表 1、本研究所使用的引子列表
Primer name Sequence (5’-3’) Usage
Plasmid construction
WSSV108-500-F CTAGCTAGCGGTACG
AAGAAACCTGATG pGL3-wssv108 (-132/+368)
WSSV108-500-R CCGCTCGAGTTTC
WSSV108 (-470-0)-F CTAGCTAGCCAATGACG
TCAATGATGCCC pGL3-wssv108 (-102/+368)
WSSV108 (-440-0)-F CTAGCTAGCGGAAGAATGCGGAA
TAAAAATTG pGL3-wssv108 (-72/+368)
WSSV108 (-420-0)-F CTAGCTAGCTTGGGGGCGGGGCTT
CTA pGL3-wssv108 (-52/+368)
IE1-268-F-XhoI CCGCTCGAGGGTGTTA
AAGAAGCAGTTGTG pGL3-ie1 (-268/+52)
IE1-94-F-XhoI CCGCTCGAGCCTTGT
TACTCATTTATTCCTAG pGL3-ie1 (-94/+52)
IE1-44-F-BamHI CGGGTACCAGCATAT
TTGTGTATATA pGL3-ie1 (-44/+52)
IE1-31-F-XhoI TCGAGTATAAGAGVVVGTGTTAGC
TCCTCGATTCAGTCACAAGAGA pGL3-ie1 (-31/+10)
IE1-52-R-HindIII CCCAAGCTTCTTGAG TGGAGAGAGAGAGC
pGL3-ie1 (-268/+52) pGL3-ie1 (-94/+52) pGL3-ie1 (-44/+52)
doi:10.6342/NTU201600589 31
IE1-10-R-HindIII AGCTTCTCTTGTGACTGAATCGAG
GAGCTAACACGGGCTCTTATAC pGL3-ie1 (-31/+10)
WSSV-304-500-F TCCCCCGGGAAAAACTTTTAAAAA
ATTTTTCTGG pGL3-wssv304 (-412/+82)
WSSV304-de-175-F TCCCCCGGGCAGAAACAGGATATG
ATATC pGL3-wssv304 (-93/+82)
WSSV304-de-118-F TCCCCCGGGTGGGTGTATAAAAGA
GCGC pGL3-wssv304 (-36/+82)
WSSV304 -25-F-SmaI GGGTATAAAAGAGCGCTGCGGAG
AGGCAGAAACATCAG A pGL3-wssv304 (-25/+10)
WSSV-304-500-R CCCAAGCTTGGCTGCGAGAATGGT
CAGCGCTCTTTTATACACCCCCC pGL3-wssv304 (-30/+10)
LvYY1-F CGGGATCCATGGCTTCCTCCGACT
doi:10.6342/NTU201600589
Unlabeled probe (圖 10)
ie1 (-31/+10)-b AGCTTCTCTTGTGACTGAATCGAG
GAGCTAACACGGGCTCTTATAC Unlabeled probe (圖 10)
wssv304 (-30/+10)-b CTGATGTTTCTGCCTCTCCGCAGC
GCTCTTTTATACACCC Unlabeled probe (圖 10, 11)
wssv304-TATA mut-a GGGTGCCCCCCCGAGCGCTGCGGA
GAGGCAGAAACATCAG Unlabeled probe (圖 11)
wssv304-TATA mut-b CTGATGTTTCTGCCTCTCCGCAGC
GCTCGGGGGGGCACCC Unlabeled probe (圖 11)
wssv304-Mut1-a GGGTGTATAAAACCCCCCCCCGGA
GAGGCAGAAACATCAG Unlabeled probe (圖 11)
wssv304-Mut1-b CTGATGTTTCTGCCTCTCCGGGGG
GGGGTTTTATACACCC Unlabeled probe (圖 11)
wssv304-Mut2-a GGGTGTATAAAAGAGCGCTGCGG
AGAGGCAGAAACATCAG Unlabeled probe (圖 11)
wssv304-Mut2-b CTGATGTTTCTGCCTCTCCGCAGC
GCTCTTTTATACACCC Unlabeled probe (圖 11)
YY1-Consensus-F CCGTCCGCGGCCATCTTGGCGGCT
doi:10.6342/NTU201600589 33
STAT binding site-1 TTATTCCTAGAAATG Unlabeled probe (圖 10, 11)
STAT binding site-2 CATTTCTAGGAATAA Unlabeled probe (圖 10, 11)
