doi:10.6342/NTU201600589
國立臺灣大學生命科學院生化科技學系 碩士論文
Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science
National Taiwan University Master Thesis
白蝦 YY1 及 Dorsal 蛋白質協同調控白點症病毒極早期 基因的表現
Regulation of the immediate-early genes of white spot syndrome virus by Litopenaeus vannamei YY1 and Dorsal
王開立 Kai-Li Wang
指導教授：張麗冠 博士 Advisor：Li-Kwan Chang, Ph.D.
中華民國 105 年 6 月
June, 2016
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謝辭
時間過得很快，轉眼之間兩年的碩士班生活即將劃下句點。一路上要感謝的 人太多，謝謝張麗冠老師願意收我作為您的研究生，即使我大學所讀的科系與分 子病毒幾乎沒有關係，我也非常開心能夠於您的實驗室學習。另外，謝謝老師這 兩年來的指導，我很幸運及感激能在攻讀碩士的這兩年中有機會出國參加研討 會，看看外面的世界。謝謝黃筱茜學姊在我剛來的時候帶我認識實驗室的環境。
謝謝妤璇幫我們打理好實驗室的大小事，讓我們能夠沒有後顧之憂的專注於實驗 上，實驗室有您真好。謝謝楊雅君學姊，雖然我們相處的時間不長，但是妳教會 了我許多的實驗操作方法及一些實驗上需要注意的小細節，希望以後有機會能再 一起吃個飯，也祝妳在美國工作順利。謝謝蝦組戰神黃柄翰學長，很開心有機會 能夠成為蝦組的一員，若沒有你，我的碩班之路一定會走得更加崎嶇。感謝你在 這兩年中給了我許多實驗上的想法，而我也從你身上學到了許多事情，包括：做 研究的態度、做實驗的技巧及嘴砲技巧等。另外，很開心有機會能夠跟你一起出 國參加研討會，也謝謝你辛苦的安排行程。謝謝大黃平常在實驗上給予我的幫 助，以後有機會的話再一起打球或是看演唱會吧。謝謝蝦組夥伴吳智宇，我們之 間相處的狀況應該比巧克和 OD 和平許多吧，至少沒有對於 rack 的執著，雖然你 在處理許多事情上常常出包，但是你也幫助我解決了許多實驗上所遇到的瓶頸，
祝你之後工作順利。謝謝蝦組最優秀的學妹林庭安，跟妳討論實驗的時候總會獲 得一些很棒的看法，而我也時常透過妳優異的表現來檢討我自己，我相信不管以 後的實驗遇到什麼樣的瓶頸，妳一定都能不費吹灰之力的解決它的，加油。謝謝 LKC 實驗室裡的林民軒、蔡曉涵、翁筠婷、陳則堯、殷群、陳紀元、荊士瑋等學 長、同學及學弟妹，因為有你們，使得我碩士班這兩年的生活過得非常精彩。最 後，感謝我的父母這兩年來對我的支持及鼓勵，使我能夠順利地取得碩士學位。
現階段的任務即將結束，這也意謂著下一個挑戰即將到來，我會更努力的充 實自己，克服艱難的挑戰。祝福實驗室的各位實驗順利、身體健康。
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中文摘要
白點症病毒 (white spot syndrome virus, WSSV) 為目前蝦養殖產業最主要也是 最致命的病原菌。自白點症病毒爆發至今已有二十餘年，但因其開放譯讀區的序 列與目前已知的物種有很大的差異，因此至今尚未能完全了解其致病機制並發展 出有效的藥物來控制白點症病毒所造成的疫情。白點症病毒為一具有外套膜的大 型 雙 股 DNA 病 毒 ， 能 感 染 許 多 的 甲 殼 類 動 物 (crustacean) ， 其 中 對 蝦 科 (Penaeidae) 在感染此病毒後會在二至五天內死亡，死亡率高達 90%-100%。本研 究室從白蝦 (Litopenaeus vannamei) 選殖出一轉錄因子，將此轉錄因子基因的胺基 酸序列進行線上資料庫比對後，發現其為一個類 Ying Yang 1 (YY1) 蛋白質，並 將其命名為 LvYY1。先前本研究室的研究指出，LvYY1 會透過結合於白點症病 毒極早期基因 wssv108 以及 ie1 啟動子上的 YY1 結合位來調控啟動子的轉錄活 性。Dorsal 是哺乳類動物 NF-κB 家族轉錄因子中 RelA 的同源蛋白質，而許多報 導指出，Dorsal 轉錄因子會參與無脊椎動物的 Toll/NF-κB 調控路徑，此路徑為無 脊椎動物先天性免疫的調控者。本研究透過冷光報導分析法 (luciferase reporter assay) 發現 LvYY1 能活化 wssv108 啟動子的轉錄活性至 10.39 倍，過量表現 LvDorsal 時則無法活化 wssv108 基因的表現。但是當共表現 LvYY1 與 LvDorsal 時會協同活化 wssv108 啟動子的轉錄活性至 44.57 倍，此現象說明 LvYY1 及 LvDorsal 會協同調控極早期基因 wssv108 的表現。除此之外，LvYY1 與 LvDorsal 也會協同調控 ie1 及 wssv304 核心啟動子的轉錄活性。另外利用 GST-pull down 法 發現 LvYY1 與 LvDorsal 能在細胞體外直接結合，而透過免疫共沉澱法也得知 LvYY1 分別能與 LvDorsal 及 PmTBP 於細胞內結合。然後以電泳泳動性轉移分析 法 (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 及 DNA 親和性沉澱分析法 (DNA affinity precipitation assay, DAPA) 證實 LvYY1 可能會伴隨著細胞中內生的轉錄因 子結合在 wssv304 的核心啟動子上。LvYY1 於協同效應中扮演著關鍵的角色，而 白點症病毒能夠挾持宿主轉錄因子 LvYY1 及 LvDorsal 大量表現極早期基因，以 協助自身基因組的複製。
關鍵字：White spot syndrome virus (WSSV)、Litopenaeus vannamei、wssv108、
ie1、wssv304、Ying Yang 1、Dorsal
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Abstract
White spot syndrome virus (WSSV) is a major and deadly pathogen that causes heavy losses on the shrimp farming worldwide. It has been almost twenty years since its emergence in 1990s. Until now, there are no effective treatments for WSSV due to lacking of the sequenced and annotated genomes for the host species. WSSV is a large enveloped dsDNA virus. There are many crustacean host susceptible to WSSV, especially it causes the penaeidae death with a mortality rate of 90%-100% within five days. LvYY1 was cloned from Litopenaeus vannamei in our lab. According to the amino acid sequence blast on NCBI, we found that it is a YY1-like protein, thus it was named Litopenaeus vannamei YY1 (LvYY1). In recent studies, we showed that the LvYY1 promotes the transcription of the critical WSSV IE genes, ie1 and wssv108.
Moreover, L. vannamei Dorsal (LvDorsal), a RelA (p65) homolog in the mammals, was known to participate in Toll/NF-κB pathway to regulate shrimp innate immune for pathogen resistance. In this study, we found that LvYY1 activates wssv108 promoter activity 10.39-fold in an insect cell model. However, overexpression of LvDorsal failed to activate
wssv108
expression. Interestingly, GST-pull down and co- immunoprecipitation results indicate that LvYY1 interacts with LvDorsal and PmTBP respectively, and the two factors synergistically activate wssv108 promoter activity 44.57-fold in cotransfection experiments. We also found that LvYY1 and LvDorsal synergistically activate ie1 and wssv304 core promoter activity. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) results revealed that LvYY1 binds to wssv304 core promoter. Taken together, these results demonstrate that LvYY1 plays a key role in the synergistic effect. LvYY1 and LvDorsal synergistically modulate the transcription of wssv108, ie1 and wssv304, which may be a strategy employed by WSSV to enhance viral replication.doi:10.6342/NTU201600589
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Keywords：White spot syndrome virus (WSSV)、Litopenaeus vannamei、wssv108、
ie1、wssv304、Ying Yang 1、Dorsal
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目錄
謝辭……… i
中文摘要 ... ii
Abstract ... iii
第一章 前言 ... 1
1. 臺灣蝦養殖產業的發展概況 ... 1
2. 白點症病毒 (White spot syndrome virus, WSSV) ... 2
3. 白點症病毒的極早期基因 ... 4
4. Ying Yang 1 (YY1) 轉錄因子 ... 5
5. NF-κB 家族轉錄因子 ... 7
第二章 材料與方法 ... 9
1. 實驗菌種與細胞株 ... 9
2. 質體 DNA 萃取... 9
3. 質體建構 ... 9
4. 勝任細胞的製備 ... 10
5. 細胞轉型 ... 11
6. 細胞轉染 ... 11
7. 細胞核蛋白質萃取 ... 12
8. 冷光報導活性分析 (Luciferase reporter assay) ... 12
9. 蛋白質的表現誘導 ... 13
10. 西方點墨法 (Western blotting) ... 13
11. 電泳泳動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) ... 14
12. GST-pull down ... 15
13. 免疫共沉澱法 (Co-immunoprecipitation, Co-IP) ... 15
14. DNA 親和性沉澱分析 (DNA affinity precipitation assay, DAPA) ... 16
第三章 結果 ... 17
1. LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv108 啟動子 ... 17
2. LvYY1 會與 LvDorsal 在細胞內結合 ... 17
3. LvYY1 與 LvDorsal 在細胞體外直接結合 ... 18
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4. 縮減 wssv108 啟動子片段對於 LvYY1 與 LvDorsal 協同效應之影響 ... 18
5. LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv304 的核心啟動子 ... 18
6. LvYY1 與 LvDorsal 對 ie1 的核心啟動子的協同活化 ... 19
7. LvYY1 與 PmTBP 在細胞內結合 ... 19
8. LvYY1 會結合於 wssv304 的核心啟動子 ... 20
9. LvYY1 結合於 wssv304 啟動子上的 TATA box 及其後 8-mer 的序列 ... 21
10. LvDorsal 會結合於 ie1 啟動子上的 NF-κB 結合位 ... 21
11. LvDorsal 於協同效應中所扮演的角色 ... 22
第四章 討論 ... 24
第五章 圖表 ... 30
表 1、本研究所使用的引子列表 ... 30
圖 1、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 wssv108 啟動子轉錄活性的影響 ... 34
圖 2、LvYY1 與 LvDorsal 在細胞內的結合 ... 35
圖 3、LvYY1 與 LvDorsal 在細胞外的結合 ... 36
圖 4、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 wssv108 啟動子片段轉錄活性的影響 . 38 圖 5、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 wssv304 啟動子片段轉錄活性的影響 . 40 圖 6、LvYY1 與 LvDorsal 對於極早期基因 ie1 啟動子片段轉錄活性的影響 ... 42
圖 7、LvYY1 與 LvDorsal 協同活化極早期基因 wssv304 及 ie1 的核心啟動子 ... 43
圖 8、LvYY1 與 PmTBP 在細胞內的結合 ... 44
圖 9、西方點墨法偵測 LvYY1 及 LvDorsal 蛋白質在 Sf9 昆蟲細胞中的表現 ... 45
圖 10、LvYY1 結合於 wssv304 核心啟動子上 ... 46
圖 11、以多點突變競爭者序列分析 LvYY1 的 DNA 結合區域 ... 47
圖 12、LvYY1 與 LvDorsal 會結合於 ie1 啟動子上的 YY1 及 NF-κB 結合位 ... 48
圖 13、以電泳泳動性轉移法分析 LvDorsal 與 wssv304 核心啟動子的結合 ... 49
圖 14、以 DNA 親和性沉澱法分析 LvDorsal 與 wssv304 核心啟動子的結合 ... 50
圖 15、LvYY1 及 LvDorsal 協同調控 wssv304 核心啟動子的模式圖 ... 51
圖 16、E. coli BL21(DE3) 所表現的 LvYY1 能結合於極早期基因 ie1 啟動子上的 YY1 結合位 ... 52
第六章 參考文獻 ... 53
第七章 附錄 ... 65
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第一章 前言
1.
