會得到片段 2208 bp。以圖十六<B>底片結果所示，Lane 3 野生株 SC5314 (wild-type) 在低於 1904 bp 有一條預期片段；Lane 4、5 為 CaORF19.6586 單套基因剔除株 (CaORF19. 6586/Caorf19. 6586::FRT) 在低於 1904 bp 有一條預期片段和 1584 bp 及 1375 bp 之間有一 條預期片段；Lane 6、7 為 CaORF19. 6586 雙套基因剔除株 (Caorf19.
6586::FRT/Caorf19. 6586::FRT) 在 1584 bp 及 1375 bp 之間有一條預 期片段；Lane 1、2 為 CaORF19. 6586 單套基因回復株 (Caorf19.
6586::FRT/Caorf19. 6586::CaORF19. 6586) 在高於2927 bp 處有一條預 期片段，以及在 1584 bp 及 1375 bp 之間有一條預期片段。
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4.2.2 質體 pASATB 序列分析
如圖十八<A>所示，利用引子 PAS1 及 PAS2 進行定序分析，確 認 A region 有成功接合進 SAT1 flipper cassette 上游；以及利用引子 PBS1 及 PBS2 進行定序分析，確認 B region 有成功接合進 SAT1 flipper cassette 下游。如圖十八<B>定序結果顯示，在 A region 終點 有正確連結質體 pSFS2-SAT1 的預期序列；如圖十八<C>定序結果顯
nourseothricin 培養基上生長的菌落，進行存菌並萃取 genomic DNA。
同樣使用引子 HJL02557 和 LPCp-9R 進行 PCR，以圖十九<B>電泳圖
44 一條預期片段，依序命名為 RHD3HO9A~9E、RHD3HO10A~10D。
4.2.4 建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaRHD3 Open
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RHD3HO9D/RHD3HO10D 中。以含有藥物 nourseothricin 的 YPD 培 養基篩選帶有 SAT1 flipper cassette 之菌株。再挑選較大顆菌落，培 養在 YP maltose 培養液中進行 pop-out，之後萃取 genomic DNA，
如圖二十二<A>所示，利用引子 HJL02557 和 HJL02558 進行 PCR，
在單套基因回復株中預期會得到片段 2.6 kbp 和 1.3 kbp，將符合預 期的菌株塗佈在 YPD 培養基進行 replica plating，挑擇在不含藥物 nourseothricin 培養基上生長的菌落，進行存菌和萃取 genomic DNA；
同樣利用引子 HJL02557 和 HJL02558 進行 PCR，如果有成功將一套 RHD3 置換進去以及 cassette 剔除 (最後 rescued allele 會比
Parental strain allele 多一個 B region 和 FRT 片段)，預計會得到片段 2.6 kbp 和 1.3 kbp。以圖二十二<B>電泳圖結果所示，Lane 2 及 8 在 2.5 Kbp 有一條預期片段，在 1.5 kbp 和 1 Kbp 之間有一條預期片段，
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雜交和免疫偵測後，如圖二十三<A>所示，預期 Parental strain allele 會得到片段 3367 bps、CaRHD3 knock-out allele 會得到片段 2.9 kbp 和 CaRHD3 rescued allele 會得到片段 3.9 kbp。以圖二十三<B>底片 結果所示，Lane 3 Parental strain (HLC54 efg1/efg1 cph1/cph1) 在低於 3530 bp 之間有一條預期片段；Lane 4、5 為 CaRHD3 單套基因剔除 株 (CaRHD3/Carhd3::FRT efg1/efg1 cph1/cph1) 在低於 3530 bp 之間 有一條預期片段，以及在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；
Lane 6、7 為 CaRHD3雙套基因剔除株 (Carhd3::FRT/Carhd3::FRT efg1/efg1 cph1/cph1) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；
Lane 1、2 分別為圖二十二<B>之 Lane 2 及 8，CaRHD3 單套基因回 復株 (Carhd3::FRT/Carhd3::CaRHD3 efg1/efg1 cph1/cph1)，在 4268 bp 和 3530 bp 之間有一條高於 Parental strain HLC54 的預期片段，以及
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Lane 4、5 為 CaRHD3 單套基因剔除株 (CaRHD3/Carhd3::FRT
efg1/efg1 cph1/cph1) 在低於 3530 bp 之間有一條預期片段，以及在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 6、7 為 CaRHD3雙 套基因剔除株 (Carhd3::FRT/Carhd3::FRT efg1/efg1 cph1/cph1) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 1、2分別為圖二十 二<B>之 Lane 2 及 8， CaRHD3 單套基因回復株
(Carhd3::FRT/Carhd3::CaRHD3 efg1/efg1 cph1/cph1) 在 4268 bp 和 3530 bp 之間有一條高於 Parental strain HLC54 的預期片段，以及在 轉漬、雜交和免疫偵測後，如圖二十五<A>所示，預期 Wild-type allele 會得到片段 2045 bps、CaGRE2 knock-out allele 會得到片段 1.4 kbp。