ie1-YY1-F (binding site-1) GCAGATGAAAATGGC TGTTTG Labeled probe (圖 12)
ie1-100-70-R TTCTAGGAATAAATGAGTAACAAG
GAAATT Unlabeled probe (圖 12)
LvYY1-ie1-Site-B-F GCAGATGAAAATGGCTGTTTG Labeled probe (圖 16)
LvYY1-ie1-Site-B-R CAAACAGCCATTTTCATCTGC Labeled probe (圖 16)
DAPA
wssv304 (-30/+10)-a GGGTGTATAAAAGAGCGCTGCGG
AGAGGCAGAAACATCAG Unlabeled probe (圖 14)
wssv304(-30/+10)-b-biotin CTGATGTTTCTGCCTCTCCGCAGC
GCTCTTTTATACACCC Unlabeled probe (圖 14)
doi:10.6342/NTU201600589 34
圖 1、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 wssv108 啟動子轉錄活性的影響
(A) wssv108 啟動子報導質體示意圖。(B) 將報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368) 與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal、pIB-LvCactus 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞，於 42 小時後偵測冷光活性數值。實驗分別由獨立的三次 實驗證明，以 ANOVA 及 Turkey 檢定法進行統計分析，星號 (*) 代表實驗組間具 有顯著差異 (p value < 0.05)。
doi:10.6342/NTU201600589 35
圖 2、LvYY1 與 LvDorsal 在細胞內的結合
將表現質體 pDHsp-LvYY1-Flag-His (lanes 1, 2, 3, 4) 分別與 pDHsp-EGFP-V5-His (lanes 1, 3) 以及 pDHsp-LvDorsal-GFP (lanes 2, 4) 轉染至 Sf9 細胞，於 72 小時後收 取細胞，加入抗 Flag 抗體膠體進行免疫沉澱分析 (IP)，接著以抗 Flag 抗體及抗 GFP 抗體進行西方點墨法 (IB)。
IP： immunoprecipitation；IB：immunoblotting；IgGH：immunoglobin heavy chain；
IgGL：immunoglobin light chain
doi:10.6342/NTU201600589 36
圖 3、LvYY1 與 LvDorsal 在細胞外的結合
將 細 菌 表 現 的 GST-LvYY1 分 別 與 E. coli BL21(DE3)(pET32a (+)) 、 E. coli BL21(DE3)(pET28a-LvDorsal) 的細菌溶裂液以及 glutathione-Sepharose agarose 混 合，於 4°C 作用 2 小時。以抗 GST 抗體進行西方點墨法 (IB)，偵測結合於膠體的 GST 融合蛋白質 (lane 1)，以抗 His 抗體偵測結合於 GST-LvYY1-glutathione Sepharose (lanes 4, 5) 膠體的蛋白質。
IB：immunoblotting
doi:10.6342/NTU201600589 37
Reporter Synergistic fold (YD/Y+D)
pGL3-wssv108 (-132/+368) 2.71 ± 0.42 pGL3-wssv108 (-102/+368) 2.37 ± 0.35 pGL3-wssv108 (-72/+368) 2.31 ± 0.74 pGL3-wssv108 (-52/+368) 1.36 ± 0.48 pGL3-wssv108 (-91/-83)-YY1 mut 2.08 ± 0.2
doi:10.6342/NTU201600589 38
圖 4、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 wssv108 啟動子片段轉錄活性的影響 (A) 圖左側為 wssv108 啟動子刪除株之序列片段示意圖，轉錄起始點以 +1 表示，
負號代表轉錄起始點上游區域，TATA box 及 YY1 預測位置如圖所示。將不同
wssv108 啟動子截切片段分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照表現
