLC 將 EA 完全揮發的樣品用 DMSO 回溶過濾置入樣品瓶中，本研究使用之 HPLC 系統之偵測器為 Shimadzu SPD-M20A，自動取樣器 Shimadzu SIL-20A、高壓幫浦 Shimadzu LC-20AT 以及除氣裝置 Biotech Model 2003 Degasser，管柱則使用 C18 管柱 (Luna 5 µm C18(2) 33.

(39) HPLC Column) ( 250 x 4.6 mm)。以 0.1% H3PO4 水溶液以及乙腈 (Acetonitrile, ACN) 作為移動向，將體積比 A:B (v/v) 設定為：65：35 (0-20 min) , 50：50 (20-30 min)，流速為 1.5 mL/min，管柱溫度設定在 25℃，氘燈 (D2) 測量範圍設定在 190-800 nm，計算在 425 nm 的吸光度。. Ⅱ-2-4 統計分析活細胞影像之螢光定量感謝台灣科技大學機械工程系林柏廷教授實驗室提供 OpenCV 以及 C++撰寫之程式用以計算並定量。統計分析方法使用 Student’s T- test 分析比較兩組間的顯著差異。. 34.

(40) Ⅱ-3. 結果. Ⅱ-3-1 U373-MG 細胞株之前測試驗我們先使用 U373-MG 細胞株，作為本次實驗的前測細胞。將 U373-MG 細胞種入 35 mm 的 glass- bottom culture dish 中兩天後，以雷射共軛焦顯微鏡進行即時影像拍攝。拍攝總時長為 30 分鐘，在約第 80 秒的時候加入溶於 DMSO 的 100 µM 薑黃素溶液，觀察細胞吸收螢光的變化。薑黃素具有自體螢光(入射光波長：432 nm，激發光波長：543 nm)，如預期未加薑黃素前細胞及背景皆未有綠螢光訊號，我們觀測到在第 80 秒加了薑黃素之後，螢光訊號在第 100 秒出現，並且一直維持到 30 分鐘皆有螢光的訊號 (Ⅱ-圖一 A)。. Ⅱ-3-2 Caco-2 細胞株之前測試驗將 Caco-2 細胞種入 35 mm 的 glass- bottom culture dish 中兩天後，進行共軛焦顯微鏡的拍攝。拍攝總時長為 30 分鐘，在約第 20 秒的時候加入溶於 DMSO 的 100 µM 薑黃素溶液，觀察細胞吸收螢光的變化。與 U373-MG 細胞有相同的趨勢，在第 20 秒加了薑黃素之後，螢光訊號在第 40 秒出現，並且一直維持到第 30 分鐘皆能觀察到螢光訊號 (Ⅱ-圖一 B)。 35.

(41) Ⅱ-3-3 Caco-2 對於薑黃乳化液之吸收因為 DMSO 無法直接作為口服藥物溶劑，因此需要尋找適合作為口服藥物之溶劑。我們與國立台灣大學食品科學研究所丁俞文老師合作，測試其製作之薑黃素乳液的吸收。將 Caco-2 細胞培養並種入 35 mm 的 glass- bottom culture dish 中培養兩天後，進行活細胞影像的拍攝。每次每組拍攝總時長為 30 分鐘，在第 20 秒的時候加入薑黃素的配方乳液。此實驗分成五組進行，組別分別為：HS-Curcumin (只經過高速均質的薑黃素配方乳液)、 HP1-Curcumin (高速均質後經過 1 次高壓均質的薑黃素配方乳液)、 HP4-Curcumin (高速均質後經過 4 次高壓均質的薑黃素配方乳液)、Curcumin (薑黃素粉末溶入中鍊三酸甘油脂) 以及 HP4 (經過 4 次高壓均質，但不含薑黃素)，除了 HP4 為沒有薑黃素的控制組之外，其他組別薑黃素的濃度皆為 20 µM (0.75%)。使用之乳液粒徑大小，由大至小分別為 HS-Curcumin＞ HP1-Curcumin＞HP4-Curcumin。途中白線框出的範圍即為細胞，白色箭號所指處為細胞內螢光出現的地方，橘黃色箭頭所指之處為螢光滯留在細胞膜出現的地方。可以從結果觀察到第 0 分鐘全部組別皆沒有綠螢光訊號的產生，在第 20 秒加入薑黃素配方乳液之後，HP4-Curcumin 的組別在第 40 秒出現 36.

