et al., 2000; Bossche et al., 1994)。因此希望研究白色念珠菌中，與可 能造成伺機性感染的致病因子 (virulence factor) 相關的基因，連結抗 稱為毒力因子 (virulence factor)。文獻指出，當白色念珠菌受到外界
2
環境刺激時，能夠在酵母菌型態 (yeast form) 和絲狀型態
(filamentous form) 之間轉變，其中絲狀型態包含菌絲型 (hyphae form) 和假菌絲型 (pseudohyphae form)，而這樣的形態轉變已被視為是一 個重要的毒力因子 (Braun and Johnson, 1997; Lo et al., 1997)。已知誘 發型態轉變的因素包括：營養源、CO2、細胞密度及黏附情形 (Biswas and Van Dijck et al., 2007)、N-acetylglucosamine (GlcNAc) (Mattia et al., 1982)、pH 值、溫度、血清 (Gow and Gooday, 1982)等。於實驗室培 養在含有血清、pH 值中性和 37°C 的條件下，能夠有效誘發菌絲型態 的生長 (Yang, 2003; Berman, 2006)。一般認為酵母菌型利於在體內散 播，而菌絲型則利於入侵；在黏膜表面共生之白色念珠菌多呈酵母菌 型，在人體免疫力下降時才會轉變為菌絲型入侵表面黏膜 (Brown et al.,1999)。而調控型態轉變的訊息傳遞主要有 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway 及 cAMP-PKA pathway (Biswas and Van Dijck et al., 2007) 兩大路徑。在外界環境缺乏氮源 (Biswas and
Morschhauser, 2005)、存在氧化壓力 (oxidative stress) (Román et al., 2007) 和細胞的擁擠程度 (quorum sensing) (Sato et al., 2004) 都會經
而 cAMP-PKA pathway 已知在啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、
白色念珠菌或其他種類的真菌中，在菌絲生長的調控上都扮演著重要 的角色 (Lengeler et al., 2000)。Pathway 主要包含了 cAMP-dependent protein kinase A (PKA) 和下游轉錄因子 Efg1p。cAMP 的表現增加或抑
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制 cAMP phosphodiesterase 的活性，都能活化細胞由酵母菌型轉變 為菌絲型。白色念珠菌中兩個正向調控菌絲生成之 PKA：Tpk1p 和 Tpk2p，分別負責不同培養基的菌絲表現型；tpk1/tpk1 剔除株使白色 念珠菌喪失在固態培養菌絲生成的能力；tpk2/tpk2 剔除株則抑制白 色念珠菌在液態培養基上生長菌絲的能力 (Sonneborn et al., 2000;
Bockmuhl and Ernst, 2001; Cloutier et al., 2003)。活化的 PKA 藉由磷酸 化調控Efg1p 的活性，過量表現會刺激啤酒酵母 (S. cerecisiae) 形成 假菌絲型；但在白色念珠菌誘發菌絲生成時，表現量是下降的；但過 量表現又可促使白色念珠菌形成假菌絲，因此認為 EFG1 同時扮演著 transcription activator 和 repressor 的角色 (Stolddt, 1997)。而
efg1/efg1 剔除株會喪失於血清及 GlcNAc 誘發下形成芽管 (芽管為 菌絲早期的型態) 和菌絲的能力，但仍然可觀察到假菌絲的型態 (Biswas and Van Dijck et al., 2007)。另外，cph1/cph1 efg1/efg1 雙剔除 株會使白色念珠菌在大部分的培養條件下喪失菌絲和假菌絲生成的 能力，且對實驗小鼠也喪失系統性感染的能力，使小鼠死亡率大幅降 低 (Lo et al., 1997)。因此，CPH1 和 EFG1 下游所調控的基因和白色 念珠菌的型態轉變或是致病力有關。
另外，本實驗室先前利用抑制刪除雜交法
(Suppression Subtractive Hybridization, SSH) 來篩選和型態變化相關的 基因，找出長菌絲型 (SC5314) 與酵母菌型 (HLC54 基因型為
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Voriconazole) 及 Triazole (代表藥物為 Miconazole) 兩類。作用 方式係經由抑制 cytochrome P450 系統的酵素
14-αdemethylase，受質 lansterol 則會受到 △5,6－desaturase (ERG3基因產物) 催化形成 3,6-diol 衍生物，此衍生物大量堆積