臺灣蝦養殖產業的發展概況隨著世界人口快速的成長及全球性氣候的異常，陸地所能提供的食物來源已 經漸漸的供不應求，而海洋漁業也無大幅增產的可能性，因此水產養殖的重要性 與日俱增。臺灣養蝦業者早期大多採取與虱目魚混養的方式來養殖草蝦，產量並 不是很高。1968 年由廖一久博士成功建立草蝦 (Penaeus monodon) 的人工繁殖技 術後，又因草蝦本身對環境的耐受性高且生長快速，因此臺灣的草蝦生產量逐年 上升 (Liao et al., 1969)。1977 年產量攀升至上千公噸，1987 年，草蝦的年產量更 高達九萬五千多公噸，獨佔世界的鰲頭，使臺灣贏得了草蝦王國的美譽 (薛月順, 2010)。除了草蝦之外，斑節蝦 (Marsupenaeus japonicas) 的年產量也高達一萬一 千多公噸，超越了日本。然而此盛況並未維持太久，1988 年因為白點症病毒 (white spot syndrome virus, WSSV) 與草蝦桿狀病毒 (Penaeus monodon baculovirus, MBV) 的肆虐而造成蝦子大量死亡後，重創了臺灣養蝦產業，使得產量大幅的下 降，也讓草蝦養殖業的盛況大不如前。白點症病毒自 1993 年開始擴散至世界各 地，包括東南亞、印尼、美洲、中東甚至是歐洲等地，估計全球損失達 80 至 150 億美金 (Lightner, 2012)。為了解決白點症病毒肆虐的問題，夏威夷海洋研究所於 1989 年建立無特定病源 (specific pathogen-free) 的白蝦 (Litopenaeus vannamei) 種 蝦庫，利用選殖的技術培育出生長快速且抗病毒能力強的白蝦品種 (Wyban et al., 1993)。因此臺灣地區的草蝦養殖戶自 1998 年起陸續開始飼養對環境適應力較 高、抗病力較佳且養殖成本較低的白蝦。根據漁業署漁業年報的統計資料指出，
在 2003 年時，白蝦年產量已經超過一萬公噸，年產值超過新台幣 16 億。相對 地，草蝦年產量則為一千七百多公噸，年產值低於 5 億，由此可見，白蝦在短短 的五年內已經取代草蝦，成為臺灣最主要的養殖蝦類。自白點症病毒爆發至今已 經超過二十年，但是目前仍無有效的方法來治療受白點症病毒感染的蝦子，僅能 以預防的策略來防止病毒入侵到養殖場內，因此白點症病毒在近年來逐漸地受到 各國的蝦養殖業者及科學家關注，希望能即早找出對抗它的策略。
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2.
白點症病毒 (White spot syndrome virus, WSSV)1990 年初期，白點症病毒首次爆發於中國大陸的福建省，並於同年的年底入
侵臺灣北部，重創了蝦養殖產業。隨後，白點症病毒隨著海水的流動而擴散至全 世界，包括東南亞、美洲、印度、中東及歐洲等地區 (Mohan et al., 1998; Wang et al., 2000; Stentiford and Lightner, 2011) 。 國 際 病 毒 分 類 委 員 會 (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) 根據白點症病毒獨特的型態及基因的特 色將其分類為 Nimaviridae 病毒科、Whispovirus 病毒屬 (Mayo, 2002a, 2002b; van Hulten et al., 2001)。白點症病毒的病毒顆粒之寬度介於 80 到 120 nm 之間，長度 介於 250 到 380 nm 之間，病毒結構由內至外分別為基因組 (genome)、核鞘 (nucleocapsid)、鞘間 (tegument) 以及外套膜 (envelope) (Leu et al., 2009)。白點症 病毒屬於大型 DNA 病毒，其基因組為環狀雙股 DNA，長度約 300 kbp。病毒基 因組的序列會因不同分離株而有所差異，但相似度仍高達 97%-99%，且 GC 所佔 的比例均為 41% (Chai et al., 2013)。目前有四種白點症病毒分離株被鑑定出來，
分別為中國株 (WSSV-CN; GenBank Accession AF332093) (Yang et al., 2001)、臺灣 株 (WSSV-TW; GenBank Accession AF440570) 、 韓 國 株 (WSSV-KR; GenBank Accession JX515788) (Chai et al., 2013) 以及泰國株 (WSSV-TH; GenBank Accession AF369029) (van Hulten et al., 2001)。先前有研究指出，白點症病毒的基因組具有 9 個由許多 200 至 300 bp 的重複序列所構成的同源區域，而這些同源區域在 DNA 的複製上可能扮演著重要的角色 (van Hulten et al., 2001)。病毒的核鞘呈桿狀或是 橢圓狀，其外側被外套膜包覆，並且具有一條尾狀構造 (Wongteerasupaya et al., 1995; Leu et al., 2009)。
白點症病毒的宿主範圍廣泛，可以感染許多甲殼類動物，目前被報導至少有
98 種宿主動物具有被白點症病毒感染的風險，例如：螃蟹、龍蝦、淡水長臂大蝦 等，但大部份的宿主扮演病毒帶原者的角色，不會因為感染病毒而立即死亡 (Stentiford et al., 2009; Lo et al., 1996)。白點症病毒對於對蝦類宿主能造成極高的 致死率，其中對於養殖蝦類所造成的致死率更可高達 100% (Wang et al., 1999)，
例如：白蝦、草蝦及斑節蝦等。而部分受白點症病毒感染的對蝦類宿主的甲殼上 會出現白色斑點，此特徵也為病毒名稱的由來，白點的形成是因鈣鹽在蝦體的表 皮層異常累積所形成 (Wang et al., 1995)。當宿主攝食受白點症病毒感染的動物的 組織或是暴露於含有白點症病毒的水域均會感染白點症病毒 (Pradeep et al., 2012;
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Lotz and Soto, 2002)，而白點症病毒主要會感染宿主的外胚層 (ecodermal) 及中胚 層 (mesodermal) 分化所形成的組織，例如：鰓、類淋巴器官、表皮上皮細胞、次 表皮結締組織等。受感染蝦隻體色會轉變至粉紅色或紅褐色並且會出現行動遲 緩、聚集在池邊的淺水處及食慾減退等症狀，最後導致蝦隻死亡 (Chiang and Lo, 1995; Kasornchandra et al., 1998)。
白點症病毒感染宿主的方式主要是屬於急性感染 (acute infection)，即病毒一 感染宿主後便走向溶裂期 (Li et al., 2013)，與 herpes simplex virus (HSV) 及 human immunodeficiency virus (HIV) 等具有潛伏期的病毒大不相同 (Cohrs and Gilden, 2001; Persaud et al., 2003)。當宿主受到病毒感染時，病毒會在短時間內大量複製 並破壞宿主細胞而使宿主死亡。另外，先前也有研究認為，白點症病毒能夠潛伏 在宿主體內 (Khadijah et al., 2003)，但是關於白點症病毒潛伏性感染的相關證據有 限，因此仍有待進一步的探討。由於節肢動物缺乏後天免疫系統，因此無法以施 打疫苗的方式誘導宿主產生後天免疫反應來對抗入侵的病原菌，因此至今仍然缺 乏有效的白點症病毒抑制藥物。而目前抑制白點症病毒基因表現的最有效機制為 RNA 干擾機制 (RNA interference, RNAi)，先前研究指出，透過肌肉注射的方式將 白點症病毒的結構蛋白質 VP28 之雙股 RNA 送入草蝦，能有效提高草蝦宿主之存 活率 (Sarathi et al., 2008)。另外，以 β-1,3-D-glucan 包裹 vp28-siRNAs 後，將包裹 後的 vp28-siRNAs 注射至受白點症病毒感染的日本對蝦 (Penaeus japonicas) 體內，
能夠有效的抑制白點症病毒的複製 (Zhu and Zhang, 2012)。本研究室也證實利用 RNAi 專一性地抑制草蝦 Krüppel-like factor (KLF) 基因以及白蝦 Ying Yang 1 (YY1) 基因的表現後，能有效的提高蝦宿主之存活率 (Chang et al., 2012; 黃庭儀, 2014)。除了 RNAi 之外，也有研究指出，以 peptidoglycans 餵食日本對蝦一段時 間後，會增強其體內白血球的吞噬作用而降低受白點症病毒感染的蝦隻的死亡率 (Itami et al., 1998)。而植物的萃取物也被發現具有對抗白點症病毒的潛力，例 如：若以狗牙根 (Cynodon dactylon) 或是角果木 (Ceriops tagal) 的萃取物餵食草蝦 會使其具有抗白點症病毒的活性 (Sudheer et al., 2011; Balasubramanian et al., 2008)。
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3.
