第二章 材料與方法
1.
實驗菌種與細胞株實驗所使用的大腸桿菌 (Escherichia coli, E. coli) 主要為 EPI-300 和 BL21(DE3) 兩種菌株。將菌株接種於 Luria-Bertani (LB) 培養液 (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.2) 之中，並於 37°C 培養箱中震盪培養隔夜，之後進行質體 DNA 的萃取或是蛋白質的誘導表現。EPI-300 主要用於質體的建構，BL21 則用來 表現異源蛋白質。細胞實驗所使用的細胞株為秋夜盜蛾 (Spodoptera frugiperda, Sf9) 細胞株，培養於含有 10% 胎牛血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 培養液，並 於 27°C 培養箱培養。
2.
質體 DNA 萃取根據 PrestoTM Mini Plasmid Kit (Geneaid) 的說明書操作。
3.
質體建構本研究室先前根據 RACE 的結果得知了 LvYY1 的 cDNA 片段，根據 cDNA 片段設計出了 LvYY1-F (表 1) 及 LvYY1-R (表 1) 引子，以 PCR 的方式擴增出了 LvYY1 基因的開放譯讀區 (Open Reading Frame, ORF) 的片段，將擴增出來的片段 以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位接入 Flag-His、V5-His 及 pDHsp-EGFP-V5-His 質體中 (Liu et al., 2007)，因此分別將質體命名為 pDHsp-LvYY1-Flag-His、pDHsp-LvYY1-V5-His 及 pDHsp-EGFP-LvYY1-V5-His，而這三個質體 用於昆蟲細胞中表現 LvYY1 重組蛋白質。以 LvYY1-F (表 1) 及 LvYY1-R (表 1) 引子擴增 LvYY1 基因的開放譯讀區序列後，以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位接入 pGEX-4T-1 表現載體 (GE Healthcare) 中，並命名為 GST-LvYY1，此質體用於 E.
coli BL21(DE3) 中表現 LvYY1 重組蛋白質。另外，根據 LvDorsal 的 DNA 序列分
別設計出 LvDorsal-BamHI-F (表 1)、R (表 1) 及 LvDorsal-EcoRI-GFP-R (表 1) 的引子序列，以 PCR 的方式擴增出 LvDorsal 基因的開放譯讀區後，doi:10.6342/NTU201600589 10
將擴增出來的片段以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位分別接入 pDHsp-V5-His 及 pDHsp-EGFP-V5-His 質體中，並分別將質體命名為 pDHsp-LvDorsal-V5-His 及 pDHsp-LvDorsal-GFP，此兩質體用於昆蟲細胞中表現 LvDorsal 重組蛋白質。以 LvDorsal-BamHI-F (表 1) 及 LvDorsal-EcoRI-R (表 1) 引子擴增 LvDorsal 基因的開 放譯讀區後以 BamHI/EcoRI 的限制酶切位接入 pET28a (+) 表現載體 (Novagen) 中，
並命名為 pET28a-LvDorsal，此質體用於 E. coli BL21(DE3) 中表現 LvDorsal 重組 蛋白質。冷光報導分析所使用的白點症病毒極早期基因的報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368) 、 wssv108 (-102/+368) 、 wssv108 (-72/+368) 及
pGL3-wssv108 (-52/+368) 為將不同長度的 pGL3-wssv108 啟動子片段以 NheI/XhoI 的限制酶切
位接入 basic 載體 (Promega) 中 (蔡沛賜, 2015) (表 1)；報導質體wssv304 (-418/+82)、wssv304 (-93/+82)、wssv304 (-36/+82) 及
pGL3-wssv304 (-25/+10) 為將不同長度的 pGL3-wssv304 啟動子片段以 SmaI/HindIII 的限制酶切
位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中 (表 1)；pGL3-ie1 (-268/+52) 報導質體由劉宛 菁博士提供 (Liu et al., 2007)，pGL3-ie1 (-44/+52) 及 pGL3-ie1 (-31/+10) 為將不同 長度的 ie1 啟動子片段以 XhoI/HindIII 限制酶切位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中，而 pGL3-ie1 (-94/+52) 則是以 BamHI/HindIII 限制酶切位接入 pGL3-basic 載體 (Promega) 中 (表 1)。冷光報導分析所使用的 pIB-LvYY1 及 pIB-LvDorsal 為分別 將 PCR 擴增出來的 LvYY1 及 LvDorsal 基因的開放譯讀區序列以 BamHI/EcoRI 的 限制酶切位接入 pIB/V5-His 表現載體 (Invitrogen) 中 (表 1)；pIB-LvCactus 為將 PCR 擴增出來的 LvCactus 基因的開放譯讀區序列以 BamHI/NotI 的限制酶切位接 入 pIB/V5-His 表現載體 (Invitrogen) 中 (表 1)。doi:10.6342/NTU201600589 11
用 10 分鐘後，於 4°C 以 3000 rpm 離心 10 分鐘。去除上清液後加入 2 mL 的 transformation buffer 回溶菌體，再分別取 100 μL 菌液分裝於 1.5 mL 微量離心管 中，最後保存於 -80°C 冰箱以供日後實驗使用。
5.
