國
立 交 通 大 學
分子醫學與生物工程研究所
碩士論文
探討剔除白色念珠菌
ORF19.6586 及 RHD3 之
型態變化及藥物敏感性之影響
Studying the effect of null mutations on ORF19.6586 and RHD3
on morphogenesis and drug susceptibilities of Candida albicans
研究生
: 劉佩柔
指導教授
: 楊昀良博士
探討剔除白色念珠菌
ORF19.6586 及 RHD3 之型態變化及
藥物敏感性之影響
Studying the effect of null mutations on ORF19.6586 and RHD3
on morphogenesis and drug susceptibilities of Candida albicans
研 究 生：劉佩柔
Student：Pei-Jou Liu
指導教授：楊昀良
Advisor：Yun-Liang Yang
國立交通大學 分子醫學與生物工程研究所 碩士論文 A ThesisSubmitted to Institute of Molecular Medicine and Bioengineering National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of
Master In
Molecular Medicine and Bioengineering September 2012
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
中華民國一○一年十月
i
摘要
白色念珠菌為一種存在於人體中共生的伺機性病原菌。目前研究 已知白色念珠菌的型態轉變的能力和致病力是有相關性，而在實驗室 前人利用基因表現比對 (gene profiling) 篩選出受 transcription factor Cph1p 及 Efg1p 調控之下游基因 CaORF19.6586 及 CaRHD3，利用
SAT1 flipper cassette 進行同源重組方式置換目標基因，並將單套基因
重新置入雙套基因剔除株進行基因補救，接著跟前人構築之 GRE2、
ORF19.173、ORF19.7310 的突變株一起分析其形態及藥物的感受性。
結果顯示雖然各基因突變株在型態變化上與其 parental strain 沒有 差異，但在藥物感受性與其 parental strain 相比皆是呈現較為不敏感 的表現，因此這些基因的活性與藥物感受性相關。
ii
Abstract
The opportunistic fungus Candida albicans is commensal in human. The ability of Candida albicans to switch between yeast and hyphal forms is implicated in its pathogenicity. Previous study shows that
CaORF19.6586 and CaRHD3, selected by gene profiling are regulated by
transcription factors Cph1p and Efg1p.
First, I used SAT1 flipper cassette system to construct homologous recombination to displace target genes CaORF19.6586 and CaRHD3, and then reinserted a single wild-type allele into the homozygous knock-out strain to construct rescued strains. Together with the constructed stains for CaGRE2, CaORF19.173 and CaORF19.7310, I then analyzed the
mutation effects on morphogenesis and drug susceptibilities. The results indicated that there were no different on morphogenesis but the
knockout mutants were less susceptible to drugs. So the activity of these genes is related to drug susceptibility.
iii
致謝
首先感謝我的指導教授小楊老師，使我學習到符合邏輯性的判讀結果， 並且清楚表達出來，同時自己也可以達到了解實驗目的為何，使我受 益良多。感謝國衛院羅老師的細心教導，使我明白對於實驗操作上必 須十分細心，才能妥善利用資源完成實驗。感謝口試委員：藍忠昱老 師、林苕吟老師所提供的意見，引導我思考對於實驗結果判斷有更多 的可能性以及方向，並且指正我有所缺失的部分，使得我的論文更臻 完美。感謝國衛院助理德彬、思璇、志兆、琬立、盈之在我到國衛院 六個多月的時間裡的照顧以及實驗上的幫助，真的很高興認識你們！ 感謝實驗室的大家，超帥的酷哥其實人很好，小倩有條理的安排實驗 是我學習的對象，阿大好大隻蹦蹦跳跳的一起玩耍好開心，洪優永遠 是小楊家的一姊無可取代，有甚麼不懂的問幸璇就對了，長得很像教 授的重哥總是默默地去除霜，常常幫大家訂飲料的凱薩解夏天的渴， 心思細膩的阿賢想太多小心你的頭，小善姊姊美食通是飛遜的指標， 常常幫我很多的小氣其實很大方，實驗室的電腦救星~春榮，以及學 弟妹們好好將 Candida 組好好發揚光大唷！還有大學部的女籃成員 們，謝謝你們讓我有運動沒有變胖還一起出征比賽，讓我的碩士生 活多采多姿！還有嘉大的學長姐、同學、學弟妹們給我的加油打氣， 以及朱老師點醒我的每一盞明燈，我都珍惜著。最後感謝在天上來不 及親眼看著我畢業的爺爺，感謝您的保佑讓我的實驗順利完成，以及 我的家人總是默默地支持我，我愛你們！iv