白點症病毒的極早期基因當宿主受到白點症病毒感染時，病毒基因會隨著時間而階段性的表現極早期 基因 (immediate-early gene)、早期基因 (early gene) 與晚期基因 (late gene)，而許多 極早期基因所表現的極早期蛋白質通常具有轉錄因子的特性，能夠進一步的活化 病毒的早期及晚期基因的表現。白點症病毒目前被鑑定出具有 21 種極早期基因，
其中有 4 種極早期基因所表現出的蛋白質具有轉錄活性，分別為 wssv108、
wssv126 (ie1)、wssv136 與 wssv156 (Liu et al., 2005; Li et al., 2009; Lin et al., 2011)。
根據 NCBI 線上資料庫比對，wssv136 及 wssv156 皆具有 coiled-coil domain，其中
wssv136 具 有 C3HC4-type RING-finger ， 而 wssv156 則 具 有 TAZ zinc finger
(transcription adaptor putative zinc finger)，因此此兩者被認為有可能參與轉錄活性 的調控 (Li et al., 2009)。wssv150 及 wssv159 具有 transmembrane domain (Li et al., 2009)。wssv140 則具有 serine-threonine protein kinase domain (Li et al., 2009)。在所有的極早期基因之中，ie1 在宿主受感染時會大量的表現，同時也是被研 究最多的極早期基因。ie1 基因所表現的蛋白質 IE1 的 N 端具有轉錄調節活性，
而 C 端則具有 Cys2/His2-type zinc finger，與 DNA 的結合有關，IE1 蛋白質具有 調控轉錄活性的特性也在昆蟲細胞 Sf9 與哺乳動物細胞中被證實 (Liu et al., 2008)。
先前的研究指出，白蝦的 NF-κB 家族蛋白質 LvRelish 會結合於 ie1 啟動子上並活 化 ie1 基因的表現 (Huang et al., 2010b)。IE1 蛋白質也會與草蝦的 TATA-box binding protein (PmTBP) 蛋白質結合並強化 ie1 基因的表現，幫助病毒進行複製 (Liu et al., 2011)。另外有研究指出，兩種白蝦的 high mobility group box (HMGB) 蛋白質 LvHMGBa 與 LvHMGBb 會與 LvSTAT 及 LvDrosal 結合並活化 ie1 基因的 表現，而 STAT 與 Dorsal 蛋白質在白蝦的先天免疫功能中扮演著重要的角色，此 研究也說明了白點症病毒會挾持宿主的轉錄因子來活化自身基因的表現，並干擾 宿主的免疫功能 (Chen et al., 2011b; Huang et al., 2010b; Huang et al., 2010a; Wen et al., 2014)。本研究室先前的研究也指出白蝦及草蝦的 KLF 轉錄因子會活化極早期 基因 ie1 的表現，若以 dsRNA 專一性的抑制 KLF 基因表現後， ie1 基因的表現量 也會同時下降，並延遲蝦隻的死亡率 (Chang et al., 2012; Huang et al., 2014)。由於 目前對於另外 20 個白點症病毒極早期基因的相關研究較少，因此許多極早期基 因的功能特性尚未明瞭。
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wssv108 為本篇研究的目標極早期基因之一，先前研究以酵母菌 GAL4/UAS
系統證實了 WSSV108 蛋白質具有轉錄因子的特性，WSSV108 與 BadM/Rrf2 家族 轉錄因子有 25% 的序列相似性，而此家族的蛋白與細胞凋亡路徑的調控有關 (Li et al., 2009)。有研究也指出，白點症病毒的極早期蛋白質 WSSV108 會利用克氏 原螯蝦 (Procambarus clarkii) 的 small ubiquitin-like modifier (SUMO) 蛋白質進行轉 譯後修飾，而此修飾能促使 WSSV108 蛋白質躲過 ubiquitin-proteasome 的降解路 徑，以利白點症病毒於宿主細胞內進行複製 (Chen et al., 2013)。wssv108 基因的活 化也會受到宿主的 IKK-NF-κB 路徑所調控 (Wang et al., 2013a)。最新的研究指出，白蝦的 KLF 轉錄因子會活化 wssv108 基因的表現，並促進白點症病毒的複製 (Liu et al., 2015)。而本研究室先前的研究也發現 LvYY1 能夠活化 wssv108 啟動子的轉 錄活性 (蔡沛賜, 2015)。
wssv304 目前還未被證實具有轉錄因子的特性。目前已知 WSSV304 蛋白質具
有 RING-H2 domain，被報導可能具有 ubiquitin E3 ligase 的特性，對於白點症病 毒的致病力可能扮演著重要的角色 (Wang et al., 2005; He and Kwang, 2008)，不過 也有研究指出，中國對蝦 (Fenneropenaeus chinensis) 會透過體內的 ubiquitin- conjugating enzyme (Ubc E2) 泛素化修飾 WSSV304 蛋白質，抑制白點症病毒的複 製 (Chen et al., 2011a)。另外，本研究室先前的研究也指出，LvKLF 會活化wssv304 啟動子轉錄活性而影響白點症病毒的複製 (Huang et al., 2014)。
4. Ying Yang 1 (YY1) 轉錄因子
Ying Yang 1 (YY1) 廣泛地分布於生物體內，為一高度保守性的轉錄因子，在 不同情況下分別具有活化或抑制下游基因表現的能力，有研究指出，約有 7% 的 哺乳類動物基因會受到 YY1 的調控 (Schug et al., 2005; Hyde-DeRuyscher et al., 1995; Xi et al., 2007)。YY1 能結合於免疫球蛋白的 kappa 3’ enhancer 及 IgH enhancer 的 μE1 結合位上並調控其轉錄活性，因此又名 Nuclear factor E1 (NF-E1) (Park and Atchison, 1991)。另外，YY1 能結合於核醣體蛋白質 L32 的啟動子上的 delta 結合位並調控其轉錄活性，因此也稱為 delta (δ) (Hariharan et al., 1991)。YY1 的胺基酸序列 C 端具有四段 Cys2-His2-type 鋅手指 DNA 結合區，其中三段與 GLI 家族蛋白質有高度的相似性，另一段則與 Krüppel 家族蛋白質有高度相似性，因
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此被歸類為 GLI- Krüppel 家族蛋白質 (Shi et al., 1991)。人類的 YY1 開放譯讀區全 長為 1242 bp，編碼了 414 個胺基酸，預估的蛋白質大小約為 44 kDa，但是由於 本身結構的關係，進行 SDS-PAGE 電泳分析後，其分子量大小會座落於 68 kDa (Shi et al., 1997)。人類 YY1 蛋白質之胺基酸序列的 N 端為轉錄活性調節區，中間 片段具有與 histone acetyltrasnferase (HAT) 及 histone deacetylase (HDAC) 作用的區 域，其中第 170 至 200 的胺基酸位置被報導與轉錄活性的抑制有關，而接近 C 端 的片段則具有四段鋅手指 DNA 結合區域，並有研究指出其保守性結合序列為 5’- CCAT-3’/3’-ATGG -5’ (Atchison, 2014; Bushmeyer et al., 1995; Yang et al., 1996;
Kim and Kim, 2009)。
YY1 在許多生理功能的調控上扮演著重要的角色，例如：細胞分化、細胞生 長、胚胎發育、細胞凋亡、神經退化相關疾病等 (Affar el et al., 2006; Gordon et al., 2006; Momoeda et al., 1994; Karki et al., 2014)。YY1 除了具有 transcriptional activator 及 repressor 的角色外，也具有 initiator 的功能，能在 TATA-less 的啟動子 中替代 TBP，與 TFIIB 及 RNA polymerase II 結合後活化目標基因的轉錄活性 (Usheva and Shenk, 1996)。YY1 與細胞的癌化也有很大的關係，有研究指出，人 類 YY1 蛋白質能與 NF-κB 次單元體 p65 (RelA) 形成複合體而刺激多發性骨髓瘤 (multiple myeloma, MM) 的增生 (Potluri et al., 2013)。YY1 也會干擾腫瘤抑制蛋白 質 p53 與 p300 蛋白質之間的作用，使 p53 失去活性而破壞細胞週期的檢查機制，
導致細胞癌化 (Sui et al., 2004)。另外，YY1 也會促使胃癌細胞中的腫瘤抑制相關 蛋白 ANXA6 啟動子持續性地維持甲基化的狀態而無法抑制癌細胞的增生 (Wang et al., 2013b)。而在巴克氏淋巴瘤 (Burkitt’s lymphoma) 中，YY1 會活化 c-Myc 啟 動子的轉錄活性，促進癌細胞的增生 (Riggs et al., 1993)。