細胞轉型將限制酶處理過後的目標 DNA 與載體以 8：1 的比例於室溫進行連接反應 (ligation)，反應 15 分鐘後將連接完成的質體 DNA 加入解凍後的勝任細胞，並於 冰上靜置反應 20 分鐘，以 42°C heat shock 作用 90 秒後迅速置於冰上冷卻 30 秒，
再加入 500 μL LB 培養液並於 37°C 培養箱靜置培養 30 分鐘，最後取 200 μL 菌液 塗盤後於 37°C 培養箱靜置培養 14-16 小時。
6.
細胞轉染要進行細胞核蛋白質萃取時，將 9x105個 Sf9 昆蟲細胞種入 6-well 的細胞培 養盤中並等待細胞貼附 1 小時。將 3 μg 質體 DNA、6 μL 的 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen) 與不含胎牛血清及抗生素的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 培養液均勻混 合後，於 27°C 培養箱靜置反應 30 分鐘，之後將培養盤上含血清之 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 置換成不含血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen)，然後將反應後的混合液 加入已附著在培養盤上的細胞中並輕輕地搖晃細胞培養盤，使其混合均勻，最後 置於 27°C 培養箱培養 48-72 小時，其中約每 24 小時以 42°C heat shock 作用 20 分 鐘，約 2 至 3 次，最後將細胞收集後進行核蛋白質的萃取。
若是要進行冷光報導分析時，則將 2x105個 Sf9 昆蟲細胞種入 24-well 的細胞 培養盤中並等待細胞貼附 1 小時。將質體 DNA (800 ng 的調控子與 100 ng 的報導 載體) 、0.9 μL 的 Cellfectin® II Reagent (Invitrogen) 與不含血清及抗生素的 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 均勻混合後，於 27°C 靜置反應 30 分鐘，之後將培養盤上含血 清之 Sf-900 II SFM (Invitrogen) 置換成不含血清的 Sf-900 II SFM (Invitrogen)，並 將反應後的混合液加入已附著在培養盤上的細胞中並輕輕地搖晃細胞培養盤，使 其混合均勻，最後置於 27°C 培養箱培養 42 小時，之後進行冷光報導分析。
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7.
細胞核蛋白質萃取將培養於 6-well 細胞培養盤中的 Sf9 昆蟲細胞以 pipet 沖洗、收集至 15 mL 離心管，再以 2 mL PBS (phosphate-buffered saline) 沖洗 2 次，以 1200 rpm 於室溫 離心 5 分鐘之後將上清液移除，加入 1 mL PBS 回溶細胞並轉移至 1.5 mL 微量離 心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘之後將上清液移除，加入 400 μL Buffer A [10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 10 μg/mL serine protease inhibitor 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF) /Leupeptin (LEU), 1 mM DTT, pH 7.9] 懸浮細胞，置於冰上反應 15 分鐘將細胞脹破，加入 25 μL 10% NP-40 打破細胞膜並以振盪器輕輕地震盪 10 秒後，於冰上靜置反應一分鐘，之後以 2000 rpm 於 4°C 離心 15 分鐘，將上清液收集並分裝至 1.5 mL 微量離心管，此部 分的上清液為細胞質液。最後將沉澱物以 50 μL Buffer B [20 mM HEPES, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μg/mL serine protease inhibitor AEBSF/LEU, 1 mM DTT, pH 7.9] 懸浮並打破細胞核，再以 12000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘後，所得上清液部分 即為核萃取物，以 10 μL 為單位分裝於 1.5 mL 微量離心管，保存於 -80°C 冰箱以 供日後實驗使用。
8.