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菌而非殺菌，無形中篩選出具抗藥性的菌株。抗藥性真菌會利用以下 一種或一種以上的機制來達到抗藥目的：一、減少藥物在體內的累積。
包含了減低藥物的進入和增加藥物的排出，但藥物的進入體內機制未 明，而藥物排出是臨床上真菌抗藥最重要的因素之一，目前已知 ABC transporter (CDR1、CDR2) 和major facilitator proteins (MDR1) 控制此 機制的膜蛋白輸出幫浦 (efflux pumps)，當其大量表現時，會促進藥 al., 2004)。SAT1 flipper cassette 包含了由 ACT1 promoter 所調控表現 白色念珠菌基因 CaSAT1，基因產物轉譯出酵素 streptothrin
acetyltransferase 可使藥物 Nourseothricin 失活，在此為一藥物篩選 標記；及由 MAL2 promoter 調控的 CaFLP，當培養基添加 maltose 誘發 MAL2 promoter 表現下游基因 CaFLP，產生酵素 site-specific recombinase，並結合到 cassette 兩端的 FRT (minimal FLP
recombination target sequence)，進行 site specific recombination 將
6 資料庫中比對結果，顯示出最相似的蛋白為 Candida dubliniensis CD36 XP_002421346 protein，如圖二所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 99%，其中 identity 為 61%，positive 為 72%。但 在Candida dubliniensis 中此相似蛋白功能未知。另外由 CGD (Candida genome database) 提供的文獻上得知此基因同源於酵母菌 SCYJR115 (Karababa et al., 2004)，有 510 bp 轉譯出 169 個氨基酸，在 NCBI Blast 資料庫中比對結果，顯示兩胺基酸相似度為 34%，其中 identity
7 (Garcı´a-Sa´nchez et al., 2005)。
1.5.2 CaORF19.5305 (RHD3) 基因之介紹
CaRHD3 有 615 bp 轉譯出 204 個胺基酸。由 NCBI Blast 資料 庫中比對結果，顯示出最相似的蛋白為Candida dubliniensis CD36 中 未知功能的 cell wall protein，如圖四所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 100%，其中 identity 為 88%，positive 為 93%。
CaRHD3 是一個典型的 GPI-anchored protein，屬於細胞壁蛋白，藉由 β-1,6-glucan 連結到細胞壁上 (de Boer et al., 2010)，所以在對數期生 長的酵母菌型白色念珠菌的細胞壁中，Rhd3p 的表現量很高 (de Groot et al., 2003)。CaRHD3 的表現量會受到型態轉變和鐵離子濃度 的影響；在血清誘發菌絲生成的條件下，CaRHD3 表現量下降 (de Boer et al., 2010)；而在鐵離子濃度較高 (100 μM) 的情況下反而有較 高的表現量 (Lan et al., 2004)。在本實驗室前人的研究中，比較 CaRHD3 剔除株和野生株之間，於型態轉變方面、測試影響細胞膜和 細胞壁的化學物質反應 (ex: SDS、High concentration of NaCl、calcoflour white、β-1,6-glucanase、Zymolase) 和對上皮細胞的黏附力的實驗結 果皆無差別，但在對小鼠毒性跟野生株比起來有下降的趨勢。由於 CaRHD3 在 HLC54 中表現量大增，認為可能是 transcriptional factor
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Efg1p 下游所調控的基因之一 (林啟揚, 2001)，因此本實驗將會嘗試 在 HLC54 中剔除 CaRHD3，探討 CaRHD3 對型態轉變的影響。
1.5.3 CaORF19.3150 (GRE2) 基因之介紹
CaGRE2 有 1038 bp 轉譯出 345 個胺基酸。由 NCBI Blast 資 料庫中比對結果，與同源於酵母菌相似的蛋白為 SCGRE2p/YOL151Wp ，如圖五所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 98%，其 中 identity 為 39%，positive 為 62%。研究指出，CaGRE2 在低濃度 的鐵離子環境中表現量大幅提高 (Lan et al., 2004)；在轉錄比對 (transcription profiling) 中顯示 CaGRE2 受 Nrg1p 及 Tup1p 所調控 (Murad et al., 2001; Garcı´a-Sa´nchez et al., 2005)；在基因表現比對 (Gene expression profiling) 中顯示 CaGRE2 會受 benomyl