YY1 除了在宿主體內扮演重要的角色外，對於病毒基因表現的調控也有莫大 的影響。有研究指出，YY1 能夠結合於 adeno-associated virus (AAV) type-2 的極 早期基因 P5 啟動子上，抑制病毒基因的表現，使 AAV 在宿主細胞中維持潛伏的 狀態，當細胞再次受到輔助病毒 (helper virus) 感染時，輔助病毒所表現的 E1A 蛋 白質會與 YY1 結合，將 YY1 轉變為活化的特性，進而活化 P5 啟動子並促進早期 及晚期基因的表現，使 AAV 進入溶裂期 (Shi et al., 1991)。另外，YY1 也會抑制 人類乳突病毒 (human papillomavirus, HPV) type-16 的 E6 及 E7 兩個早期基因的表 現，並進一步的抑制子宮頸癌的形成 (Dong et al., 1994; May et al., 1994)。最近的
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研究指出，YY1 能活化水痘帶狀皰疹病毒 (varicella-zoster virus, VZV) 極早期基因 IE62 啟動子的轉錄活性，促進病毒的複製 (Khalil et al., 2014)。本研究室先前的研 究發現，白蝦的 YY1 轉錄因子會結合於白點症病毒極早期基因 ie1 及 wssv108 啟 動子上的 YY1 結合位，活化基因的表現 (黃庭儀, 2014; 蔡沛賜, 2015)。
5. NF-κB 家族轉錄因子
1986 年，David Baltimore 等人於 B 細胞中發現某一轉錄因子具有調控免疫球 蛋白 kappa light chain 基因表現的活性，遂將其命名為 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) (Sen and Baltimore, 1986; Singh et al., 1986)。NF-κB 廣泛地分佈於生物體中，參與了許多生物體的生理及病理反應，例 如：發炎反應、細胞凋亡、細胞分化、先天免疫反應與癌變等 (Ghosh et al., 1998;
Hayden and Ghosh, 2008)。在哺乳類動物中，NF-κB 家族轉錄因子是由不同的次 單元體 (subunits) 所構成的同源二聚體 (homodimer) 與異源二聚體 (heterodimer)。
NF-κB 家族成員包括 p50/p105 (NF-κB1)、p52/p100 (NF-κB2)、 p65 (RelA)、RelB 及 c-Rel (Pasparakis, 2009)。所有的 NF-κB 家族蛋白質在其 N 端具有保守性的 Rel homology domain (RHD)，與目標 DNA 及 IκB 蛋白質的結合有關，同時也影響了 二聚體的形成 (dimerization)，而 RelA、RelB 及 c-Rel 蛋白質之 C 端具有非保守性 的轉錄活化調控區 (Hayden and Ghosh, 2004)。有研究指出，p50 及 p52 能與 RelA、
RelB 或是 c-Rel 形成具有轉錄活化能力的異源二聚體 (Pereira and Oakley, 2008)。
不同的 NF-κB 家族轉錄因子在細胞中所佔的比例會隨著細胞種類的不同而有所差 異，人類細胞中具有活性的 NF-κB 主要是由 p50 及 RelA 所組成的異源二聚體，
而 p50/RelA 幾乎 存 在於所有 細胞中 ， 其中 RelA 具有 活 化基因表 現的能力 (Hoffmann et al., 2006)。在細胞未受到刺激時，p105、p100 或是 IκB 蛋白質會透 過 ankyrin repeat domain 與 NF-κB 蛋白質結合而形成複合體後，使 NF-κB 蛋白質 無法進入細胞核中活化目標基因，當細胞受到病毒感染、壓力與發炎反應相關細 胞激素刺激時，IκB 激酶 (IκB kinase, IKK) 會將 IκB 蛋白質進行磷酸化修飾，而被 磷酸化修飾後的 IκB 蛋白質會再經泛素化 (ubiquitination) 修飾後被 26S 蛋白酶體 (26S proteasome) 降解，此時 NF-κB 會進入細胞核中活化目標基因 (Gilmore, 1999)。
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果蠅 (Drosophila melanogaster) 中的 Dorsal 轉錄因子為哺乳類動物 NF-κB 家 族轉錄因子 RelA 的同源蛋白質，最初被認為與胚胎的分化、形成有關 (Steward, 1987; Steward et al., 1984)，後來研究顯示 Dorsal 蛋白質在果蠅的先天免疫反應中 扮演著相當重要的角色 (Reichhart et al., 1993)。先前的研究陸續地發現了與免疫 相關的兩個 NF-κB 家族的轉錄因子，分別為 Relish 及 Dorsal-related immunity factor (Dif) (Ip et al., 1993; Dushay et al., 1996)。Dorsal 的活化路徑與哺乳類動物 NF-κB 類似，細胞在正常情況下時，Dorsal 及 Dif 會與果蠅中的類 IκB 蛋白質 Cactus 結合而形成複合體，以去活化的型態存在於細胞質中，當細胞受到真菌 (Fungi) 或革蘭氏陽性菌 (Gram-positive bacteria) 感染時，細胞會透過 Toll/NF-κB 路徑活化 Dorsal 及 Dif，使其進入細胞核中活化抗菌相關基因的表現，例如：
Drosomycin、Metchnikowin 及 Defensin 等 (Lemaitre and Hoffmann, 2007; Whalen and Steward, 1993; Belvin et al., 1995)。
相較於人類及昆蟲，蝦子對抗病原菌的防禦機制尚未明瞭，仍然需要進一步 的 探討 。目前已 知，白蝦 也具有果 蠅 Dorsal 的同源基因，因此將其命名為
Litopenaeus vannamei Dorsal (LvDorsal)，LvDorsal 廣泛地分布於白蝦組織內，其
開放譯讀區全長為 1203 bp，編碼 400 個胺基酸 (Huang et al., 2010a)。 先前研究指 出，白點症病毒會挾持受感染之白蝦的 LvDorsal 及 LvRelish 蛋白質，協助病毒基 因的複製 (Qiu et al., 2014)。LvDorsal 也會活化白蝦 C 型凝集素 (C-type lectin) 基 因的表現，強化白蝦的抗菌及抗病毒反應 (Li et al., 2014)。最新的研究指出，白 蝦的 microRNA (miR-1959) 會以正回饋的方式調控白蝦的 NF-κB 路徑。miR-1959 會結合於 LvCactus 的 3’-UTR 而抑制 LvCactus 蛋白質的表現，促進 LvDorsal 的活 化，當 LvDorsal 進入細胞核後會結合於 miR-1959 的啟動子並促使其基因的表現 而形成正回饋的路徑，使 LvDorsal 能持續地活化許多下游抗菌相關的基因的表 現，幫助宿主對抗病原菌 (Zuo et al., 2016)。而本篇研究發現，LvYY1 能與白蝦 中人類的 NF-κB 同源蛋白質 LvDorsal 協同調控白點症病毒的極早期基因 ie1、wssv108 及 wssv304，因此探討 LvYY1 與 LvDorsal 對於病毒極早期基因的調控機
轉將有助於了解白點症病毒的複製。doi:10.6342/NTU201600589 9
第二章 材料與方法
1.
實驗菌種與細胞株實驗所使用的大腸桿菌 (Escherichia coli, E. coli) 主要為 EPI-300 和 BL21(DE3) 兩種菌株。將菌株接種於 Luria-Bertani (LB) 培養液 (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.2) 之中，並於 37°C 培養箱中震盪培養隔夜，之後進行質體 DNA 的萃取或是蛋白質的誘導表現。EPI-300 主要用於質體的建構，BL21 則用來 表現異源蛋白質。細胞實驗所使用的細胞株為秋夜盜蛾 (Spodoptera frugiperda, Sf9) 細胞株，培養於含有 10% 胎牛血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 培養液，並 於 27°C 培養箱培養。
2.
質體 DNA 萃取根據 PrestoTM Mini Plasmid Kit (Geneaid) 的說明書操作。
3.
質體建構本研究室先前根據 RACE 的結果得知了 LvYY1 的 cDNA 片段，根據 cDNA 片段設計出了 LvYY1-F (表 1) 及 LvYY1-R (表 1) 引子，以 PCR 的方式擴增出了 LvYY1 基因的開放譯讀區 (Open Reading Frame, ORF) 的片段，將擴增出來的片段 以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位接入 pDHsp-Flag-His、pDHsp-V5-His 及 pDHsp- EGFP-V5-His 質體中 (Liu et al., 2007)，因此分別將質體命名為 pDHsp-LvYY1- Flag-His、pDHsp-LvYY1-V5-His 及 pDHsp-EGFP-LvYY1-V5-His，而這三個質體 用於昆蟲細胞中表現 LvYY1 重組蛋白質。以 LvYY1-F (表 1) 及 LvYY1-R (表 1) 引子擴增 LvYY1 基因的開放譯讀區序列後，以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位接入 pGEX-4T-1 表現載體 (GE Healthcare) 中，並命名為 GST-LvYY1，此質體用於 E.
