1. LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv108 啟動子
根據本研究室先前研究指出，LvYY1 會結合於 wssv108 啟動子上 9-mer 序列 p(-91/-83) 並調控 wssv108 啟動子的轉錄活性 (蔡沛賜, 2015)。為了測試其他的轉 錄因子是否也會參與 LvYY1 調控 wssv108 啟動子轉錄活性的路徑，因此以冷光活 性分析偵測其他的白蝦轉錄因子是否會影響 LvYY1 對於 wssv108 啟動子的活化現 象。將報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368) 分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal、pIB-LvCactus 或對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果 顯示，過量表現 LvYY1 蛋白質會活化 wssv108 啟動子的轉錄活性至 10.39 倍 (圖 1B)，但過量表現 LvDorsal 蛋白質則不活化 wssv108 啟動子的轉錄活性 (圖 1B)。
LvCactus 為哺乳類動物 IκB 的同源蛋白質，過量 表現 LvCactus 也不會活化
wssv108 啟動子的轉錄活性 (圖 1B)。有趣的是，當過量表現 LvYY1 與 LvDorsal
蛋白質則會強烈的活化 wssv108 啟動子的轉錄活性 (圖 1B)。因此本實驗發現 LvYY1 與 LvDorsal 會協同調控白點症病毒極早期基因 wssv108 的表現。2. LvYY1 會與 LvDorsal 在細胞內結合
為了進一步了解 LvYY1 與 LvDorsal 協同活化 wssv108 啟動子的現象是否與 兩個轉錄因子之間的結合有關，因此以免疫共沉澱法進行分析。將表現質體 pDHsp-LvYY1-Flag-His 分別與 pDHsp-EGFP-V5-His 或 pDHsp-LvDorsal-GFP 轉染 至 Sf9 昆蟲細胞，培養 72 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沉澱，
並以抗 GFP 抗體進行西方點墨偵測與 LvYY1 共同結合的蛋白質。結果顯示，在 同時轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 與 pDHsp-LvDorsal-GFP 的組別中，可以偵測到 LvYY1 與 LvDorsal 的結合 (圖 2, IP, lane 4)。而在同時轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 與 pDHsp-EGFP-V5-pDHsp-LvYY1-Flag-His 的組別中則無法偵測到 GFP 蛋白質 (圖 2, IP, lane 3)。
此結果證實了 LvYY1 與 LvDorsal 能於細胞中結合。
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各自加入新的 1.5 mL 微量離心管中，並分別加入 glutathione-Sepharose agarose，
接著分別加入含有 His-LvDorsal 或 His 的細菌溶裂液，然後以抗 His 抗體進行西 轉錄活性。將報導質體 pGL3-wssv108 (-132/+368)、pGL3-wssv108 (-102/+368)、
pGL3-wssv108 (-72/+368)、pGL3-wssv108 (-52/+368) 或 pGL3-wssv108 (-91/-83)-YY1 mut 分別與表現質體 pIB-Lv(-91/-83)-YY1、 pIB-LvDorsal 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果顯示，不論是將 9-mer 的 YY1 結合序列移除、進行
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報導質體 pGL3-wssv304 418/+82)、pGL3-wssv304 93/+82)、pGL3-wssv304 (-36/+82) 及 pGL3-wssv304 (-25/+10) 分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及 對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果顯示，LvYY1 與 LvDorsal 並不會協同活化 wssv304 全長啟動子的轉錄活性 (圖 5B)，但是將 wssv304 啟動子 片段縮減至核心啟動子之長度時，LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 wssv304 核心啟 動子的轉錄活性至 50 倍左右 (圖 5B)。
6. LvYY1 與 LvDorsal 對 ie1 的核心啟動子的協同活化
為了進一步地確認 LvYY1 與 LvDorsal 協同活化白點症病毒極早期基因之現 象與核心啟動子有關，同樣地將 ie1 的啟動子片段進行縮減後，以冷光活性分析 偵測 LvYY1 與 LvDorsal 是否會調控啟動子的轉錄活性。將報導質體 pGL3-ie1 (-268/+52)、pGL3-ie1 (-94/+52)、pGL3-ie1 (-44/+52) 及 pGL3-ie1 (-31/+10) 分別與表 現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細 胞。 結 果 顯示， 將 ie1 啟動子片段縮 減 至核心啟 動子之長 度時， LvYY1 與 LvDorsal 會協同活化 ie1 核心啟動子的轉錄活性 (圖 6B)，與 wssv108 (圖 4) 及
wssv304 (圖 5) 的結果相同。另外，進一步的比較 LvYY1 與 LvDorsal 對於
