使用EPICENTRE○R Biotechnologies 的產品 MasterPureTM Yeast
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DNA Purification kit (Cat. Nos. MPY80010 and MPY80200) 抽取 gDNA。
操作方法如下： DNA polymerase system。做法是將一半的 dNTP 以 DIG labeling dNTP mix 取代。在 200 μl 微量離心管中混合以下材料：約 300~500 ng Template DNA、5 μl 10 X DreamTaq DNA Polymerase Buffer、2.5 μl DIG DNA labeling mix、2 μl 2.5 mM dNTP mix、0.5 μl 50 mM primer、0.25 μl DreamTaq DNA Polymerase (2 unit/μl)，補無菌二次水至總體積為 50 μl。
PCR 溫度設定：
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準備一張比膠大的 Nylon membrane (GENESCREEN PLUSTM
HYBRIDIZATION TRANSFER MEMBRANE Lot Number: 668634) ，同樣以 2 X SSC 泡濕備用。依照轉漬槽說名片架設，首先在 STACK TRAY 中央 堆疊擦手紙，依序往上平放四張乾燥的 3MM 濾紙、一張濕的 3MM
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濾紙、Nylon Membrane、將膠體小心放置於 Nylon Membrane 上，
排除氣泡，再覆蓋三張濕的 3MM 濾紙；將 BUFFER TRAY 組裝後， 的 DIG FastHy 中，放置於 65°C HYBRIDIZATION WATER BATH，震盪一 個小時。之後將 nylon membrane 泡入 Low Stringency buffer (0.5 X
32 均勻加入 2 ml CDP-STAR○R (Chemiluminescence Reagent Lot. 0706013)。
小心覆蓋資料夾，室溫靜置 5 分鐘，放置於 37°C 培養箱中避光反 應 15 分鐘，之後在暗房進行壓片。將底片隔著投影片放置於 nylon membrane 上，待感光適當時間之後，放入洗片機中，沖洗後的底片 即可永久保存。
3.15 突變株之性狀分析 (Characterization) 3.15.1 生長曲線之測定 (Growth curve)
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3.16 CLSI Broth Microdilution Method 3.16.1 藥盤配製
首先將實驗所需的藥物 Amphotericin B、Miconazole、Fluconazole、
Voriconazole 溶於有機溶劑 dimethyl sulfoxide (DMSO) 中，而
Micafungin 溶於無菌二次水並過 0.22 μm filter。使用 RPMI 1640（無 bicarbonate 及含 glutamine 與酸鹼指示劑）的培養基來稀釋藥物配 成本實驗使用最高藥物濃度的二倍濃度：Fluconazole (128 mg/l)、
Amphotericin B (32 mg/l)、Voriconazole (16 mg/l)、Miconazole (4 mg/l)、
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Micafungin (2 mg/l)。接著將每一種藥物進行序列稀釋，最終配成十個 濃度，藥物範圍分別是Fluconazole (0.25~128 ug/ml)，Amphotericin B (0.0625~32 ug/ml)，Voriconazole (0.0313~16 ug/ml)，Miconazole (0.0078~4 ug/ml)，Micafungin (0.0039~2 ug/ml)。分別在 96 孔盤第一 到第十一個孔盤加100 μl，第十二個孔盤加入 200 μl RPMI 1640 作為 控制組 blank (此孔盤不加菌液)。
3.16.2 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 偵測各突變株相 較於 Parental strain 之藥物敏感性的變化
根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute) 所建議的 M27-A3 的修編版本進行實驗 (CLSI, 2008)。配製適量 RPMI 1640 broth、無菌 0.85 % NaCl，置於 1 liter 的 血清瓶中，並裝上分注器置於4°C 冰箱中備用。
DAY 1: 自-80°C 冰箱取出本實驗中之 mutant construction
(Heterozygote、Homozygote、Rescued strain)、parental strain (CaRHD3 為HLC54，其餘為 SC5314)、negative control (CaRHD3 為 SC5314，其 餘為HLC54)，以及控制組 YLO6 (ATCC® 6258)，YLO7 (ATCC® 22019)，
YLO12 (ATCC® 90028)。用竹棒挖取少許菌液，塗抹在 SDA 培養基，35°C、
24 小時。準備所需數量之 12 × 75 mm 玻璃試管，以標示筆標示待測
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回 35°C 培養箱繼續再培養 24 小時。
Day 4: 讀取培養 48 小時菌液生長濃度。
37 命名為 pSAT1-ORF19.6586-AB。如圖八<B>預計將 CaORF19.6586 基 因剔除約 45%。