coli BL21(DE3) 中表現 LvYY1 重組蛋白質。另外，根據 LvDorsal 的 DNA 序列分
別設計出 LvDorsal-BamHI-F (表 1)、LvDorsal-EcoRI-R (表 1) 及 LvDorsal-EcoRI- GFP-R (表 1) 的引子序列，以 PCR 的方式擴增出 LvDorsal 基因的開放譯讀區後，doi:10.6342/NTU201600589 10
將擴增出來的片段以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位分別接入 pDHsp-V5-His 及 pDHsp-EGFP-V5-His 質體中，並分別將質體命名為 pDHsp-LvDorsal-V5-His 及 pDHsp-LvDorsal-GFP，此兩質體用於昆蟲細胞中表現 LvDorsal 重組蛋白質。以 LvDorsal-BamHI-F (表 1) 及 LvDorsal-EcoRI-R (表 1) 引子擴增 LvDorsal 基因的開 放譯讀區後以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位接入 pET28a (+) 表現載體 (Novagen) 中，
並命名為 pET28a-LvDorsal，此質體用於 E. coli BL21(DE3) 中表現 LvDorsal 重組 蛋白質。冷光報導分析所使用的白點症病毒極早期基因的報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368) 、 pGL3-wssv108 (-102/+368) 、 pGL3-wssv108 (-72/+368) 及 pGL3-
wssv108 (-52/+368) 為將不同長度的 wssv108 啟動子片段以 NheI/XhoI 的限制酶切
位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中 (蔡沛賜, 2015) (表 1)；報導質體 pGL3-wssv304 (-418/+82)、pGL3-wssv304 (-93/+82)、pGL3-wssv304 (-36/+82) 及 pGL3- wssv304 (-25/+10) 為將不同長度的 wssv304 啟動子片段以 SmaI/HindIII 的限制酶切
位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中 (表 1)；pGL3-ie1 (-268/+52) 報導質體由劉宛 菁博士提供 (Liu et al., 2007)，pGL3-ie1 (-44/+52) 及 pGL3-ie1 (-31/+10) 為將不同 長度的 ie1 啟動子片段以 XhoI/HindIII 限制酶切位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中，而 pGL3-ie1 (-94/+52) 則是以 BamHI/HindIII 限制酶切位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中 (表 1)。冷光報導分析所使用的 pIB-LvYY1 及 pIB-LvDorsal 為分別 將 PCR 擴增出來的 LvYY1 及 LvDorsal 基因的開放譯讀區序列以 BamHI/EcoRI 的 限制酶切位接入 pIB/V5-His 表現載體 (Invitrogen) 中 (表 1)；pIB-LvCactus 為將 PCR 擴增出來的 LvCactus 基因的開放譯讀區序列以 BamHI/NotI 的限制酶切位接 入 pIB/V5-His 表現載體 (Invitrogen) 中 (表 1)。4.
勝任細胞的製備將 E. coli 接種於 5 mL 的 LB 培養液中，於 37°C 培養箱震盪培養 14-16 小時 後，取出 500 μL 菌液並接種至 50 mL 的新鮮 LB 培養液中，於 37°C 震盪培養至 細菌濃度 OD600 值達到 0.3 至 0.4 時，將菌液置於冰上作用 10 分鐘使細菌停止生 長，接著將菌液轉移至 50 mL 離心管，於4°C 以 3000 rpm 離心 10 分鐘將細菌沉 澱並去除上清液。加入 10 mL 的 transformation buffer (10 mM MOPS, 85 mM CaCl2, 27 mM D-glucose, 15% glycerol, 2 mM NaOH, pH 6.3) 回溶菌體，於冰上作
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用 10 分鐘後，於 4°C 以 3000 rpm 離心 10 分鐘。去除上清液後加入 2 mL 的 transformation buffer 回溶菌體，再分別取 100 μL 菌液分裝於 1.5 mL 微量離心管 中，最後保存於 -80°C 冰箱以供日後實驗使用。
5.
細胞轉型將限制酶處理過後的目標 DNA 與載體以 8：1 的比例於室溫進行連接反應 (ligation)，反應 15 分鐘後將連接完成的質體 DNA 加入解凍後的勝任細胞，並於 冰上靜置反應 20 分鐘，以 42°C heat shock 作用 90 秒後迅速置於冰上冷卻 30 秒，
再加入 500 μL LB 培養液並於 37°C 培養箱靜置培養 30 分鐘，最後取 200 μL 菌液 塗盤後於 37°C 培養箱靜置培養 14-16 小時。
6.
細胞轉染要進行細胞核蛋白質萃取時，將 9x105個 Sf9 昆蟲細胞種入 6-well 的細胞培 養盤中並等待細胞貼附 1 小時。將 3 μg 質體 DNA、6 μL 的 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen) 與不含胎牛血清及抗生素的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 培養液均勻混 合後，於 27°C 培養箱靜置反應 30 分鐘，之後將培養盤上含血清之 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 置換成不含血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen)，然後將反應後的混合液 加入已附著在培養盤上的細胞中並輕輕地搖晃細胞培養盤，使其混合均勻，最後 置於 27°C 培養箱培養 48-72 小時，其中約每 24 小時以 42°C heat shock 作用 20 分 鐘，約 2 至 3 次，最後將細胞收集後進行核蛋白質的萃取。
若是要進行冷光報導分析時，則將 2x105個 Sf9 昆蟲細胞種入 24-well 的細胞 培養盤中並等待細胞貼附 1 小時。將質體 DNA (800 ng 的調控子與 100 ng 的報導 載體) 、0.9 μL 的 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen) 與不含血清及抗生素的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 均勻混合後，於 27°C 靜置反應 30 分鐘，之後將培養盤上含血 清之 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 置換成不含血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen)，並 將反應後的混合液加入已附著在培養盤上的細胞中並輕輕地搖晃細胞培養盤，使 其混合均勻，最後置於 27°C 培養箱培養 42 小時，之後進行冷光報導分析。
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7.
細胞核蛋白質萃取將培養於 6-well 細胞培養盤中的 Sf9 昆蟲細胞以 pipet 沖洗、收集至 15 mL 離心管，再以 2 mL PBS (phosphate-buffered saline) 沖洗 2 次，以 1200 rpm 於室溫 離心 5 分鐘之後將上清液移除，加入 1 mL PBS 回溶細胞並轉移至 1.5 mL 微量離 心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘之後將上清液移除，加入 400 μL Buffer A [10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 10 μg/mL serine protease inhibitor 4-(2- aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF) /Leupeptin (LEU), 1 mM DTT, pH 7.9] 懸浮細胞，置於冰上反應 15 分鐘將細胞脹破，加入 25 μL 10% NP- 40 打破細胞膜並以振盪器輕輕地震盪 10 秒後，於冰上靜置反應一分鐘，之後以 2000 rpm 於 4°C 離心 15 分鐘，將上清液收集並分裝至 1.5 mL 微量離心管，此部 分的上清液為細胞質液。最後將沉澱物以 50 μL Buffer B [20 mM HEPES, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μg/mL serine protease inhibitor AEBSF/LEU, 1 mM DTT, pH 7.9] 懸浮並打破細胞核，再以 12000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘後，所得上清液部分 即為核萃取物，以 10 μL 為單位分裝於 1.5 mL 微量離心管，保存於 -80°C 冰箱以 供日後實驗使用。
8.
冷光報導活性分析 (Luciferase reporter assay)將 Sf9 細胞種於 24-well 細胞培養盤，之後將白點症病毒極早期基因啟動子的 報導質體以及含有 LvYY1 及 LvDorsal 基因的表現質體轉染至細胞後於 27°C 培養 箱培養 42 小時。移除上清培養液後加入 200 μL lysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100)，搖晃反應 10 分 鐘將打破細胞，反應完後取 50 μL 上清液至冷光分析盤中並加入 50 μL 的冷光受 質液 (20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2‧5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270 mM coenzyme A, 470 mM luciferin, 530 mM ATP)，
輕輕地搖晃使上清液與冷光受質液反應完全後放入冷光分析儀 (Orion II, Berthod, Bad Wildbad, Germany) 並測量冷光酵素活性數值 (Chang et al., 1998)。
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9.