冷光報導活性分析 (Luciferase reporter assay)將 Sf9 細胞種於 24-well 細胞培養盤，之後將白點症病毒極早期基因啟動子的 報導質體以及含有 LvYY1 及 LvDorsal 基因的表現質體轉染至細胞後於 27°C 培養 箱培養 42 小時。移除上清培養液後加入 200 μL lysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100)，搖晃反應 10 分 鐘將打破細胞，反應完後取 50 μL 上清液至冷光分析盤中並加入 50 μL 的冷光受 質液 (20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2‧5H2O, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270 mM coenzyme A, 470 mM luciferin, 530 mM ATP)，
輕輕地搖晃使上清液與冷光受質液反應完全後放入冷光分析儀 (Orion II, Berthod, Bad Wildbad, Germany) 並測量冷光酵素活性數值 (Chang et al., 1998)。
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9.
蛋白質的表現誘導將質體 pGEX-LvYY1 或 pET28a-LvDorsal 轉型到 E. coli BL21(DE3) 後，分別 接種於 5 mL 的 LB 培養液中，於 37°C 培養箱震盪培養 14-16 小時，將菌液稀釋 25 倍後接種至新鮮的 LB 培養液中，於 37°C 震盪培養 2 小時後，加入 10 μL 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 並於 25°C 震盪培養 5 小時以誘導 蛋白質表現。將細菌離心收集後保存於 -80°C 冰箱，以供日後實驗使用。
10. 西方點墨法 (Western blotting)
將表現重組蛋白質的 Sf9 昆蟲細胞或 E. coli BL21(DE3) 離心、收集後，以 mRIPA buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5%
TritonX-100, 10 μg/mL serine protease inhibitor AEBSF/LEU, 1 mM DTT, pH 7.8) 回 溶，於冰上靜置反應 10 分鐘，以超音波震盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 以 1 秒震動，2 秒休息為一循環於冰上打破細胞後，以 12000 rpm 於 4°C 離心 10 分鐘，再將上清液轉移至新的 1.5 mL 微量離心管並加入三分之一體 積之 4X sample buffer (40% glycerol, 240 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% SDS, 0.04%
bromophenol blue, 8% β-mercaptoethanol)，接著以 95°C 加熱處理 5 分鐘使蛋白質 變性。將樣品注入 10% 聚丙烯醯胺膠體後以 168 V 電壓進行 SDS-PAGE 電泳，
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11. 電泳泳動性轉移分析 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)
EMSA 的實驗步驟是根據 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo) 的 流程進行操作。為了探討 LvYY1 與 LvDorsal 是否能夠結合於 wssv304 核心啟動 子上，以表現 LvYY1-Flag 及 LvDorsal-V5 的 Sf9 昆蟲細胞核萃取物作為實驗用的 蛋白質，合成白點症病毒極早期基因 wssv304 啟動子之 TATA box 前後共 40-mer 的探針 (probe) 並於 5’ 端點標記 biotin。實驗預先混合 EMSA 反應溶液 (10X Binding buffer：100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT, pH 7.5、Poly (dIdC)：0.1 μg/μL in 10 mM Tris, 1% NP-40, 1 mM EDTA, pH 7.5) 與 0.5 μL 20 fmol/μL 探針， 膜上的蛋白質、DNA 複合體。之後將 Nylon 膜以 blocking buffer 於室溫 blocking 20 分 鐘 ， 再 將 稀 釋 於 blocking buffer 的 Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 與 Nylon 膜於室溫反應 30 分鐘，使其能與探針 5’ 端點的 biotin 結合。