up-regulated (Karababa et al., 2004)。而 SCGRE2 基因目前已知有三大 功能：SCGRE2 會轉錄轉譯出具有 NADPH-dependent methylglyoxal reductase (D-lactaldehyde dehydrogenase) 的活性蛋白；在轉錄體學 (Transcriptome) 中分析，以 isoamyl alcohol 誘導菌絲生成的實驗中 證明SCGRE2 具有 isovaleraldehyde reductase 的活性；而在不同的壓 力來源 (osmotic、ionic、oxidative、heat shock 及 heavy metals) 的測 試下，會有不同程度上的基因表現 (Garay-Arroyo and Covarrubias, 1999; Vido et al., 2001)。
1.5.4 CaORF19.173 基因之介紹
CaORF19.173 有 3303 bp 轉譯出 1100 個胺基酸。由 NCBI Blast 資料庫中比對結果，與同源於酵母菌相似的蛋白為 ScAzf1p (Asparagine-rich Zinc-finger)，如圖六所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 39%，其中 identity 為 48%，positive 為 63%。
CaORF19.173 在弱酸環境下會由 transcription factor Mnl1p 所調控
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其表現 (Mark Ramsdale, et al.,2008)；由於蛋白質結構中含有典型 zinc finger 之區域，推測基因功能可能為 transcription factor 調控基 因的表現。
1.5.5 CaORF19.7310 基因之介紹
CaORF19.7310 有 2367 bp 轉譯出 788 個胺基酸。由 NCBI Blast 資料庫中比對結果，與同源於酵母菌相似的蛋白為
ScMsc1p/YML128C (Meiotic Sister-chromatid recombination)，如圖七所 示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 63%，其中 identity 為 29%，positive 為 51%。Scmsc1 剔除株影響減數分裂時期同源染 色體的重組作用 (Thompson and Stahl, 1999)；不過白色念珠菌未有已 知的有性世代，也無減數分裂期 (Bennett and Johnson, 2005)。但染 色期同源重組會發生在有絲分裂期及細胞 DNA 修補作用時期
(Graser et al., 1996; Sung and klen, 2006)，因此若重組作用發生在不適 當的時間和位置，導致染色體發生異質性缺失 (Loss of heterozygosity) 和重新排列 (rearrangement)，都可能造成白色念珠菌型態變異或抗 藥性的產生 (Rustchenkp-Bulgac et al., 1990; Forche et al., 2005; Chen et al., 2011)。
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二、材料與儀器
2.1 菌株 (strain)
(1) Escherichia coli (strain：DH5α)：
其基因型為supE44ΔlacU169 (Φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1。 SC5314 Wild-type strain Gillum et al.,
1984; 本實驗室
SC5314B Wild-type strain Gillum et al., 1984 HLC54 cph1/cph1 efg1/efg1 Lo et al., 1997
OHE1
OHE2 CaORF19.6586/Caorf19.6586::FRT 本實驗 OHO1
OHO2 Caorf19.6586::FRT/Caorf19.6586::FRT 本實驗 ORE2
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2.2 質體 (plasmid)
質體 (Plasmid) 描述 (Description) 來源 (Sources) pSFS2 帶有SAT1 marker，可抗
nourseothricin。並含 CaFLP 及
pSAT1-ORF19.6586-B pSFS2 質體外接 CaORF19.6586 下游約 244 bp 的片段
本實驗