蛋白質的表現誘導將質體 pGEX-LvYY1 或 pET28a-LvDorsal 轉型到 E. coli BL21(DE3) 後，分別 接種於 5 mL 的 LB 培養液中，於 37°C 培養箱震盪培養 14-16 小時，將菌液稀釋 25 倍後接種至新鮮的 LB 培養液中，於 37°C 震盪培養 2 小時後，加入 10 μL 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 並於 25°C 震盪培養 5 小時以誘導 蛋白質表現。將細菌離心收集後保存於 -80°C 冰箱，以供日後實驗使用。
10. 西方點墨法 (Western blotting)
將表現重組蛋白質的 Sf9 昆蟲細胞或 E. coli BL21(DE3) 離心、收集後，以 mRIPA buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5%
TritonX-100, 10 μg/mL serine protease inhibitor AEBSF/LEU, 1 mM DTT, pH 7.8) 回 溶，於冰上靜置反應 10 分鐘，以超音波震盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 以 1 秒震動，2 秒休息為一循環於冰上打破細胞後，以 12000 rpm 於 4°C 離心 10 分鐘，再將上清液轉移至新的 1.5 mL 微量離心管並加入三分之一體 積之 4X sample buffer (40% glycerol, 240 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% SDS, 0.04%
bromophenol blue, 8% β-mercaptoethanol)，接著以 95°C 加熱處理 5 分鐘使蛋白質 變性。將樣品注入 10% 聚丙烯醯胺膠體後以 168 V 電壓進行 SDS-PAGE 電泳，
當電泳完成後將膠片取下，以轉印溶液 (25 mM Tris-base, 183 mM glycine, 20%
methanol) 於 4°C 以 94 V 電壓 轉 印 1 小時 ， 將 蛋 白 質 轉 印 到 nitrocellulose membrane (Merck Millipore) 上。轉印完成後，將轉印膜以含有 5% 脫脂奶粉 (安 佳脫脂奶粉) 的 TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) 於 室溫 blocking 20 分鐘，將一級抗體以適量比例稀釋於含有 5% 脫脂奶粉的 TBST 中，並與轉印膜於室溫反應 1 小時，使抗體能結合於目標蛋白質上，之後以 TBST 清洗轉印模 3 次，每次 3 分鐘，清洗完畢後加入二級抗體，並與轉印膜於 室溫反應 30 分鐘使其辨識一級抗體，再以 TBST 清洗 3 次，每次 3 分鐘，之後加 入 1 mL Chemiluminescent substrate (Pierce) 搖晃反應 3 分鐘使二級抗體上的 HRP 與受質液作用並發出冷光，最後以 X 光底片顯影的方式偵測結果。
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11. 電泳泳動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)
EMSA 的實驗步驟是根據 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo) 的 流程進行操作。為了探討 LvYY1 與 LvDorsal 是否能夠結合於 wssv304 核心啟動 子上，以表現 LvYY1-Flag 及 LvDorsal-V5 的 Sf9 昆蟲細胞核萃取物作為實驗用的 蛋白質，合成白點症病毒極早期基因 wssv304 啟動子之 TATA box 前後共 40-mer 的探針 (probe) 並於 5’ 端點標記 biotin。實驗預先混合 EMSA 反應溶液 (10X Binding buffer：100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT, pH 7.5、Poly (dIdC)：0.1 μg/μL in 10 mM Tris, 1% NP-40, 1 mM EDTA, pH 7.5) 與 0.5 μL 20 fmol/μL 探針，
之後依照實驗組別加入 Sf9 核萃取蛋白質與抗體，以 ddH2O 將反應總體積補至 20 μL，並於室溫反應 40 分鐘，之後加入 4 μL 6X Loading Dye，接著將樣品注入 6%
原態聚丙烯醯胺膠體，以 94 V 電壓進行電泳。電泳完成後將膠片取下，以轉印溶 液 (25 mM Tris-base, 183 mM glycine, 20% methanol) 於 4°C 以 94 V 電壓轉印 1 小 時，將蛋白質與 DNA 所形成的複合體轉印到 Nylon 膜 (Amersham HybondTM-N+, GE Healthcare) 上。轉印完成後將 Nylon 膜靜置於擦手紙上，待其略乾後放入 UV-linker (BLX-E254, VILBER LOURMAT)，以 120 J 能量照射 2 次以固定 Nylon 膜上的蛋白質、DNA 複合體。之後將 Nylon 膜以 blocking buffer 於室溫 blocking 20 分 鐘 ， 再 將 稀 釋 於 blocking buffer 的 Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 與 Nylon 膜於室溫反應 30 分鐘，使其能與探針 5’ 端點的 biotin 結合。之後以 wash buffer 清洗 Nylon 膜 3 次，每次 5 分鐘，去除殘留的 Conjugate，將 wash buffer 倒掉後加入 Substrate Equilibration Buffer 以平衡 Nylon 膜的 pH 值，於室溫搖晃反應 1 分鐘後，倒掉 buffer 並加入 1.5 mL Substrate Working Solution 搖晃反應 3 分鐘使受質液與 HRP 作用而激發冷光，最後以 X 光 底片顯影的方式偵測結果。另外，在競爭實驗中所使用的未標定 biotin 探針之濃 度為 biotin 探針的 100 倍，而實驗所使用的競爭者序列有：未標記 biotin 的探針 序列 wssv304 (-30/+10)、YY1 consensus 結合位序列 (Consensus)、STAT 結合位序 列 (STAT) 與 wssv304 (-30/+10) 突變序列 (Mutation) 。除此之外，實驗中也使用 抗 LvYY1 抗體 (黃庭儀, 2014)、抗 V5 抗體 (Enogene) 以及抗 TBP 抗體 (Sigma- Aldrich) 抗體進行 supershift assay，進一步確定 DNA 與蛋白質複合體為目標蛋白 質。
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12. GST-pull down
將誘導蛋白質表現後的 E. coli BL21(DE3) 轉移至 50 mL 的離心管，以 3000 rpm 於 4°C 離心 10 分鐘，將細菌沉澱下來，移除上清液後加入 300 μL NETN buffer (0.02 M Tris, pH 8.0, 0.1 N NaCl, 0.01 M EDTA, 0.5% IGEPAL, 10 μg/mL serine protease inhibitor AEBSF/LEU, Lysozyme) 回溶細菌，於冰上反應 10 分鐘，
再以超音波震盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 以 1 秒震動，2 秒休息為 一循環於冰上打破細菌後，以 12000 rpm 於 4oC 離心 10 分鐘後取出上清備用。經 前述處理後將表現有 GST-LvYY1 蛋白質之樣品分別與 pET32a (+) 蛋白質、
pET28a-LvDorsal 蛋 白 質 以 及 30 μL Glutathione SepharoseTM 4B 膠 體 (GE Healthcare) 混合，於 4oC 作用 2 小時後，以 8000 rpm 於 4°C 離心 1 分鐘將膠體沉 澱下來，移除上清液後加入 650 μL NETN buffer 清洗膠體 ，重複此步驟 3 次，加 入 30 μL NETN buffer 及 10 μL 的 4X sample buffer，接著以 95°C 加熱處理 5 分鐘 將蛋白質變性，最後以西方點墨法偵測蛋白質的結合。
13. 免疫共沉澱法 (Co-immunoprecipitation, Co-IP)
將表現質體轉染至 Sf9 細胞中表現，每 24 小時以 42°C heat shock 20 分鐘以 誘導蛋白質表現，轉染 72 小時後將細胞以 pipet 沖洗、收集至 15 mL 離心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘使細胞沉澱下來，加入 1 mL PBS 懸浮細胞並轉移到 新的 1.5 mL 微量離心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘使細胞沉澱下來，移除 上清液後加入 300 μL lysis buffer (PBS, 0.01% IGEPAL, 10 μg/mL serine protease inhibitor AEBSF/LEU) 回溶細菌，於冰上反應 10 分鐘，再以超音波震盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 於冰上震動 15 秒打破細胞，以 12000 rpm 於 4oC 離 心 10 分鐘後取出上清備用。經前述處理後將表現有 pDHsp-LvYY1-Flag-His 蛋白 質之樣品分別與 pDHsp-EGFP-V5-His 蛋白質、pDHsp-LvDorsal-GFP 蛋白質及 30 μL ANTI-FLAG® M2 Affinity 膠體 (Sigma-Aldrich) 混合，於 4oC 作用 2 小時後，
以 8000 rpm 於 4°C 離心 1 分鐘將膠體沉澱下來，移除上清液後加入 650 μL lysis buffer 清洗膠體，重複此步驟 3 次，加入 30 μL lysis buffer 及 10 μL 的 4X sample buffer，接著以 95°C 加熱處理 5 分鐘將蛋白質變性，最後以西方點墨法偵測蛋白 質的結合。
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14. DNA 親和性沉澱分析 (DNA affinity precipitation assay, DAPA)
將表現質體轉染至 Sf9 細胞中表現，每 24 小時以 42°C heat shock 20 分鐘以 誘導蛋白質表現，轉染 72 小時後將細胞以 pipet 沖洗、收集至 15 mL 離心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘使細胞沉澱下來，加入 1 mL PBS 懸浮細胞並轉移到 新的 1.5 mL 微量離心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘使細胞沉澱下來，移除 上清液後加入 300 μL lysis buffer 回溶細菌，於冰上反應 10 分鐘，再以超音波震 盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 震動 15 秒於冰上打破細胞，以 12000 rpm 於 4oC 離心 10 分鐘後取出上清備用。將 EMSA 實驗中所使用的 biotin 探針與 Streptavidin 膠體 (Sigma-Aldrich) 於 4°C 反應 1 小時後，以 DAPA binding buffer (60 mM KCl、12 mM HEPES, pH 7.9、4 mM Tris-base, pH 8.0、5% Glycerol、0.5 mM EDTA 及 1 mM DTT) 清 洗 1 次 。 將 細 胞 溶 裂 液 加 入 與 探 針 作 用 後 的 Streptavidin 膠體混合，於 4°C 作用 2 小時後，以 8000 rpm 於 4°C 離心 1 分鐘將膠 體沉澱下來，移除上清液後加入 650 μL DAPA binding buffer 清洗膠體 3 次，加入 30 μL DAPA binding buffer 及 10 μL 4X sample buffer，經 95°C 加熱處理 5 分鐘將 蛋白質變性，並以西方點墨法分析。
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第三章 結果
1. LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv108 啟動子
根據本研究室先前研究指出，LvYY1 會結合於 wssv108 啟動子上 9-mer 序列 p(-91/-83) 並調控 wssv108 啟動子的轉錄活性 (蔡沛賜, 2015)。為了測試其他的轉 錄因子是否也會參與 LvYY1 調控 wssv108 啟動子轉錄活性的路徑，因此以冷光活 性分析偵測其他的白蝦轉錄因子是否會影響 LvYY1 對於 wssv108 啟動子的活化現 象。將報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368) 分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB- LvDorsal、pIB-LvCactus 或對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果 顯示，過量表現 LvYY1 蛋白質會活化 wssv108 啟動子的轉錄活性至 10.39 倍 (圖 1B)，但過量表現 LvDorsal 蛋白質則不活化 wssv108 啟動子的轉錄活性 (圖 1B)。
LvCactus 為哺乳類動物 IκB 的同源蛋白質，過量 表現 LvCactus 也不會活化
wssv108 啟動子的轉錄活性 (圖 1B)。有趣的是，當過量表現 LvYY1 與 LvDorsal
蛋白質則會強烈的活化 wssv108 啟動子的轉錄活性 (圖 1B)。因此本實驗發現 LvYY1 與 LvDorsal 會協同調控白點症病毒極早期基因 wssv108 的表現。2. LvYY1 會與 LvDorsal 在細胞內結合
為了進一步了解 LvYY1 與 LvDorsal 協同活化 wssv108 啟動子的現象是否與 兩個轉錄因子之間的結合有關，因此以免疫共沉澱法進行分析。將表現質體 pDHsp-LvYY1-Flag-His 分別與 pDHsp-EGFP-V5-His 或 pDHsp-LvDorsal-GFP 轉染 至 Sf9 昆蟲細胞，培養 72 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沉澱，
並以抗 GFP 抗體進行西方點墨偵測與 LvYY1 共同結合的蛋白質。結果顯示，在 同時轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 與 pDHsp-LvDorsal-GFP 的組別中，可以偵測到 LvYY1 與 LvDorsal 的結合 (圖 2, IP, lane 4)。而在同時轉染 pDHsp-LvYY1-Flag- His 與 pDHsp-EGFP-V5-His 的組別中則無法偵測到 GFP 蛋白質 (圖 2, IP, lane 3)。
此結果證實了 LvYY1 與 LvDorsal 能於細胞中結合。
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3. LvYY1 與 LvDorsal 在細胞體外直接結合
已知 LvYY1 能與 LvDorsal 在細胞內形成複合體，因此本研究進一步以細菌 表現的蛋白質進行 GST-pull down 分析，探討 LvYY1 與 LvDorsal 在細胞體外是 否也會結合。首先，將 E. coli BL21(DE3)(GST-LvYY1) 之細菌溶裂液分成兩份，
各自加入新的 1.5 mL 微量離心管中，並分別加入 glutathione-Sepharose agarose，
接著分別加入含有 His-LvDorsal 或 His 的細菌溶裂液，然後以抗 His 抗體進行西 方點墨法分析。結果顯示，GST-LvYY1 能與 pET28a-LvDorsal 結合 (圖 3, lane 5)，而對照組的蛋白質則無法與 GST-LvYY1 結合 (圖 3, lane 4)。因此 LvYY1 與 LvDorsal 會直接結合。
4.