質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞，於 42 小時後偵測冷光活性數值。白色長條 圖表示共轉染不同 wssv108 啟動子片段的報導質體及對照表現質體 pIB/V5 之組別；淺灰色長條圖表示共轉染不同 wssv108 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB-LvYY1 之組別；深灰色長條圖表示共轉染不同 wssv108 啟動子片段的報導質體及 表現質體 pIB-LvDorsal 之組別；黑色長條圖表示共轉染不同 wssv108 啟動子片段 的報導質體及表現質體 pIB-LvYY1 與 pIB-LvDorsal 之組別。(B) 將共轉染不同
wssv108 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB/V5 之活化倍率設定為 1，各組數
值以此進行標準化。Synergistic fold 為【黑色長條圖倍率/（淺灰色+深灰色）長條 圖倍率】的比值，數據為三次獨立實驗的平均值，以 ANOVA 及 Turkey 檢定法進 行統計分析。doi:10.6342/NTU201600589 39
Reporter Synergistic fold (YD/Y+D)
pGL3-wssv304 (-418/+82) 0.86 ± 0.55 pGL3-wssv304 (-93/+82) 3.1 ± 0.9 pGL3-wssv304 (-36/+82) 5.3 ± 1.99 pGL3-wssv304 (-25/+10) 4.79 ± 0.87
doi:10.6342/NTU201600589 40
圖 5、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 wssv304 啟動子片段轉錄活性的影響 (A) wssv304 啟動子刪除株之序列片段示意圖。轉錄起始點以 + 1 表示，KLF 及 TATA box 預測位置如圖所示。(B) 將不同 wssv304 啟動子截切片段分別與表現質 體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞，於 42 小時後偵測冷光活性數值。白色長條圖表示共轉染不同 wssv304 啟動子片段的 報導質體及對照表現質體 pIB/V5 之組別；淺灰色長條圖表示共轉染不同 wssv304 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB-LvYY1 之組別；深灰色長條圖表示共轉染 不同 wssv304 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB-LvDorsal 之組別；黑色長條 圖表示共轉染不同 wssv304 啟動子片段的報導質體及表現質體 LvYY1 與 pIB-LvDorsal 之組別。(C) 將共轉染不同 wssv304 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB/V5 之活化倍率設定為 1，各組數值以此進行標準化。Synergistic fold 為【黑 色長條圖倍率/（淺灰色+深灰色）長條圖倍率】的比值，數據為三次獨立實驗的 平均值，以 ANOVA 及 Turkey 檢定法進行統計分析，星號 (*) 代表實驗組與
wssv304 全長啟動子的報導質體 pGL3-wssv304 (-418/+82) 組別間具有顯著差異 (p
value < 0.05)。doi:10.6342/NTU201600589 41
Reporter Synergistic fold (YD/Y+D)
pGL3-ie1 (-268/+52) 1.34 ± 0.62
pGL3-ie1 (-94/+52) 1.5 ± 0.35
pGL3-ie1 (-44/+52) 3.61 ± 1.04
pGL3-ie1 (-31/+10) 4.8 ± 2.52
doi:10.6342/NTU201600589 42
圖 6、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 ie1 啟動子片段轉錄活性的影響
(A) ie1 啟動子刪除株之序列片段示意圖。轉錄起始點以 +1 表示，TATA box 及其 他轉錄因子結合的預測位置如圖所示。(B) 將不同 ie1 啟動子截切片段分別與表現 質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞，
於 42 小時後偵測冷光活性數值。白色長條圖表示共轉染不同 ie1 啟動子片段的報 導質體及對照表現質體 pIB/V5 之組別；淺灰色長條圖表示共轉染不同 ie1 啟動子 片段的報導質體及表現質體 pIB-LvYY1 之組別；深灰色長條圖表示共轉染不同
ie1 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB-LvDorsal 之組別；黑色長條圖表示共