pSAT1-ORF19.6586-AB pSAT1-ORF19.6586-B 質體外接 CaORF19.6586 上游約 238 bp 的 片段
12 O-proB TTCCCCCAAAATCTTCTTGCTCTAACGTA CaORF19.6586
gene: OS1 TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGG CaORF19.6586
gene:
-193~-164 OS2 GTACCTTAGTCCTGAATCTTCAATGG CaORF19.6586
gene:
+228~+253 OS3 TATTGCCATAGAAGCTACTATTCCT CaORF19.6586
gene:
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+633~+657 OS4 AAAAGATTGACTGACACGATATGGAC CaORF19.6586
gene:
+945~+970 PAS1 GGCCTTTTGCTGGCCTTTTG pSFS2-SAT1
plasmid:
+1782 ~+1800 PAS2 CAGCTATGACCATGATTACG pSFS2-SAT1
plasmid:
+2141 ~+2160 PBS1 AAGATTGAACTCAACTCAAC pSFS2-SAT1
plasmid:
+5897 ~+5916 PBS2 AAGGGTGGTAATTATTACTA pSFS2-SAT1
plasmid:
+6298 ~+6217 RS1 GCAGCTGGCACGACAGGTTT pSFS2-SAT1
plasmid:
+1981~ +2000 RS2 GTGACGTCCGTTATACATTG CaRHD3 gene:
-180~ -161 RS3 GTTTCACTGGTGATGACAAA CaRHD3 gene:
+323~ +342 R-resB AAAGGGCCCTTGGAAAAAGAATATTAGGG CaRHD3 gene:
+1052~ +1071 HJL02557 GGTTGTGATAGTGGTGGTGGAGGAGAAC CaRHD3 gene:
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GGCAACCTGAACAGACCATAGCTACCC CaRHD3 gene:
+1287 ~+1313 HJL02564
(R-F)
ATCCTTGTCTAGCTCTGCTCTTGCTACC CaRHD3 gene:
+21 ~ +48 HJL02565
(R-R)
ACATGACTAATCCAGCAACAACAGCAG CaRHD3 gene:
+587 ~ +613 GRE2-preA CTCTGGAATTTTAACTTCGAAAGCCAAATTGCC CaGRE2 gene:
-577 ~ -545 GRE2-AR CAGCCCTCGAGTTTCAATTGTTCACCTTT CaGRE2 gene:
+115~ +132
15
Alpha Biociences Inc.: LB agar (Cat. No. L12-111)
Ameresco: Agarose (Cat. No. 0710-500G), EDTA (Cat. No. 0105-1KG), Glycerol (Cat. No. 0854-1L-PTM), Phenol (Cat. No. 0945-400ML), Sodium chloride (Cat. No. 0241-1KG), Tris base (Cat. No. 0826-1KG), Tris-hydrogen chloride (Cat. No. 0234-500G)
AppliChem: Ampicillin
Biochain○R: FastHyb-Hybridization solution (Cat # L1031250)
Difco laboratories: Bacto agar (Cat. No. 143175), D-mannitol (Cat.
No. 17217020), Nutrient broth (Cat. No. 149018), Yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 145368), YPD broth (Cat. No.
235141XB), Sabouraud Dextrose Agar (Cat. No. 210950)
Fermentas: DreamTagTM DNA polymerase (5 unit /μl, Cat. No.
3-N-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (Cat. No. 1132612), Sodium hydroxide (Cat. No. 3722-01), Triton X-100 (Cat. No.
X198-07)
Kodak: X-film (Cat. No. 1651454)
Merck: Ethanol (Cat. No. K33534874), Sodium acetate (Cat. No.