4.1.2 質體 pSAT1-ORF19.6586-AB 序列分析
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39 養基進行 replica plating，選擇在不含藥物 nourseothricin 培養基上 生長的菌落，進行存菌和萃取 genomic DNA。同樣利用引子 O-preA 和 OBR 進行PCR，如果有成功將另一套 ORF19.6586 置換掉以及 cassette 剔除，預計只會得到片段 824 bp。以圖十一<C>電泳圖所示，
Lane 3~5 在 1 kbp 及 750 bp 之間得到一條預期片段，命名為
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泳圖結果顯示，Lane 1、2、4、5、7、9 及 10 在 3 Kbp 和 4 Kbp 之 間有一條片段；在 2 Kbp 和 2.5 Kbp 之間有一條片段；以及在 1.5 kbp 和 1 kbp 左右各有一條片段，合乎預期。將質體命名為
pSAT1-ORF19.6586-resB-1、2、4、5、7、9 及 10。
4.1.5 質體 pSAT1-ORF19.6586Res 序列分析
在質體 pSAT1-ORF19.6586-resB 中，以 PCR 合成
CaORF19.6586 的 ORF，之後將送進 ORF19.6586 雙套剔除株，作單 套基因回復的功能，故需定序確認合成的 CaORF19.6586 序列無誤。
如圖十三<A>所示，設計定序引子 OS1、OS2、OS3 及 OS4。質體 pSAT1-ORF19.6586-resB-5 比對結果，以 Candida Genome Database (CGD) 上之序列 CaORF19.6586 作為比對樣本。比對結果從 DNA 起 YPD 培養基進行 replica plating，挑擇在不含藥物 nourseothricin 培 養基上生長的菌落，進行存菌和萃取 genomic DNA；同樣利用引子 OAF 和 O-proB 進行 PCR，如果有成功將一套 ORF19.6586 置換進去 以及 cassette 剔除 (最後 rescued allele 會比 wild-type allele 多一
41 免疫偵測後，如圖十五<A>所示，預期 CaORF19.6586 wild-type allele 會得到片段 3724 bp、CaORF19. 6586 knock-out allele 會得到片段
(Caorf19.6586::FRT/Caorf19.6586::FRT) 在低於 3530 bp 處有一條預 期片段；Lane 1、2 為 CaORF19.6586 單套基因回復株 (Caorf19. CaORF19.5686 wild-type allele 會得到片段 1885 bp、CaORF19.6586 knock-out allele 會得到片段 1446 bp 和 CaORF19.6586 rescued allele
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會得到片段 2208 bp。以圖十六<B>底片結果所示，Lane 3 野生株 SC5314 (wild-type) 在低於 1904 bp 有一條預期片段；Lane 4、5 為 CaORF19.6586 單套基因剔除株 (CaORF19. 6586/Caorf19. 6586::FRT) 在低於 1904 bp 有一條預期片段和 1584 bp 及 1375 bp 之間有一 條預期片段；Lane 6、7 為 CaORF19. 6586 雙套基因剔除株 (Caorf19.
6586::FRT/Caorf19. 6586::FRT) 在 1584 bp 及 1375 bp 之間有一條預 期片段；Lane 1、2 為 CaORF19. 6586 單套基因回復株 (Caorf19.
6586::FRT/Caorf19. 6586::CaORF19. 6586) 在高於2927 bp 處有一條預 期片段，以及在 1584 bp 及 1375 bp 之間有一條預期片段。
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4.2.2 質體 pASATB 序列分析
如圖十八<A>所示，利用引子 PAS1 及 PAS2 進行定序分析，確 認 A region 有成功接合進 SAT1 flipper cassette 上游；以及利用引子 PBS1 及 PBS2 進行定序分析，確認 B region 有成功接合進 SAT1 flipper cassette 下游。如圖十八<B>定序結果顯示，在 A region 終點 有正確連結質體 pSFS2-SAT1 的預期序列；如圖十八<C>定序結果顯
nourseothricin 培養基上生長的菌落，進行存菌並萃取 genomic DNA。
同樣使用引子 HJL02557 和 LPCp-9R 進行 PCR，以圖十九<B>電泳圖
44 一條預期片段，依序命名為 RHD3HO9A~9E、RHD3HO10A~10D。
4.2.4 建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaRHD3 Open
45
RHD3HO9D/RHD3HO10D 中。以含有藥物 nourseothricin 的 YPD 培 養基篩選帶有 SAT1 flipper cassette 之菌株。再挑選較大顆菌落，培 養在 YP maltose 培養液中進行 pop-out，之後萃取 genomic DNA，
如圖二十二<A>所示，利用引子 HJL02557 和 HJL02558 進行 PCR，
在單套基因回復株中預期會得到片段 2.6 kbp 和 1.3 kbp，將符合預 期的菌株塗佈在 YPD 培養基進行 replica plating，挑擇在不含藥物 nourseothricin 培養基上生長的菌落，進行存菌和萃取 genomic DNA；