縮減 wssv108 啟動子片段對於 LvYY1 與 LvDorsal 協同效應之影響得知了 LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv108 啟動子轉錄活性之後，為了 了解協同效應是否與 wssv108 啟動子上的 YY1 結合位有關，因此進一步的將
wssv108 啟動子片段 p(-132/+368) 進行縮減或是將啟動子上 9-mer 的 YY1 結合序
列進行點突變後，以冷光活性分析偵測 LvYY1 與 LvDorsal 是否會影響啟動子的 轉錄活性。將報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368)、pGL3-wssv108 (-102/+368)、pGL3-wssv108 (-72/+368)、pGL3-wssv108 (-52/+368) 或 pGL3-wssv108 (-91/-83)- YY1 mut 分別與表現質體 pIB-LvYY1、 pIB-LvDorsal 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果顯示，不論是將 9-mer 的 YY1 結合序列移除、進行 點突變或是將 wssv108 啟動子片段縮減至核心啟動子片段的長度後，LvYY1 與 LvDorsal 仍然可以協同活化 wssv108 啟動子之轉錄活性 (圖 4)。因此初步推測 LvYY1 與 LvDorsal 是透過結合於 wssv108 核心啟動子片段 p(-52/+368) 而協同調 控 wssv108 啟動子的轉錄活性。
5. LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv304 的核心啟動子
為了了解 LvYY1 及 LvDorsal 的協同效應與白點症病毒極早期基因核心啟動 子之間的關係，因此將白點症病毒極早期基因 wssv304 的啟動子片段進行縮減 後，以冷光活性分析偵測 LvYY1 與 LvDorsal 是否會調控啟動子的轉錄活性。將
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報導質體 pGL3-wssv304 (-418/+82)、pGL3-wssv304 (-93/+82)、pGL3-wssv304 (- 36/+82) 及 pGL3-wssv304 (-25/+10) 分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及 對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果顯示，LvYY1 與 LvDorsal 並不會協同活化 wssv304 全長啟動子的轉錄活性 (圖 5B)，但是將 wssv304 啟動子 片段縮減至核心啟動子之長度時，LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv304 核心啟 動子的轉錄活性至 50 倍左右 (圖 5B)。
6. LvYY1 與 LvDorsal 對 ie1 的核心啟動子的協同活化
為了進一步地確認 LvYY1 與 LvDorsal 協同活化白點症病毒極早期基因之現 象與核心啟動子有關，同樣地將 ie1 的啟動子片段進行縮減後，以冷光活性分析 偵測 LvYY1 與 LvDorsal 是否會調控啟動子的轉錄活性。將報導質體 pGL3-ie1 (- 268/+52)、pGL3-ie1 (-94/+52)、pGL3-ie1 (-44/+52) 及 pGL3-ie1 (-31/+10) 分別與表 現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細 胞。 結 果 顯示， 將 ie1 啟動子片段縮 減 至核心啟 動子之長 度時， LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 ie1 核心啟動子的轉錄活性 (圖 6B)，與 wssv108 (圖 4) 及
wssv304 (圖 5) 的結果相同。另外，進一步的比較 LvYY1 與 LvDorsal 對於 wssv304 及 ie1 的原長及核心啟動子轉錄活性的影響，將報導質體 pGL3-wssv304
(-418/+82)、pGL3-wssv304 (-36/+82)、pGL3-ie1 (-268/+52) 及 pGL3-ie1 (-44/+52) 分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果也進一步的證實 LvYY1 與 LvDorsal 會協同調控白點症病毒極 早期基因的核心啟動子的轉錄活性 (圖 7B)。綜合上述實驗結果可以得知，LvYY1 與 LvDorsal 協同活化白點症病毒極早期基因之現象可能與啟動子的基礎轉錄 (basal transcription) 機制有關。7. LvYY1 與 PmTBP 在細胞內結合
由上述的實驗結果確認 LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv304 及 ie1 的核心 啟動子的轉錄活性，這也說明了 LvYY1 與 LvDorsal 參與了 ie1 及 wssv304 啟動子 的基礎轉錄。而先前有研究指出，YY1 具有結合基礎轉錄因子的特性，像是
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TBP、TAFs 及 TFIIB 等來調控啟動子的轉錄活性 (Nguyen et al., 2004; Weis and Reinberg, 1997)，因此想進一步的探討 LvYY1 是否能夠與起始前複合體 (pre- initiation complex, PIC) 中重要的蛋白質 TBP 結合，以免疫共沉澱法偵測。實驗所 使用的 TBP 為 Penaeus monodon TBP (PmTBP)，經 NCBI 線上資料庫比對之結果 顯示，PmTBP 與 LvTBP 的序列相似度達 94%。將表現質體 pDHsp-PmTBP-V5- His 分別與 pDHsp-EGFP-Flag-His 或 pDHsp-LvYY1-Flag-His 轉染至 Sf9 昆蟲細 胞，培養 72 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沉澱，並以抗 V5 抗體 進行西方點墨偵測與 LvYY1 共同結合的蛋白質。結果顯示，在同時轉染 pDHsp- LvYY1-Flag-His 與 pDHsp-PmTBP-V5-His 的 組 別 中 ， 可 以 偵 測 到 LvYY1 與 PmTBP 結合的情形 (圖 8, IP, lane 6)。而在同時轉染 pDHsp-EGFP-Flag-His 與 pDHsp-PmTBP-V5-His 的組別中則無法偵測到 PmTBP 蛋白質 (圖 8, IP, lane 5)。因 此 LvYY1 會與草蝦的 TBP 蛋白質結合。
8. LvYY1 會結合於 wssv304 的核心啟動子
由免疫共沉澱的結果得知了 LvYY1 能與 PmTBP 在細胞內形成複合體。因此 想進一步了解 LvYY1 是否會結合於 wssv304 核心啟動子上。首先將 wssv304 核心 啟動子的 40-mer 片段以 biotin 標定作為探針，然後加入過量表現 pDHsp-LvYY1- Flag 的 Sf9 昆蟲細胞核蛋白質萃取物，進行電泳泳動性轉移分析 (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 法偵測。結果顯示，當加入 LvYY1 核萃取蛋白質時，
會形成蛋白質- DNA 複合體 (圖 10A, lane 3)。以濃度為標定探針 100 倍的 DNA 序 列作為蛋白質-DNA 複合體的競爭者 (competitors) ，結果顯示，未標定 biotin 的
wssv304 核心啟動子探針序列 304 (-30/+10) 及 YY1 家族轉錄因子的保守性 DNA
結合序列 Consensus 能有效的競爭此蛋白質-DNA 複合體 (圖 10A, lanes 4, 6)，而ie1 核心啟動子探針序列 ie1 (-31/+10) 也會競爭此複合體 (圖 10A, lane 5)，但是競
爭效果並無 304 (-30/+10) 明顯，STAT 結合序列則無法競爭此複合體 (圖 10A, lane 7)。加入抗 YY1 抗體後，會使此複合體會因泳動率降低而產生 supershift (圖 10A, lane 8) 。 綜 合 以上 結 果 ， LvYY1 會結 合 在 wssv304 核 心 啟 動 子 上 ， 但 LvYY1-DNA 的複合體中可能伴隨了 Sf9 昆蟲細胞中內生的基礎轉錄因子。doi:10.6342/NTU201600589 21
9. LvYY1 結合於 wssv304 啟動子上的 TATA box 及其後 8-mer 的序列
由 EMSA 的實驗結果得知，LvYY1 可能會與 Sf9 昆蟲細胞內生的基礎轉錄因 子形成複合體後結合於 wssv304 核心啟動子上，因此想進一步的探討此複合體於
wssv304 啟動子上的結合區域。以 biotin 標定的 wssv304 的 40-mer 的核心啟動子
片段作為探針，分別製備三條核苷酸突變之競爭者序列 TATA box mut、Mut1 及 Mut2，分別將其濃度稀釋為標定探針的 100 倍並加入標定的探針及過量表現 pDHsp-LvYY1-Flag 的 Sf9 昆蟲細胞核蛋白質萃取物進行反應，再以電泳泳動性轉 移分析法偵測。結果顯示，全長的 40-mer 片段競爭者序列能成功的競爭複合體，以此組的競爭效果作為正對照組 (圖 11A, lane 3)，而競爭者序列 TATA box mut 在位置 (-25 nt/-19 nt) 進行突變後，即無法競爭此複合體 (圖 11A, lane 4)；競爭者 序列 Mut1 在位置 (-18 nt/-11 nt) 進行突變後，依然無法競爭此複合體 (圖 11A, lane 5)；競爭者序列 Mut2 在位置 (-10 nt/-3 nt) 進行突變後，則無法觀察到複合體 之條帶訊號 (圖 11A, lane 6)。抗體測試之結果顯示，加入抗 TBP 抗體後，無法使 此複合體泳動率降低而產生 supershift (圖 11A, lane 10)。綜合以上結果得知，