wssv304 及 ie1 的原長及核心啟動子轉錄活性的影響，將報導質體 pGL3-wssv304
(-418/+82)、pGL3-wssv304 (-36/+82)、pGL3-ie1 (-268/+52) 及 pGL3-ie1 (-44/+52) 分別與表現質體 pIB-LvYY1、pIB-LvDorsal 及對照組表現質體 pIB/V5 共轉染到 Sf9 昆蟲細胞。結果也進一步的證實 LvYY1 與 LvDorsal 會協同調控白點症病毒極doi:10.6342/NTU201600589 20
TBP、TAFs 及 TFIIB 等來調控啟動子的轉錄活性 (Nguyen et al., 2004; Weis and Reinberg, 1997)，因此想進一步的探討 LvYY1 是否能夠與起始前複合體 (pre-initiation complex, PIC) 中重要的蛋白質 TBP 結合，以免疫共沉澱法偵測。實驗所 使用的 TBP 為 Penaeus monodon TBP (PmTBP)，經 NCBI 線上資料庫比對之結果 顯示，PmTBP 與 LvTBP 的序列相似度達 94%。將表現質體 pDHsp-PmTBP-V5-His 分別與 pDHsp-EGFP-Flag-pDHsp-PmTBP-V5-His 或 pDHsp-LvYY1-Flag-pDHsp-PmTBP-V5-His 轉染至 Sf9 昆蟲細 胞，培養 72 小時後收取細胞，以抗 Flag 抗體膠體進行免疫沉澱，並以抗 V5 抗體 進行西方點墨偵測與 LvYY1 共同結合的蛋白質。結果顯示，在同時轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 與 pDHsp-PmTBP-V5-His 的 組 別 中 ， 可 以 偵 測 到 LvYY1 與 PmTBP 結合的情形 (圖 8, IP, lane 6)。而在同時轉染 pDHsp-EGFP-Flag-His 與 pDHsp-PmTBP-V5-His 的組別中則無法偵測到 PmTBP 蛋白質 (圖 8, IP, lane 5)。因 此 LvYY1 會與草蝦的 TBP 蛋白質結合。
8. LvYY1 會結合於 wssv304 的核心啟動子
由免疫共沉澱的結果得知了 LvYY1 能與 PmTBP 在細胞內形成複合體。因此 想進一步了解 LvYY1 是否會結合於 wssv304 核心啟動子上。首先將 wssv304 核心 啟動子的 40-mer 片段以 biotin 標定作為探針，然後加入過量表現 pDHsp-LvYY1-Flag 的 Sf9 昆蟲細胞核蛋白質萃取物，進行電泳泳動性轉移分析 (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 法偵測。結果顯示，當加入 LvYY1 核萃取蛋白質時，
會形成蛋白質- DNA 複合體 (圖 10A, lane 3)。以濃度為標定探針 100 倍的 DNA 序
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率降低而產生 supershift (圖 12A, lane 7)。在共轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 及 pDHsp-LvDorsal-V5-His 的組別中，LvYY1 及 LvDorsal 會與 DNA 形成複合體 (圖 12A, lane 8)。加入抗 YY1 抗體或是抗 V5 抗體後，均能觀察到 supershift 的產生 LvDorsal 是否也會結合於 wssv304 的核心啟動子上。以 biotin 標定的 wssv304 核 心啟動子的 40-mer 片段作為探針，加入過量表現
由 EMSA 的實驗結果得知，LvDorsal 可能不會結合於 wssv304 的核心啟動子 上。為了進一步的證實 LvDorsal 不會結合於 wssv304 的核心啟動子上，以 DNA 親和性沉澱法 (DNA affinity precipitation assay, DAPA) 偵測。將表現質體轉染至 Sf9 細胞，培養 72 小時後收取細胞。首先以 EMSA 實驗中所使用的 wssv304 核心 啟動子的 40-mer 片段作為探針，加入 Streptavidin 膠體進行親和性沉澱，於 4°C 共同作用一小時並清洗後加入細胞溶裂液，再於 4°C 共同作用兩小時並清洗後，
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分別以抗 GFP 抗體、抗 YY1 抗體以及抗 V5 抗體進行西方點墨法偵測與 wssv304 核心啟動子結合的蛋白質。實驗結果顯示，在對照組別中，無法偵測到 GFP 結合 於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14A, DAPA, lane 2)；在轉染 pDHsp-LvYY1-Flag-His 的組別中，可以偵測到 LvYY1 結合於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14A, DAPA, lane 4)，此結果也與 EMSA 的結果相符；在轉染 pDHsp-LvDorsal-V5-His 的組別中，
無法偵測到 LvDorsal 結合於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14B, DAPA, lane 2)；而在 共表現 pDHsp-LvYY1-Flag-His 及 pDHsp-LvDorsal-V5-His 的組別中，可以偵測到 LvYY1 的結合 (圖 14A, DAPA, lane 6)，但是無法偵測到 pDHsp-LvDorsal-V5-His 結合於 wssv304 核心啟動子上 (圖 14B, DAPA, lane 4)。因此綜合以上的結果，
LvDorsal 不會結合於 wssv304 核心啟動子上。