同樣利用引子 HJL02557 和 HJL02558 進行 PCR，如果有成功將一套 RHD3 置換進去以及 cassette 剔除 (最後 rescued allele 會比
Parental strain allele 多一個 B region 和 FRT 片段)，預計會得到片段 2.6 kbp 和 1.3 kbp。以圖二十二<B>電泳圖結果所示，Lane 2 及 8 在 2.5 Kbp 有一條預期片段，在 1.5 kbp 和 1 Kbp 之間有一條預期片段，
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雜交和免疫偵測後，如圖二十三<A>所示，預期 Parental strain allele 會得到片段 3367 bps、CaRHD3 knock-out allele 會得到片段 2.9 kbp 和 CaRHD3 rescued allele 會得到片段 3.9 kbp。以圖二十三<B>底片 結果所示，Lane 3 Parental strain (HLC54 efg1/efg1 cph1/cph1) 在低於 3530 bp 之間有一條預期片段；Lane 4、5 為 CaRHD3 單套基因剔除 株 (CaRHD3/Carhd3::FRT efg1/efg1 cph1/cph1) 在低於 3530 bp 之間 有一條預期片段，以及在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；
Lane 6、7 為 CaRHD3雙套基因剔除株 (Carhd3::FRT/Carhd3::FRT efg1/efg1 cph1/cph1) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；
Lane 1、2 分別為圖二十二<B>之 Lane 2 及 8，CaRHD3 單套基因回 復株 (Carhd3::FRT/Carhd3::CaRHD3 efg1/efg1 cph1/cph1)，在 4268 bp 和 3530 bp 之間有一條高於 Parental strain HLC54 的預期片段，以及
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Lane 4、5 為 CaRHD3 單套基因剔除株 (CaRHD3/Carhd3::FRT
efg1/efg1 cph1/cph1) 在低於 3530 bp 之間有一條預期片段，以及在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 6、7 為 CaRHD3雙 套基因剔除株 (Carhd3::FRT/Carhd3::FRT efg1/efg1 cph1/cph1) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 1、2分別為圖二十 二<B>之 Lane 2 及 8， CaRHD3 單套基因回復株
(Carhd3::FRT/Carhd3::CaRHD3 efg1/efg1 cph1/cph1) 在 4268 bp 和 3530 bp 之間有一條高於 Parental strain HLC54 的預期片段，以及在 轉漬、雜交和免疫偵測後，如圖二十五<A>所示，預期 Wild-type allele 會得到片段 2045 bps、CaGRE2 knock-out allele 會得到片段 1.4 kbp。
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次利用南方點墨法對之後預計進行性狀分析的 CaGRE2 各突變株作 確認；預期 Wild-type allele會得到片段 3013 bps、CaGRE2 knock-out allele 會得到片段 2.4 kbp。以圖二十六<B>底片結果所示，Lane 1
(Caorf19.173::FRT/Caorf19.173::CaORF19.173) 在 4973 bp 和 4268 bp 之間有一條高於 Wild-type allele 的預期片段，以及在 1584 bp 和
49 knock-out allele 會得到片段 2 kbp；CaORF19.173 rescued allele 會得 到片段 5.3 kbp。以圖二十八<B>底片結果所示，Lane 4 Wild-type (SC5314) 在4973 bp 附近有一條預期片段；Lane 5、6 為 CaORF19.173 單套基因剔除株 (CaORF19.173/Caorf19.173::FRT) 在 4973 bp 附近 有一條預期片段，以及在 2027 bp 上方有一條預期片段；Lane 7~9 為 CaORF19.173 雙套基因剔除株 (Caorf19.173::FRT/Caorf19.173::FRT) 在 2027 bp 上方有一條預期片段；Lane 1~3 為 CaORF19.173 單套基 因回復株 (Caorf19.173::FRT/Caorf19.173:: CaORF19.173) 在高於5148 bp 有一條預期片段，以及在 4973 bp 附近有一條預期片段。 2827 bp、CaORF19.7310 knock-out allele 會得到片段 1469 bp 和 CaORF19.7310 rescued allele 會得到片段 3431 bp。以圖二十九<B>底 片結果所示，Lane 4 Wild-type strain (SC5314) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 5、6 為 CaORF19.7310 單套基因剔除株 (CaORF19.7310/Caorf19.7310::FRT) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一
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條預期片段，以及在 1584 bp 和1375 bp 之間有一條預期片段；Lane 7~9 為 CaORF19.7310雙套基因剔除株