wssv304 核心啟動子中的 DNA 序列 (-25 nt/-11 nt) 對於 LvYY1 的結合很重要，而
LvYY1 可能不是透過 Sf9 昆蟲細胞內生的 TBP 蛋白質結合於此段 DNA 序列上。10. LvDorsal 會結合於 ie1 啟動子上的 NF-κB 結合位
本研究室目前尚未確認 pDHsp-LvDorsal-V5-His 是否具有結合啟動子的特 性，因此想進一步的確認其具有結合 DNA 的能力。首先將 ie1 啟動子的 63-mer 片段以 biotin 標定作為探針，而目前已知此段序列上具有 NF-κB 及 YY1 結合位 (Huang et al., 2010b; 黃庭儀, 2014)，接著加入過量表現的 pDHsp-LvYY1-Flag- His、pDHsp-LvDorsal-V5-His 或兩者共表現的 Sf9 昆蟲細胞核蛋白質萃取物進行 反應後，再以電泳泳動性轉移分析法偵測。結果顯示，LvYY1 會與 DNA 形成複 合體 (圖 12A, lane 2)。加入抗 YY1 抗體後，會使此複合體的泳動率降低而產生 supershift (圖 12A, lane 3)。由於 LvYY1-Flag 不帶有 V5 標誌，因此加入抗 V5 抗 體後，不會競爭複合體的條帶訊號 (圖 12A, lane 4)。另外，LvDorsal 也會與啟動 子結合後形成 LvDorsal-DNA 複合體 (圖 12A, lane 5)。加入抗 YY1 抗體後，不會 看到訊號條帶的消失 (圖 12A, lane 6)。加入抗 V5 抗體後，會使此複合體的泳動
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率降低而產生 supershift (圖 12A, lane 7)。在共轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 及 pDHsp-LvDorsal-V5-His 的組別中，LvYY1 及 LvDorsal 會與 DNA 形成複合體 (圖 12A, lane 8)。加入抗 YY1 抗體或是抗 V5 抗體後，均能觀察到 supershift 的產生 (圖 12A, lanes 9, 10)。綜合以上的結果，本研究室建構出的 LvDorsal 表現質體所 表現出的 LvDorsal 蛋白質具有結合啟動子的能力。
11. LvDorsal 於協同效應中所扮演的角色
由實驗結果確認了 LvYY1 於 wssv304 的核心啟動子上的結合位後，接著想進 一 步 的 探 討 與 LvYY1 協 同 活 化 白 點 症 病 毒 極 早 期 基 因 的 另 一 個 轉 錄 因 子 LvDorsal 是否也會結合於 wssv304 的核心啟動子上。以 biotin 標定的 wssv304 核 心啟動子的 40-mer 片段作為探針，加入過量表現 pDHsp-LvYY1-Flag、pDHsp- LvDorsal-V5 及兩者共表現的 Sf9 昆蟲細胞核蛋白質萃取物 (圖 9) 反應後，再以電 泳泳動性轉移分析法偵測。結果顯示，LvYY1 與 DNA 會形成複合體 (圖 13A, lane 2)。加入抗 YY1 抗體後，會使此複合體會因泳動率降低而產生 supershift (圖 13A, lane 3)。由於 LvYY1-Flag 不帶有 V5 標誌，因此加入抗 V5 抗體後，不會競 爭複合體的條帶訊號 (圖 13A, lane 4)。另外，並未觀察到 LvDorsal 與 DNA 形成 複合體 (圖 13A, lane 5)，加入抗 YY1 或是抗 V5 抗體後，也無法觀察到訊號條帶 的消失 (圖 13A, lanes 6, 7)。而在共表現 pDHsp-LvYY1-Flag 及 pDHsp-LvDorsal- V5 蛋白質的組別中，LvYY1 與 DNA 會形成複合體，但無法觀察到 LvDorsal 與 DNA 所形成的複合體 (圖 13A, lane 8)，加入抗 YY1 抗體後，會使 LvYY1-DNA 複合體的泳動率降低而產生 supershift (圖 13A, lane 9)。加入抗 V5 抗體則無法觀 察到訊號條帶的消失 (圖 13A, lane 10)。綜合以上結果，LvDorsal 可能不會以直接 結合的方式或是透過 LvYY1 間接結合於 wssv304 的核心啟動子上。
由 EMSA 的實驗結果得知，LvDorsal 可能不會結合於 wssv304 的核心啟動子 上。為了進一步的證實 LvDorsal 不會結合於 wssv304 的核心啟動子上，以 DNA 親和性沉澱法 (DNA affinity precipitation assay, DAPA) 偵測。將表現質體轉染至 Sf9 細胞，培養 72 小時後收取細胞。首先以 EMSA 實驗中所使用的 wssv304 核心 啟動子的 40-mer 片段作為探針，加入 Streptavidin 膠體進行親和性沉澱，於 4°C 共同作用一小時並清洗後加入細胞溶裂液，再於 4°C 共同作用兩小時並清洗後，
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分別以抗 GFP 抗體、抗 YY1 抗體以及抗 V5 抗體進行西方點墨法偵測與 wssv304 核心啟動子結合的蛋白質。實驗結果顯示，在對照組別中，無法偵測到 GFP 結合 於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14A, DAPA, lane 2)；在轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 的組別中，可以偵測到 LvYY1 結合於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14A, DAPA, lane 4)，此結果也與 EMSA 的結果相符；在轉染 pDHsp-LvDorsal-V5-His 的組別中，
無法偵測到 LvDorsal 結合於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14B, DAPA, lane 2)；而在 共表現 pDHsp-LvYY1-Flag-His 及 pDHsp-LvDorsal-V5-His 的組別中，可以偵測到 LvYY1 的結合 (圖 14A, DAPA, lane 6)，但是無法偵測到 pDHsp-LvDorsal-V5-His 結合於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14B, DAPA, lane 4)。因此綜合以上的結果，
LvDorsal 不會結合於 wssv304 核心啟動子上。
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第四章 討論
YY1 家族轉錄因子廣泛地分布於生物體中，在細胞生理功能上扮演著重要的 調控角色，包括細胞生長、細胞凋亡、胚胎發育、X-chrosome 去活化、DNA 修 復及神經相關的退化疾病等 (Jeon and Lee, 2011; Lee et al., 2011; Shi et al., 1997)。
YY1 能根據細胞的種類及 DNA 上的 YY1 結合位序列來決定它在細胞中所扮演的 角色，例如: transcriptional activator、transcriptional repressor 及 initiator (Thomas and Seto, 1999; Galvin and Shi, 1997)。先前本研究室將鋅手指核苷酸序列與白蝦的 EST 序列進行線上資料庫比對，結果發現白蝦具有三個鋅手指區的 EST 序列，並 透過5’ RACE 與 3’ RACE 選殖出了此基因，而將此基因的鋅手指區胺基酸序列與 其他物種進行比對後，發現與許多物種的 YY1 轉錄因子有高度的相似性，因此將 此基因命名為 LvYY1 (黃庭儀, 2014)。許多研究指出，宿主 YY1 轉錄因子會參與 病毒基因的調控，例如：YY1 能夠結合於 Epstein-Barr virus (EBV) 的極早期基因 BZLF1 啟動子上而抑制 BZLF1 基因的表現 (Montalvo et al., 1995; Montalvo et al., 1991)。YY1 能結合於人類免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1) 的 long terminal repeats (LTRs) 上的 YY1 結合位，使 HIV-1 在細胞內能維 持潛伏 (latency) 的狀態 (Bernhard et al., 2013)。
Dorsal 轉錄因子最早被發現於果蠅，為哺乳類動物 NF-κB 家族蛋白質中 p65 (RelA) 的同源蛋白質 (Steward, 1987)。NF-κB 家族轉錄因子在生物體內扮演著重 要的角色，例如：調節發炎反應、細胞增生、細胞凋亡、先天免疫等。除此之外，
有許多報導指出，病毒會促進宿主 NF-κB 轉錄因子的活化，並挾持活化後的 NF- κB 來活化自身基因的表現，例如：EBV 能透過結合人類 B 淋巴球的 CD21 受體 來活化宿主 NF-κB 轉錄因子，NF-κB 會結合於與 EBV 進入潛伏期相關基因 Wp 的啟動子上而活化 Wp 基因的轉錄，使病毒能夠順利的感染細胞 (Sugano et al., 1997)。白蝦也具有果蠅 Dorsal 轉錄因子的同源蛋白質，遂將其命名為 LvDorsal (Huang et al., 2010a)。有研究指出，白點症病毒的病毒蛋白質 WSSV449 與白蝦的 Tube 蛋 白 質 具 有 15.7% - 19.4% 的 相 似 性 ， 能 夠 活 化 黑 腹 果 蠅 (Drosophila