(42) 綠螢光在細胞的邊緣，到 15 分鐘有進入細胞的情況，但螢光亮度卻不強，HP1-Curcumin 的組別在第 5 分鐘出現綠螢光在細胞的邊緣，但在快 20 分鐘的時候才有微弱的信號出現在細胞內部，而 HSCurcumin 的組別在第 10 分鐘左右出現綠螢光在細胞的邊緣，在 14 分鐘時進入細胞，Curcumin 的組別在第 5 分鐘就出現了綠螢光在細胞的邊緣，但是訊號滯留在細胞膜上並未進入細胞，吸收的效果並不理想。雖然 HP4-Curcumin 的組別是在第 40 秒就在邊緣出現了綠螢光，但卻並未進入到細胞中，反而是較慢出現螢光信號的 HSCurcumin 組別，目測進入到細胞中的速度相較於 HP1-Curcumin 以及 HP4-Curcumin 都來的快些，亮度也較亮，針對 HP 的組別，觀察到 HP4-Curcumin 進入細胞內的螢光出現的速度較 HP1-Curcumin 來的快。螢光持續到了第 30 分鐘皆可觀察到訊號，HP4 作為沒有加入薑黃素的組別，並未觀察到螢光背景訊號產生 (Ⅱ-圖二)。重複三次相同實驗後，將影像利用程式進行螢光定量，並將螢光訊號最早出現在細胞內的時間記錄下來進行統計 (Ⅱ-圖三 A)，可以觀察到未經過均質化的組別 (Curcumin) 到了第 30 分鐘仍然沒有螢光信號出現在細胞內部，HP4-Curcumin 的組別儘管出現螢光的時間最早，但螢光進入細胞的時間卻晚於 HS-Curcumin，HP1-Curcumin 螢光訊號則是三組配方乳液中最晚出現在細胞內部的，這與上述影片 37.

(43) 觀察的結果符合 (Ⅱ-圖三 A)。然後將各組之螢光最大值以及其出現時間點進行統計，可以觀察到相較於 HS-Curcumin 以及 HP4-Curcumin 的組別 HP1-Curcumin 的螢光亮度相對較低 (Ⅱ-圖三 B)，雖然螢光量有差別，但是最大值出現的時間並沒有明顯的差異 (Ⅱ-圖三 C)。. Ⅱ-3-4 傳統 Transwell 方法實測細胞吸收 Ⅱ-3-4.1 傳統藥物研究模型將細胞以 1×105 顆/well、0.5mL 置入已經潤洗過的 Transwell insert 在 37℃培養箱中培養，第一周每隔兩天更換一次培養液，第二周開始每天更換培養液，並在培養的第三天開始進行 TRRE 值的測量，第一周每兩天測一次，第二周開始每天測一次，並計算得出電阻值。從統計表可以觀察到在第三天電阻值就達到了 560 左右，但在第二周電阻值就有下降的趨勢，一直到第 19 天才慢慢回升，上升到 700，達到了實驗電阻值，故在第 25 天進行加藥，將統計圖以每五天一個點繪製 (簡略數值)，可以看到下降後上升的趨勢更加明顯 (Ⅱ圖四 A)。與先前實驗一樣使用薑黃素乳液作為測試藥物，並在加入的第 0 分鐘、10 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時、24 小時分別抽取 150 µL 的培養液，萃取後進行 HPLC 分析。 38.