(Caorf19.7310::FRT/Caorf19.7310::FRT) 在 1584 bp 和 1375 bp 之間 有一條預期片段；Lane 1~3 為 CaORF19.7310 單套基因回復株 (Caorf19.7310::FRT/Caorf19.7310::CaORF19.7310) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條高於 wild-type 的預期片段，以及在 1584 bp 和 1375 bp 之間有一條預期片段。
如圖三十<A>所示，利用同樣引子 7-preA 和 7-AR 合成探針，
並且選擇限制酶 Bsa BI 作用於 genomic DNA，再一次利用南方點墨 法對之後預計進行性狀分析的 CaORF19.7310 各突變株作確認；預期 Wild-type allele 會得到片段 4374 bps、CaORF19.7310 knock-out allele 會得到片段 2.5 bp 和 CaORF19.7310 rescued allele 會得到片段 ~5 kbp。以圖三十<B>底片結果所示，Lane 4 Wild-type strain (SC5314) 在 4973 bp 和 4268 bp 之間有一條預期片段；Lane 5、6 為
CaORF19.7310 單套基因剔除株 (CaORF19.7310/Caorf19.7310::FRT) 在 4973 bp 和 4268 bp 之間有一條預期片段，以及在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 7~9 為 CaORF19.7310雙套基因 剔除株 (Caorf19.7310::FRT/Caorf19.7310::FRT) 在 3530 bp 和 2027 bp 之間有一條預期片段；Lane 1~3 為 CaORF19.7310 單套基因回復 株 (Caorf19.7310::FRT/Caorf19.7310::CaORF19.7310) 在 5148 bp 和 4973 bp 之間有一條預期片段，以及在 3530 bp 和 2027 bp 之間有 一條預期片段。
4.4 白色念珠菌 CaORF19.6586 和 CaRHD3 各突變株之性狀分 析
4.4.1 於 YPD 培養液中觀測生長曲線之結果
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圖三十一<A>為 CaORF19.6586 各突變株 OD600nm 吸光值記錄 三次數據取平均之後作圖的結果，SC5314 (wild-type)、HLC54
(cph1/cph1 efg1/efg1) 作為對照組，比較 CaORF19.6586 單套基因突 變株 HE1、HE2 (CaORF19.6586/Caorf19.6586::FRT)、雙套基因突變 株 HO1、HO2 (Caorf19.6586:FRT/Caorf19.6586::FRT) 和單套基因回復 株 RE2、RE3 (Caorf19.6586::FRT/Caorf19.6586::CaORF19.6586) 在 YPD 培養液於 30 °C 靜置培養 24 H 之生長情形；圖三十一<B>為 據取平均之後作圖的結果，SC5314 (wild-type)、HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為對照組，比較 CaRHD3 單套基因突變株 HE9、HE10 (CaRHD3/Carhd3::FRT)、雙套基因突變株 HO9D、HO10D
(Carhd3:FRT/Carhd3::FRT) 和單套基因回復株 RE928-8、RE109-10 (Carhd3::FRT/Carhd3::CaRHD3) 在 YPD 培養液於 30 °C 靜置培養 24
52 CaORF19.6586 各突變株之菌落型態與其 Parental strain SC5314 皆 呈皺褶表面；而圖三十四<B>實驗組 CaRHD3 各突變株之菌落型態與 Parental strain SC5314 皆有放射狀菌絲生成；而圖三十五<B>實驗組 CaRHD3 各突變株之菌落型態與其 Parental strain HLC54 皆呈圓形光
53 株對藥物之敏感性 (Drug susceptibilities test)
依據 CLSI M27-S3 描述控制組 YLO6、YLO7、YLO12 在各藥物之 MIC 範圍 (Miconazole 未有資料)，確保實驗操作。參考 CLSI M27-A3 配置十個梯度的藥物濃度：Fluconazole 為 0.125~64 μg/ml、
Amphotericin B 為 0.0313~16 μg/ml、Voriconazole 為 0.0156~8 μg/ml、
Miconazole 為 0.0078~4 μg/ml(Robert M. Bannatyne et al., 1978)、
Micafungin 為 0.0039~4 μg/ml。
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CaORF19.173 如圖四十<A>所示，對於 Fluconazole 各 mutant 菌株與野生株 SC5314 趨勢相同；圖四十<B>所示，對於 Amphotericin
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CaORF19.7310 如圖四十一<A>所示，對於 Fluconazole
CaORF19.7310 HO1 在濃度0.125~2 μg/ml 之間的感受性與野生株 SC5314 不同，之後趨勢相同，其餘 mutant 菌株與野生株 SC5314 趨
CaORF19.7310 HO1 在濃度0.125~2 μg/ml 之間的感受性與野生株 SC5314 不同，之後趨勢相同，其餘 mutant 菌株與野生株 SC5314 趨