轉染不同 ie1 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB-LvYY1 與 pIB-LvDorsal 之組 別。(C) 將共轉染不同 ie1 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB/V5 之活化倍率 設定為 1，各組數值以此進行標準化。Synergistic fold 為【黑色長條圖倍率/（淺 灰色+深灰色）長條圖倍率】的比值，數據為三次獨立實驗的平均值，以 ANOVA 及 Turkey 檢定法進行統計分析，星號 (*) 代表實驗組與 ie1 全長啟動子的報導質 體 pGL3-ie1 (-268/+52) 組別間具有顯著差異 (p value < 0.05)。doi:10.6342/NTU201600589 43
圖 7、LvYY1 與 LvDorsal 協同活化極早期基因 wssv304 及 ie1 的核心啟動子 (A) wssv304 及 ie1 之全長與核心啟動子序列片段示意圖。轉錄起始點以 +1 表示，
TATA box 及其他轉錄因子的預測結合位置如圖所示。(B) 將不同 wssv304 及 ie1 啟動子截切片段分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞，於 42 小時後偵測冷光活性數值。白色長條圖表 示共轉染不同 wssv304 與 ie1 啟動子片段的報導質體及對照表現質體 pIB/V5 之組 別；淺灰色長條圖表示共轉染不同 wssv304 與 ie1 啟動子片段的報導質體及表現 質體 pIB-LvYY1 之組別；深灰色長條圖表示共轉染不同 wssv304 與 ie1 啟動子片 段的報導質體及表現質體 pIB-LvDorsal 之組別；黑色長條圖表示共轉染不同
wssv304 與 ie1 啟動子片段的報導質體及表現質體 pIB-LvYY1 與 pIB-LvDorsal 之
組別。實驗分別由獨立的三次實驗證明，以 ANOVA 及 Turkey 檢定法進行統計分 析，星號 (*) 代表實驗組間具有顯著差異 (p value < 0.05)。doi:10.6342/NTU201600589 44
圖 8、LvYY1 與 PmTBP 在細胞內的結合
將表現質體 pDHsp-PmTBP-V5-His (lanes 3, 4, 5, 6) 分別與 pDHsp-EGFP-Flag-His (lanes 1, 3, 5) 以及 pDHsp-LvYY1-Flag-His (lanes 2, 4, 6) 轉染至 Sf9 細胞，於 72 小 時後收取細胞，加入抗 Flag 抗體膠體進行免疫沉澱分析 (IP)，接著以抗 Flag 抗體 及抗 V5 抗體進行西方點墨法 (IB)。
IP： immunoprecipitation；IB：immunoblotting
doi:10.6342/NTU201600589 45
圖 9、西方點墨法偵測 LvYY1 及 LvDorsal 蛋白質在 Sf9 昆蟲細胞中的表現 將表現質體 pDHsp-LvYY1-Flag-His (lanes 3, 4, 7, 8) 及 pDHsp-LvDorsal-V5-His (lanes 5, 6, 7, 8) 轉染至 Sf9 昆蟲細胞，於 72 小時後收取細胞，以核質分離法分離 出細胞質萃取物 (Cy) 及細胞核萃取物 (Nu)，接著以抗 His 抗體進行西方點墨法 (IB) 偵測蛋白質的表現。
IB：immunoblotting
doi:10.6342/NTU201600589 46
圖 10、LvYY1 結合於 wssv304 核心啟動子上
(A) 電泳泳動性轉移分析結果圖。Lane 1 為以 biotin 標定的 wssv304 核心啟動子的 40-mer 片段之 DNA 探針。Lane 2 為標定探針與未轉染表現質體之 Sf9 核蛋白萃 取物作用的結果。Lane 3 為標定探針與表現 pDHsp-LvYY1-Flag 的 Sf9 核蛋白萃 取 物 作 用 所形成 的 LvYY1-DNA 複合體 。 Lanes 4-7 則是以 競爭者 序 列競爭 LvYY1-DNA 複合體，分別為 304 (-30/+10)、ie1 (-31/+10)、Consensus 以及 STAT，
而其中以 STAT 作為非專一性競爭的控制組，競爭者序列的濃度為標定探針的 100 倍。Lane 8 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。(B) 以 biotin 標定的探針 序列以及競爭者序列示意圖，YY1 保守性結合序列以粗體標示。
doi:10.6342/NTU201600589 47
圖 11、以多點突變競爭者序列分析 LvYY1 的 DNA 結合區域