(44) Ⅱ-3-4.2 HPLC 之檢測結果管柱使用 C18 管柱，以 0.1% H3PO4 水溶液以及乙腈作為移動向，流速設定為 1.5 mL/min，以 DMSO 作為溶劑將薑黃素分別配置成 0.3125、0.625、1、1.25、2.5 以及 5 ppm 的濃度，將 HPLC 的結果進行分析並畫出標準曲線 (Ⅱ-圖四 B)。經過 EA 萃取並風乾的樣品用 DMSO 回溶後進行 HPLC 分析，可以觀察到在加入乳液後的第 24 小時，transwell 內薑黃素的濃度已有下降(推測應該是已被吸收)，但 transwell 外的培養液中仍然還偵測不到薑黃素的含量。可能是其含量低於 HPLC 的偵測範圍 (0.15 ppm)，或者吸收後尚未由細胞層上方 (apical) 轉移到下側方 (basal- lateral)。以 transwell 內薑黃素濃度的消耗量來計算各組的吸收率並繪製圖表 (Ⅱ-圖四 C)，從圖中可以觀察到，HS-Curcumin、HP4-Curcumin 以及 HP1-Curcumin 三組皆有被細胞吸收，其中 HS-Curcumin 與 HP4-Curcumin 在加藥後第 24 小時的吸收率沒有明顯的差別，HP1-Curcumin 則是三組乳液當中吸收率較差的，作為無均質化對照組的 Curcumin 則完全沒有看到吸收的情況 (Ⅱ-圖四 C)。. 39.

(45) Ⅱ-4. 討論我們預期應觀察到隨著粒徑越小，細胞吸收的效率會增加，但從影片中我們卻意外地發現，雖然螢光出現速度最快的組別是 HP4-Curcumin (粒徑最小)，但卻會滯留在細胞膜，並未很快的進入細胞的中間，而反觀 HS-Curcumin 的組別，雖然出現螢光訊號的時間較晚，但螢光信號進入細胞內部的速度卻是比 HP4-Curcumin 組別來的快的，而 HP1-Curcumin 出現螢光的時間雖然比 HP4-Curcumin 的組別晚，也較 HS-Curcumin 的組別早，但螢光進入細胞中的組別卻是三組當中最差的。有這個情況的原因目前推測是由於 HP4-Curcumin 組別的粒徑最小，在培養液中移動的速度較快，所以螢光訊號出現的時間最早，但因為同時間太多的顆粒要進入細胞，導致在最開始發現的螢光訊號都滯留於細胞的邊緣，進入的效果並不好，直到細胞膜慢慢的能夠消化顆粒的流量，讓乳液可以進入細胞當中才看到螢光進入到細胞的內部。HP1-Curcumin 的組別粒徑相較於 HP4-Curcumin 組別來的大，卻比 HS-Curcumin 來的小，所以在培養液當中移動的速度中等，螢光出現的時間也在 HS-Curcumin 與 HP4-Curcumin 中間，但跟 HP4-Curcumin 的組別一樣，出現了細胞膜來不及消化乳液顆粒流量導致滯留膜上的情況，且由於顆粒較大細胞膜並沒有辦法像消化 40.

(46) HP4-Curcumin 組別流量的時候來得快速，所以吸收的效果是三組裡面最差的。HS-Curcumin 的粒徑最大移動速度最慢，螢光訊號也最後出現，由於能夠讓細胞膜有時間消化顆粒的流量，所以藥物不會出現停滯在細胞膜上卻進不了細胞的狀況，就出現了螢光訊號出現的速度最慢但螢光訊號進入細胞的速度卻不是最慢的結果。利用程式將細胞內螢光進行定量後，將螢光最大值以及螢光最大值出現的時間進行統計分析，發現三組薑黃素乳液 (HS-Curcumin 、 HP1-Curcumin 、 HP4-Curcumin) 螢光最大值出現的時間並無明顯差異，螢光的亮度卻是 HP1-Curcumin 最低，而 HS-Curcumin 及 HP4-Curcumin 兩組亮度則無明顯差異。目前推測可能是如上述說的 HS-Curcumin 移動較慢讓細胞膜能夠完全消化乳液顆粒的流量順利進入細胞，而 HP4-Curcumin 的組別由於粒子移動速度快，導致在最開始會滯留在細胞膜上，但是當細胞膜消化這些顆粒的流量後，乳液顆粒依然可以順利的進入細胞當中，而 HP1-Curcumin 的組別則是因為移動速度稍快使乳液顆粒滯留在細胞膜中，卻又無法像粒徑最小的 HP4-Curcumin 讓細胞膜可以順利消化流量使乳液進入細胞，所以進入細胞的狀況相較於 HS-Curcumin 與 P4-Curcumin 較差，故可以觀察到雖然 HS-Curcumin、HP1-Curcumin、HP4-Curcumin 三組螢光最大值出現的時間無明顯差異，而亮度卻有差異的結果。 41.