之後以 wash buffer 清洗 Nylon 膜 3 次，每次 5 分鐘，去除殘留的 Conjugate，將 wash buffer 倒掉後加入 Substrate Equilibration Buffer 以平衡 Nylon 膜的 pH 值，於室溫搖晃反應 1 分鐘後，倒掉 buffer 並加入 1.5 mL Substrate Working Solution 搖晃反應 3 分鐘使受質液與 HRP 作用而激發冷光，最後以 X 光 底片顯影的方式偵測結果。另外，在競爭實驗中所使用的未標定 biotin 探針之濃 度為 biotin 探針的 100 倍，而實驗所使用的競爭者序列有：未標記 biotin 的探針 序列 wssv304 (-30/+10)、YY1 consensus 結合位序列 (Consensus)、STAT 結合位序 列 (STAT) 與 wssv304 (-30/+10) 突變序列 (Mutation) 。除此之外，實驗中也使用 抗 LvYY1 抗體 (黃庭儀, 2014)、抗 V5 抗體 (Enogene) 以及抗 TBP 抗體 (Sigma-Aldrich) 抗體進行 supershift assay，進一步確定 DNA 與蛋白質複合體為目標蛋白 質。
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serine protease inhibitor AEBSF/LEU, Lysozyme) 回溶細菌，於冰上反應 10 分鐘，再以超音波震盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 以 1 秒震動，2 秒休息為
13. 免疫共沉澱法 (Co-immunoprecipitation, Co-IP)
將表現質體轉染至 Sf9 細胞中表現，每 24 小時以 42°C heat shock 20 分鐘以 心 10 分鐘後取出上清備用。經前述處理後將表現有 pDHsp-LvYY1-Flag-His 蛋白 質之樣品分別與 pDHsp-EGFP-V5-His 蛋白質、pDHsp-LvDorsal-GFP 蛋白質及 30 μL ANTI-FLAG® M2 Affinity 膠體 (Sigma-Aldrich) 混合，於 4oC 作用 2 小時後，
以 8000 rpm 於 4°C 離心 1 分鐘將膠體沉澱下來，移除上清液後加入 650 μL lysis buffer 清洗膠體，重複此步驟 3 次，加入 30 μL lysis buffer 及 10 μL 的 4X sample buffer，接著以 95°C 加熱處理 5 分鐘將蛋白質變性，最後以西方點墨法偵測蛋白 質的結合。
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14. DNA 親和性沉澱分析 (DNA affinity precipitation assay, DAPA)
將表現質體轉染至 Sf9 細胞中表現，每 24 小時以 42°C heat shock 20 分鐘以 誘導蛋白質表現，轉染 72 小時後將細胞以 pipet 沖洗、收集至 15 mL 離心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘使細胞沉澱下來，加入 1 mL PBS 懸浮細胞並轉移到 新的 1.5 mL 微量離心管，以 1200 rpm 於室溫離心 5 分鐘使細胞沉澱下來，移除 上清液後加入 300 μL lysis buffer 回溶細菌，於冰上反應 10 分鐘，再以超音波震 盪器 (Sonic Vibra cell TM, model VCX750) 震動 15 秒於冰上打破細胞，以 12000 rpm 於 4oC 離心 10 分鐘後取出上清備用。將 EMSA 實驗中所使用的 biotin 探針與 Streptavidin 膠體 (Sigma-Aldrich) 於 4°C 反應 1 小時後，以 DAPA binding buffer (60 mM KCl、12 mM HEPES, pH 7.9、4 mM Tris-base, pH 8.0、5% Glycerol、0.5 mM EDTA 及 1 mM DTT) 清 洗 1 次 。 將 細 胞 溶 裂 液 加 入 與 探 針 作 用 後 的 Streptavidin 膠體混合，於 4°C 作用 2 小時後，以 8000 rpm 於 4°C 離心 1 分鐘將膠 體沉澱下來，移除上清液後加入 650 μL DAPA binding buffer 清洗膠體 3 次，加入 30 μL DAPA binding buffer 及 10 μL 4X sample buffer，經 95°C 加熱處理 5 分鐘將 蛋白質變性，並以西方點墨法分析。