1.06268.0250), Sodium hydrogen carbonate (EC number 205-633-8), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No. S26740)
CDP-STAR○R Chemiluminescence reagent (LOT: 0706013)
16
Panreac: K2HPO4 (Cat. No. 141512)
Protech: 100 bp DNA ladder (Cat. No. M1-100T)
Pfizer Inc.: Fluconazole (PF-00345508-00), Voriconazole (Lot # 052301-008-09)
Riedel-de Haёn: Chloroform (Cat. No. 32211), Sodium citrate tribasic dehydrate (Cat. No. 25116), Sodium dodecyl sulfate (Cat. No. 62862), Sodium hydroxide
Roche: Anti-DIG-AP (Cat. No. 12930025), Blocking reagent (Cat. No.
1096176), DIG DNA labeling mix (Cat. No. 1277065), DIG Easy Hyb (Cat. No. 11603558001)
Scharlau: LB broth (Cat. No. 02-385)
Sigma Chemical Co.: Arginine (Cat. No. A5131), Dithiothreitol (Cat.
No. D9779) Formaldehyde (Cat. No. 33220), Glassbeads (425~600 μm) (Cat. No. G9268-50G), Histidine (Cat. No. H8125), Lithium acetate (Cat. No. L-6883), Sorbitol (Cat. No. S-0900), Tween 20 (Cat.
No. p-1379), Uridine (Cat. No. U3750), MOPs (Lot# BCBH5347V), Miconazole nitrate salt (Cat. No. 22832-87-3)
Subenzyme: 1kb DNA ladder (Cat. No. SEM11C001)
Werner Bioagents: Nourseothricin (Cat. No. 5.1000)
景明化工: Ethanol
2.5 緩衝溶液與試劑
50 X TAE buffer: 48.4 g Tris base, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml, 11.42 ml acetic acid added dd H2O to 200 ml
10 X SDS: 10g SDS dissolved in dd H2O to 100 ml (pH 7.2)
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20 X SSC buffer: 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate (pH 7.0)
Prehybridization/Hybridization solution: 0.5 M sodium phosphate (pH 7.2), 7 % (w/v) SDS, 1 mM EDTA (pH 7.0)
10 X Blocking solution: 1 % (w/v) blocking reagent (Roche) dissolved in maleic acid buffer
Detection buffer: M Tris-Cl, 0.1 M NaCl (pH 9.5)
Denaturation solution: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl
Neutralization solution: 0.5 M Tris-Cl, 1.5 M NaCl (pH 7.5)
1 M Lithium Acetate: 40.8 g Lithium Acetate added dd H2O to 400 ml (pH 7.5)
10 X Tris-EDTA buffer: 100 mM Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH7.5)
3 M Sodium acetate (NaOAC): 40.83 g NaOAC dissolved in dd H2O to 100 ml (pH 7.0)
1 M Dithiothreitol(DTT): 3.09 g DTT dissolved in 0.01 M NaOAC 20 ml, store at -20°C
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0.85 % NaCl: 8.5 g Sodium Chloride dissolved in ddH2O to 1 L
RPMI solution: 10.4 g RPMI medium 1640, 34.53 g MOPs, 2 g NaHCO3 dissolved in ddH2O to 1 L (pH 7.0)
2.6 酵素
Fermentas: T4 DNA Ligase (EL0331), Taq DNA Polymerase (EP0402)
TAKARA: EX TagTM (Cat. No. RR001A)
NEB: Apa I (Cat. No. R0114S), Ava I (Cat. No. R0558S), Kpn I (Cat. No.
R0142S), Sac I (Cat. No. R0156S), Sac II (Cat. No. R0157S), Xho I (Cat.
No. R0146S), Nsi I (Cat. No. R0127S), Nco I (Cat. No. R0193S), Eco RV (Cat. No. R0195S), Swa I (Cat. No. R0604S), Bsa BI (Cat. No. R0537S), Nru I (Cat. No. R0192S), Pst I (Cat. No. R0140S), Bam HI (Cat. No.