(47) 在傳統藥物吸收的系統當中，測量 TEER 值的時候，發現電阻值有下降後回升的情況，目前推測可能細胞需要時間進行分化作業所導致，但也不排除可能是部分細胞死亡後導致的下降，之後細胞慢慢又長回來使電阻值又再度回升的情況。在 HPLC 的結果當中，我們觀察到了 HS-Curcumin、HP1-Curcumin、HP4-Curcumin 三組是有被細胞吸收的，而 HS-Curcumin 跟 HP4-Curcumin 在第 24 小時的吸收率差異並不大，可能還需要更多的時間才會出現較明顯的差異， HP1-Curcumin 的吸收率則是三組薑黃素乳液中最差的，此結果與先前拍攝影片的結果相同。本研究所建立的藥物吸收活細胞即時影像觀測系統相較於傳統的吸收模型更加的快速以及便利，活細胞即時影像觀測系統從將細胞培養在 35 mm 的 glass bottom culture dishes 中培養到實驗結束，所花費的時間在三天以內，而傳統的細胞模型在等待細胞分化的過程就耗費了將近一個月的時間，後續 HPLC 的實驗以及數據的分析也需要時間，而且 HPLC 的數據並沒有利用電腦程式直接分析影像螢光量來的直觀，由於 HPLC 還有濃度太低偵測不到的狀況，對於藥物濃度的敏感度並沒有本研究所建立的觀測系統來的高。藥物吸收之活細胞即時影像系統雖然仍有一些技術上的問題要進一步的討論，像是：拍攝時對焦平面的設定以及偵測之藥物必須要 42.

(48) 有螢光訊號等，但相較於曠日廢時且不直觀的傳統觀測方式，本研究所建立的觀測系統更加的省時、方便，是個有潛力值得繼續完善的藥物吸收觀測平台。. 43.

(49) Ⅲ、圖表 Ⅰ、大腸直腸癌類癌幹細胞之因子探討. (Ⅰ-圖一) SCNN1B 基因的 mRNA 在臨床檢體類癌幹細胞中的表現量比在貼盤培養的細胞高。圖中為 SCNN1B 基因在編號 2796、3029 兩位不同病患檢體之貼盤培養細胞 (Adherent, AD) 以及懸浮培養的類癌幹細胞 (Sphere, SP) 中，利用 RT-PCR 進行 mRNA 之表現量分析 (2796T, n=1；3029T, n=1)。可以觀察到 SCNN1B 基因的 mRNA 在類癌幹細胞 (SP) 的組别中有較高的表現量。定量則使用 Image J 軟體進行量化分析，以 GAPDH 作為 loading control，將貼盤細胞的結果作為標準值，比較同組之中類癌幹細胞的量化數值，結果即為 SCNN1B 基因之 mRNA 在類癌幹細胞中的相對表現量。一般檢體培養之細胞並不足以做到三重 44.

(50) 複的結果，但此處培養的編號 2796T 之細胞已有較穩定的生長狀況，故能進行較多次的實驗。(GAPDH 以及 SCNN1B 的 cDNA 長度皆約為 300 bp). 45.

(51) A. B. (Ⅰ-圖二) HCT116 細胞株中，SCNN1B 的表現量在類癌幹細胞中高於貼盤細胞。 A.為 SCNN1B 基因的 mRNA 在 HCT116 細胞株表現的情況，我們選擇抽取同一代數培養相同天數的貼盤以及懸浮細胞之 RNA 來做 RT-PCR 分析，可以觀察到在懸浮培養的類癌幹細胞 (SP) 中， SCNN1B 的表現量高於貼盤細胞 (AD)。B.為 HCT116 細胞株在經過 46.

(52) 重複三次以上之獨立實驗後之定量結果統計分析，結果顯示 SCNN1B 基因的 mRNA 在懸浮培養的類癌幹細胞中表現量高於貼盤細胞並達到了具有統計意義的顯著差異。 (以 Image J 軟體進行量化分析， GAPDH 作為 loading control，將貼盤細胞的結果作為標準值，比較同組之中類癌幹細胞的量化數值)。重複至少三次獨立實驗之後，將其量化數據做統計分析並繪出圖表，使用之統計方式為 Student’s T- test (***：p<0.005)。. 47.