(A) 電泳泳動性轉移分析結果圖。Lane 1 為標定探針與未轉染表現質體之 Sf9 核蛋 白萃取物作用的結果。Lane 2 為標定探針與表現 pDHsp-LvYY1-Flag 的 Sf9 核蛋 白萃取物作用所形成的 LvYY1-DNA 複合體。Lanes 3-8 則是以競爭者序列競爭 LvYY1-DNA 複合體，競爭者序列濃度為標定探針的 100 倍，分別為 wssv304 核 心啟動子的 40-mer 片段 304 (-30/+10)、TATA box mut、Mut1、Mut2、Consensus 以及 STAT，而其中以 STAT 作為非專一性競爭的控制組。Lane 9 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。Lane 10 為使用抗 TBP 抗體進行 supershift 分析。(B) 以 biotin 標定的探針序列以及競爭者序列示意圖，YY1 保守性結合序列以粗體標 示，突變位置則以小寫斜體字母標示。
doi:10.6342/NTU201600589 48
圖 12、LvYY1 與 LvDorsal 會結合於 ie1 啟動子上的 YY1 及 NF-κB 結合位 (A) 電泳泳動性轉移分析結果圖。Lane 1 為標定探針與未轉染表現質體之 Sf9 核蛋 白萃取物作用的結果。Lane 2 為標定探針與表現 pDHsp-LvYY1-Flag 的 Sf9 核蛋 白萃取物作用所形成的 LvYY1-DNA 複合體。Lanes 3 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。Lane 4 為使用抗 V5 抗體進行 supershift 分析。Lane 5 為標定探針 與表現 pDHsp-LvDorsal-V5 的 Sf9 核蛋白萃取物作用所形成的 LvDorsal-DNA 複 合體。Lane 6 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。Lane 7 為使用抗 V5 抗體進 行 supershift 分析。Lane 8 為標定探針與共表現 LvYY1-Flag 及 pDHsp-LvDorsal-V5 的 Sf9 核蛋白萃取物作用所形成的 LvYY1-LvDorsal-DNA 複合體。
Lane 9 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。Lane 10 為使用抗 V5 抗體進行 supershift 分析。(B) 以 biotin 標定的探針序列示意圖。
doi:10.6342/NTU201600589 49
圖 13、以電泳泳動性轉移法分析 LvDorsal 與 wssv304 核心啟動子的結合
(A) 電泳泳動性轉移分析結果圖。Lane 1 為標定探針與未轉染表現質體之 Sf9 核蛋 白萃取物作用的結果。Lane 2 為標定探針與表現 pDHsp-LvYY1-Flag 的 Sf9 核蛋 白萃取物作用所形成的 LvYY1-DNA 複合體。Lanes 3 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。Lane 4 為使用抗 V5 抗體進行 supershift 分析。Lane 5 為標定探針 與表現 pDHsp-LvDorsal-V5 的 Sf9 核蛋白萃取物作用。Lane 6 為使用抗 YY1 抗體 進行 supershift 分析。Lane 7 為使用抗 V5 抗體進行 supershift 分析。Lane 8 為標定 探針與共表現 pDHsp-LvYY1-Flag 及 pDHsp-LvDorsal-V5 的 Sf9 核蛋白萃取物作 用，而 LvYY1 會與 DNA 形成複合體。 Lane 9 為使用抗 YY1 抗體進行 supershift 分析。Lane 10 為使用抗 V5 抗體進行 supershift 分析。(B) 以 biotin 標定的探針序 列示意圖。
doi:10.6342/NTU201600589 50
圖 14、以 DNA 親和性沉澱法分析 LvDorsal 與 wssv304 核心啟動子的結合
將表現質體 pDHsp-EGFP-V5-His、pDHsp-LvYY1-Flag-His、pDHsp-LvDorsal-V5-His 及 (pDHsp-LvYY1-Flag-pDHsp-EGFP-V5-His、pDHsp-LvYY1-Flag-His、pDHsp-LvDorsal-V5-His + pDHsp-LvDorsal-V5-pDHsp-EGFP-V5-His、pDHsp-LvYY1-Flag-His、pDHsp-LvDorsal-V5-His) 轉染至 Sf9 昆蟲細胞，
於 72 小時後收取細胞，加入已預先結合 biotin 標定之 wssv304 核心啟動子的 Streptavidin 膠體中進行 DNA 親和性沉澱分析，接著分別以抗 GFP 抗體、抗 YY1 抗體以及抗 V5 抗體進行西方點墨法 (IB)。
IB：immunoblotting
doi:10.6342/NTU201600589 51
圖 15、LvYY1 及 LvDorsal 協同調控 wssv304 核心啟動子的模式圖
LvYY1 可能會透過 Sf9 昆蟲細胞內生的基礎轉錄因子 (general transcription factor,
LvYY1 可能會透過 Sf9 昆蟲細胞內生的基礎轉錄因子 (general transcription factor,