R0136S)
2.7 培養基配置
LB (Luria-Bertni) 培養液: 1 % tryptone，0.5 % yeast extract，1 % NaCl
LB (Luria-Bertni)/Ampicillin 培養基: 1 % tryptone，0.5 % yeast extract，1 % NaCl，1.5 % agar，50 µg/ml Ampicillin
YPD 培養液: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose
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YPD/nourseothrcin 培養基: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose，2 % agar，200 µg/ml Nourseothricin
YPD/1 ml FBS 培養基: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose，
2 % agar，1 ml FBS
Bacto agar/1 ml FBS 培養基: 2 % agar，1 ml FBS
Solid spider 培養基: 1 % nutrient broth，1 % mannitol，0.2 % K2HPO4，1.35 % agar
SDA 培養基: 0.5 % peptic digest of animal tissue，0.5 %pancreatic digest of casein，4 % Dextrose，1.5 % agar
2.8 儀器設備
微量高速冷凍離心機 Centrifuge 5415R (eppendorf) 雜交連結器 (UVITEC)
分光光度計 20GENESYSRT (SPECTRONIC INSTRUMENS)
核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 梯度核酸增殖儀 labcycler (SENSQUEST)
PCR 溫度控制儀 Gene CyclerRT (BIO-RAD) 基因脈衝儀 (BIO-RAD)
脈衝控制器 (BIO-RAD)
程式溫度控制儀 PTC-200 Thermal Cycler (MJ RESEARCH) 震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 (SCIENTIFIC INDUSTRICS) 試管震盪器 IK1-VIBRAX-VXR
平面式震盪器 S-101 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 加熱攪拌器 S101 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 乾燥加熱板 DB102 (Violet BioSciences, Inc.)
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酸鹼值檢測計 Φ360 (BECKMAN) 電子天秤 PB153-S (METTLER TOLEDO) 往復式恆溫水槽 B206 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 水平式電泳槽 MJ-105 (MEDCLUB)
微量離心機 MICRO 240A (DINVILLE SCIENTIFIC INC.) 電子防潮箱 DX106 (台灣防潮科技)
恆溫式震盪培養箱 B206 (FIRSTECK SCIENTIFIC)
迴轉式震盪培養箱 721SR (WISDOM APPARATUS MFG COMPANY) 迴轉式震盪培養箱 OSI500 (KS)
電泳影像處理系統 GEL DOC 2000 (BIO-RAD) 電泳影像擷取分析系統 (Alphalmager TM)
微電腦多功能冷凍高速離心機 Centrifuge 5804R (eppendorf) 桌上型高速離心機 5100 (KUBOTA CORPORATION)
桌上型冷凍離心機 GS-15R (BECKMAN)
24孔高速離心機 LEGEND MICRO17 (THERMO) 4°C三門冰藏櫃 KS-101-MS (MINI KINGKON) -20°C冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE) -80°C冷凍櫃 925/926 (Forma Scientific) 倒立顯微鏡 CK40 (OLYMPUS)
超純水製造機 Simplicity (MILLIPORE) 水浴槽 B-100 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 脈衝器 MicroPulserTM (BIO-RAD)
電磁式奈米級偵測儀 ND-100 (NamoDrop) 數位相機 C-5050ZOOM (OLYMPUS)
數位相機 K200D (PENTAX)
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數位相機 G11 (CANON)
雙光束紫外/可視光分光光譜儀 U-3010 (HITACHI) 無菌操作箱二級 SC4TXSB (BAKER)
落地形高速離心機 J2-MC (BECKMAN)
柯達全自動洗片機 X-OMAT 2000 PROCESSOR (KODAK) 倒立顯微鏡 IX70 (OLYMPUS)
微生物生長曲線快速分析系統 Bio screen C (Growth Curves)
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3.2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction)
以設計好之一對 primer，配合 DNA template 及 taq polymerase，