(53) A. B. (Ⅰ-圖三) HT-29 細胞株中，SCNN1B 的表現量在貼盤細胞微中高於類癌幹細胞細胞但並未達到顯差。 A.為 SCNN1B 基因的 mRNA 在 HT-29 細胞株表現的情況，我們選擇抽取同一代數培養相同天數的貼盤以及懸浮細胞之 RNA 來做 TR-PCR 分析，可以看到在貼盤細胞 (AD) 中，SCNN1B 的表現量高於懸浮培養的類癌幹細胞 (SP)。B.為 HT-29 細胞株在經過重複三次以上獨立實驗後的定量結果統計分析，可以看到 SCNN1B 基因的 48.

(54) mRNA 在貼盤細胞 (AD) 中表現量高於懸浮培養的類癌幹細胞 (SP)，但是並未達到顯著差異。重複至少三次獨立實驗之後，將其量化數據做統計分析並繪出圖表，使用之統計方式為 Student’s T- test。. 49.

(55) A. B. (Ⅰ-圖四) SCNN1B 基因的 mRNA 在 HCT116 細胞株連續繼代培養三代之表現量比較 A.將 HCT116 細胞株連續培養三代，分別抽取每代之 RNA 進行 RT-PCR 之結果圖 B.RT-PCT 之結果分析圖，從結果可觀察到從第一代繼代到第三代，HCT116 細胞株中相較於貼盤細胞 (AD) SCNN1B 基因的表現量在類癌幹細胞 (SP) 中有上升的趨勢，並且在第三代達 50.

(56) 到顯差。重複至少三次獨立實驗之後，將其量化數據做統計分析並繪出圖表，使用之統計方式為 Student’s T- test (*：p<0.05)。. 51.

(57) (Ⅰ-圖五) SCNN1B 基因的 mRNA 在 DLD-1 細胞株連續繼代培養三代，類癌幹細胞之表限量相較於貼盤細胞有較高的趨勢。此為 p53 突變之大腸癌細胞株 DLD-1 連續培養三代後，分別抽取每代之 RNA 進行 RT-PCR 分析之結果，可以觀察到 SCNN1B 基因在經過繼代培養後在懸浮培養的類癌幹細胞 (SP) 中表現量皆高於貼盤細胞 (AD)，這樣的結果與在 HCT116 細胞株所觀察到的結果有相同的趨勢。. 52.

(58) A. B. 53.

(59) C. (Ⅰ-圖六) SCNN1B 基因的在對於臨床病患的影響。 A.利用 TCGA 資料庫中的統計資料進行大腸癌腫瘤檢體與正常組織 SCNN1B 基因表現量的比較。由結果可知 SCNN1B 在大腸癌患者腫瘤組織中的表現量並沒有高於正常組織。(Normal, n= 41，Primary tumor, n= 286) B.將不同階段進程之大腸癌腫瘤檢體以及正常組織做 SCNN1B 基因的表現量比較，雖說相較於正常組織，腫瘤檢體的表現量並沒有比正常組織的高，但隨著癌症的進程，SCNN1B 基因的表現量有上升的趨勢。(Normal, n= 41，Stage1, n= 45，Stage2, n= 110，Stage3, n= 80，Stage4, n= 39) C. SCNN1B 對於臨床病患存活率的影響，將病患群體依照 SCNN1B 表現量多寡分為兩群並比較其存活率，可以看到相較於 54.

(60) SCNN1B 基因表現量較低的組別，表現量較高組別的存活率有下降的趨勢，但沒有達顯差。(Low, n= 220，High, n= 220). 55.

(61) Ⅱ、建立藥物吸收之活細胞即時影像觀測系統. (Ⅱ-表一) 薑黃素配方乳液粒徑大小與濃度表為不同薑黃素濃度的配方乳液，經過高速均質 (HS) 以及不同次數的高壓均質 (HP) 後之粒徑大小。本研究中所使用之配方乳液選用薑黃素濃度 0.75%之 HS、HP1 以及 HP4 組別。(配方乳液相關數據由台灣大學食品科學研究所丁老師實驗室林冠汝同學提供). 56.