目錄
一、緒論 ... 1 1.1 白色念珠菌 ... 1 1.2 型態轉變、致病機制與抗藥性之關聯 ... 1 1.3 常用臨床真菌藥物種類及抗藥機制 ... 4 1.4 篩選標記之介紹 ... 5 1.5 本論文之研究目的... 6 1.5.1 CaORF19.6586 基因之相關探討 ... 6 1.5.2 CaORF19.5305 (RHD3) 基因之相關探討 ... 7 1.5.3 CaORF19.3150 (GRE2) 基因之相關探討 ... 8 1.5.4 CaORF19.173 基因之相關探討 ... 8 1.5.5 CaORF19.7310 基因之相關探討 ... 9 二、材料與儀器 ... 10 2.1 菌株 ... 10 2.2 質體 ... 11 2.3 引子 ... 11 2.4 化學藥品 ... 14 2.5 緩衝溶液與試劑 ... 16 2.6 酵素 ... 18 2.7 培養基配置 ... 18 2.8 儀器設備 ... 19 三、方法與步驟 ... 223.1 質體 DNA (plasmid DNA) 的萃取... 22
v
3.2.1 一般 PCR 反應 ... 22
3.2.2 Rescued CaORF19.6586 及 CaRHD3 PCR 反應 ... 23
3.3 大腸桿菌勝任細胞 (Competent cell) 的製備 ... 23 3.4 大腸桿菌勝任細胞的轉型 (Transfromation) ... 24 3.5 限制酶反應 (Enzyme digestion) ... 24 3.5.1 確定質體 DNA 片段大小之限制酶反應 ... 24 3.5.2 為 clone 所需之限制酶反應 ... 24 3.6 接合反應 (Ligation) ... 25
3.7 洋菜膠內之 DNA 萃取 (gel extraction) ... 25
3.7.1 結晶紫洋菜膠之製備 ... 25
3.7.2 洋菜膠內之 DNA 片段萃取 ... 25
3.8 白色念珠菌的轉型反應 (Transformation) ... 26
3.9 Maltose 誘發 SAT1 flipper cassette 之剔除 (pop-out) ... 27
3.10 複製平皿培養法 (Replica plating) ... 27 3.11 建構白色念珠菌單套基因剔除株 (Heterozygote) 及雙套基因剔 除株 (Homozygote) ... 27 3.12 建構白色念珠菌單套基因回復株 (Rescued strain) ... 28 3.13 白色念珠菌染色體 DNA 之萃取 ... 28 3.14 南方點墨法 ... 29
3.14.1 製備 DNA 探針 (DNA probe labeling) ... 29
3.14.2 轉漬 DNA (Transfer) ... 30
3.14.3 雜交反應 (Hybridization) ... 31
3.14.4 免疫偵測 (Detection)... 31
vi
3.15.1 生長曲線之測定 (Growth curve) ... 32
3.15.2 芽管試驗 (Germ tube assay) ... 33
3.15.3 誘發菌絲生長觀察型態變化 (Colony morphology) ... 33
3.15.4 侵犯力測試 (Invasion assay) ... 33
3.16 CLSI Broth Microdilution Method ... 33
3.16.1 藥盤配置 ... 33 3.16.2 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 偵測個突變珠相 較於 Parental strain 之藥物敏感性的變化 ... 34 四、結果 ... 37 4.1 建構 CaORF19.6586 單套、雙套基因剔除株和單套基因回復 株 ... 37
4.1.1 建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaORF19.6586 上 下游同源區域之質體 ... 37
4.1.2 質體 pSAT1-ORF19.6586-AB 序列分析 ... 37
4.1.3 建構 CaORF19.6586 單套、雙套基因剔除株 ... 38
4.1.4 建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaORF19.6586 Open Reading Frame (ORF) 之質體 ... 39
4.1.5 質體 pSAT1-ORF19.6586Res 序列分析 ... 40
4.1.6 建構 CaORF19.6586 單套基因回復株 ... 40
4.1.7 南方點墨法 (Southern blot) 檢驗 CaORF19.6586 各突變株 ... 41
4.2 建構 CaRHD3 單套、雙套基因剔除株和單套基因回復株 ... 42
4.2.1 建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaRHD3 上下游 同源區域之質體 ... 42
vii
4.2.2 質體 pASATB 序列分析 ... 43