(62) A. B. (Ⅱ-圖一)藥物吸收活細胞即時影像系統之前測試驗 A. U373 細胞株加入 100 µM 薑黃素 DMSO 溶液後第 0 分鐘、15 分鐘以及 30 分鐘之吸收結果。薑黃素本身有自體綠螢光。未加薑黃素時並沒有綠螢光訊號，在第 80 秒加了薑黃素 DMSO 溶液之後，螢光信號在第 100 秒就出現在細胞中，直到 30 分鐘後都還有綠螢光的信號。(拍攝時長 30 分鐘，每 10 秒鐘拍一張照片，總共有 176 張，影片中每一秒播放 8 張照片，影片時長共 22 秒) B. Caco-2 細胞株加入 100 µM 薑黃素 DMSO 溶液後第 0 分鐘、15 分鐘以及 30 分鐘之吸收結果，在第 20 秒加了薑黃素 DMSO 溶液之後，螢光信號在第 40 57.

(63) 秒就出現在細胞中，直到 30 分鐘後都還有綠螢光的信號。(拍攝時長 30 分鐘，每 10 秒鐘拍一張照片，總共有 180 張，影片中每一秒播放 5 張照片，影片時長共 36 秒). 58.

(64) (Ⅱ-圖二) Caco-2 對於不同粒徑大小的薑黃乳液吸收效率 Caco-2 細胞株加入由台大食科所所提供之薑黃素乳液，乳液中薑黃素濃度為 20 µM (0.75%)，經過不同均質程度形成不同的粒徑大小，共五組，分別為 Curcumin (薑黃素粉末溶入中鍊三酸甘油脂中的組別)、HS- Curcumin (經過高速均質)、HP1- Curcumin (經過 1 次高壓均質)、HP4-Curcumin (經過 4 次高壓均質)以及 HP4 (經過 4 次高壓均質，但不含薑黃素)，粒徑由大至小分別為 HS- Curcumin＞HP1Curcumin＞HP4-Curcumin。“Curcumin”組為沒有經過均質化之控制組，“HP4”則是做為沒有薑黃素之控制組，以證明乳液本身沒有螢光， 59.

(65) 螢光訊號來自薑黃素。從影片結果顯示，雖然螢光出現最快的組別是 HP4- Curcumin，但都滯留在邊緣，而螢光進入細胞內的速度最快的是 HS- Curcumin 的組別，單就高壓均質組別的話，HP4-Curcumin 進入細胞的效率則優於 HP1-Curcumin。(拍攝時長 30 分鐘，每 10 秒鐘拍一張照片，總共有 180 張，影片中每一秒播放 5 張照片，影片時長共 36 秒) (白線框出的部分為細胞；白色箭頭所指則為細胞內螢光出現的地方；橘黃色箭頭所指為滯留在細胞膜之螢光信號). 60.

(66) A. B. C. 61.

(67) (Ⅱ-圖三) Caco-2 對於乳液吸收影像之螢光定量將影像利用程式進行螢光定量後，將各組之螢光值以及其出現時間點進行統計，並繪製圖表。A.將螢光訊號最早出現在細胞內的時間記錄下來進行統計，可以觀察到未經過均質化的組別 (Curcumin) 到了第 30 分鐘仍然沒有螢光信號出現在細胞內部，HP4-Curcumin 的組別出現螢光的時間最早，但螢光進入細胞的時間晚於 HS-Curcumin， HP1-Curcumin 螢光訊號則是三組配方乳液中最晚出現在細胞內部。 B.可以觀察到螢光的亮度 HP1-Curcumin 的組別低於 HS-Curcumin 以及 HP4-Curcumin 的組別，而 HS-Curcumin 以及 HP4-Curcumin 的螢光亮度卻沒有太大差異，未經過均質處理的 Curcumin 組別螢光量度則皆低於其餘三組。 C. HS-Curcumin 、 HP1-Curcumin 以及 HP4-Curcumin 螢光最大值出現的時間相差無幾，Curcumin 做為沒有經過均質處理組別之對照組，雖然螢光量最大值出現的時間較其他組早，但是螢光的強度卻是比較低的。(n=3). 62.

(68) A. B. 63.

(69) C. (Ⅱ-圖四)傳統研究藥物吸收之模型 A. Caco-2 細胞以 1×105 顆∕well 的數量培養在 Transwell 中，第一周每兩天換一次培養液，第二周開始每天換一次培養液，培養的第三天開始每兩天測一次電阻值，第二周開始每天測一次點組值，並且利用研究材料與方法中的式一以及式二算出每平方公分的單位電阻值。統計圖是將 12well 每天測量的電阻值做平均後所得出的值，可以看到在第三天電阻值就達到了約 560 左右，但在第二周電阻值就有下降的趨勢，一直到第 19 天才慢慢回升，並在第 25 天達到達到實驗所需之電阻值，故在第 25 天進行加藥。將統計完的數值 (原始數值) 每五天取一個點進行統計圖的繪製，可以清楚看到下降後再上升的趨勢 (簡略數值)。B.使用 C18 管柱，以 0.1% H3PO4 水溶液以及乙腈作 64.

(70) 為移動向，將體積流速設定為 1.5 mL/min，氘燈 (D2) 測量範圍設定在 190-800 nm，計算在 425nm 的吸光度。將薑黃素分別配置成 0.3125、0.625、1、1.25、2.5 以及 5 ppm 的濃度進行 HPLC 分析，經計算得出之波鋒面積繪製成標準曲線。C. 樣品經 EA 萃取風乾後，用 DMSO 回溶並進行 HPLC 分析，將加藥後第 24 小時所測得之數據進行分析並繪製圖表，可以觀察到 HS-Curcumin、HP4-Curcumin 以及 HP1-Curcumin 的組別都有被細胞吸收， HS-Curcumin 、 HP4-Curcumin 兩組吸收率並無明顯差異，而 HP1-Curcumin 的組別則是薑黃素乳液中最差的，未經過均質處理的 Curcumin 組別則沒有被吸收。. 65.

(71) Ⅳ、參考文獻 1. 2. 3.. 4.. 5. 6.. 7.. 8. 9. 10.. 11.. 12. 13. 14.. Shangkuan, W.C., et al., Risk analysis of colorectal cancer incidence by gene expression analysis. PeerJ, 2017. 5: p. e3003. O'Connell, J.B., et al., Rates of colon and rectal cancers are increasing in young adults. The American surgeon, 2003. 69(10): p. 866. Siegel, R.L., A. Jemal, and E.M. Ward, Increase in incidence of colorectal cancer among young men and women in the United States. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2009. 18(6): p. 1695-8. Santarelli, R.L., F. Pierre, and D.E. Corpet, Processed meat and colorectal cancer: a review of epidemiologic and experimental evidence. Nutrition and cancer, 2008. 60(2): p. 131-144. Ferguson, L.R., Meat and cancer. Meat science, 2010. 84(2): p. 308-313. Hord, N.G., Y. Tang, and N.S. Bryan, Food sources of nitrates and nitrites: the physiologic context for potential health benefits–. The American journal of clinical nutrition, 2009. 90(1): p. 1-10. Kanwar, S.S., A. Poolla, and A.P. Majumdar, Regulation of colon cancer recurrence and development of therapeutic strategies. World J Gastrointest Pathophysiol, 2012. 3(1): p. 1-9. Wolin, K.Y., et al., Physical activity and colon cancer prevention: a meta-analysis. Br J Cancer, 2009. 100(4): p. 611-6. Phua, L.C., et al., Non-invasive fecal metabonomic detection of colorectal cancer. Cancer Biol Ther, 2014. 15(4): p. 389-97. Lin, B.R., et al., Overall Survival of Stage III Colon Cancer with Only One Lymph Node Metastasis Is Independently Predicted by Preoperative Carcinoembryonic Antigen Level and Lymph Node Sampling Status. PLoS One, 2015. 10(9): p. e0137053. Kekelidze, M., et al., Colorectal cancer: current imaging methods and future perspectives for the diagnosis, staging and therapeutic response evaluation. World journal of gastroenterology: WJG, 2013. 19(46): p. 8502. De Rosa, M., et al., Genetics, diagnosis and management of colorectal cancer. Oncology reports, 2015. 34(3): p. 1087-1096. Yeh, Y.-S., et al., Prognostic and molecular factors in stage II colorectal cancer. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences, 2011. 3(1): p. 2-8. Stoehlmacher, J., et al., A multivariate analysis of genomic polymorphisms: prediction of clinical outcome to 5-FU/oxaliplatin combination chemotherapy in refractory colorectal cancer. British journal of cancer, 2004. 91(2): p. 344. 66.