4.2.3 建構 CaRHD3 單套、雙套基因剔除株 ... 43
4.2.4 建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaRHD3 Open Reading Frame (ORF) 之質體 ... 44
4.2.5 質體 pRHD3r 序列分析 ... 45
4.2.6 建構 CaRHD3 單套基因回復株 ... 45
4.2.7 南方點墨法 (Southern blot) 檢驗 CaRHD3 各突變株 ... 46
4.3 確認前人已建構之單套、雙套基因剔除株及單套基因回復株 ... 47
4.3.1 南方點墨法 (Southern blot) 檢驗 CaGRE2 各突變株 ... 47
4.3.2 南方點墨法 (Southern blot) 檢驗 CaORF19.173 各突變株 48 4.3.3 南方點墨法 (Southern blot) 檢驗 CaORF19.7310 各突變株 ... 49
4.4 白色念珠菌 CaORF19.6586 和 CaRHD3 各突變株之性狀分析 . 50 4.4.1 於 YPD 培養液中觀測生長曲線之結果 ... 50
4.4.2 芽管試驗 (Germ tube assay) ... 51
4.4.3 誘發菌絲生長觀察型態變化 – 含 4 % FBS 之 YPD 培養基 之性狀分析 ... 52 4.4.4 誘發菌絲生長觀察型態變化 – 含 4 % FBS 之 Bacto agar 培 養基之性狀分析 ... 52 4.4.5 侵犯力測試 (Invasion assay) ... 52 4.4.6 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測試各突變株對藥 物之敏感性 (Drug susceptibilities test) ... 53
五、討論 ... 56
viii 5.1.1 生長情形之探討... 57 5.1.2 芽管試驗之探討 ... 57 5.1.3 含 4 % FBS 之 YPD 培養基菌落型態之探討 ... 58 5.1.4 含 4 % FBS 之 Bacto agar 培養基菌落型態之探討 ... 58 5.1.5 侵犯力測試之探討 ... 58 5.1.6 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測試各突變株對藥 物之敏感性 (Drug susceptibilities test) 的探討 ... 58
5.2 剔除 CaRHD3 的探討 ... 59 5.2.1 生長情形之探討... 59 5.2.2 芽管試驗之探討 ... 59 5.2.3 含 4 % FBS 之 YPD 培養基菌落型態之探討 ... 60 5.2.4 含 4 % FBS 之 Bacto agar 培養基菌落型態之探討 ... 60 5.2.5 侵犯力測試之探討 ... 60 5.2.6 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測試各突變株對藥 物之敏感性 (Drug susceptibilities test) 的探討 ... 61
5.3 CaGRE2 的探討 ... 61
5.3.1 以南方墨點法檢驗 CaGRE2 各突變株之建構 ... 61
5.3.2 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測試各突變株對藥 物之敏感性 (Drug susceptibilities test) 的探討 ... 61
5.4 CaORF19.173 的探討 ... 62
5.4.1 以南方墨點法檢驗 CaORF19.173 各突變株之建構 ... 62
5.4.2 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測試各突變株對藥 物之敏感性 (Drug susceptibilities test) 的探討 ... 62
ix
5.5.1 以南方墨點法檢驗 CaORF19.7310 各突變株之建構 ... 62
5.5.2 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測試各突變株對藥 物之敏感性 (Drug susceptibilities test) 的探討 ... 63
5.6 結語 ... 63
5.7 未來展望 ... 64
x
圖表目錄
圖一：SAT1 flipper cassette 示意圖 ... 73 圖二：CaOrf19.6586p 胺基酸與 Candida dubliniensis CD36
XP_002421346 胺基酸在 NCBI 資料庫中的比對結果 ... 74 圖三：CaOrf19.6586p 胺基酸與啤酒酵母菌 ScYjr115p 胺基酸在 NCBI 資料庫中的比對結果 ... 75 圖四：CaRHD3p 胺基酸與 Candida dubliniensis CD36 未知 Cell wall
protein 胺基酸在 NCBI 資料庫中的比對結果 ... 76 圖五：CaGRE2p 胺基酸與啤酒酵母菌 ScGre2p/YOL151Wp 胺基酸在
NCBI 資料庫中的比對結果 ... 77 圖六：CaORF19.173p 胺基酸與啤酒酵母菌 ScAzf1p 胺基酸在 NCBI
資料庫中的比對結果 ... 78 圖七：CaORF19.7310p 胺基酸與啤酒酵母菌 ScMsc1p/YML128C 胺基 酸在 NCBI 資料庫中的比對結果 ... 79 圖八：建構白色念珠菌基因剔除株流程示意圖 ... 80 圖九：以限制酶確認質體 pSAT1-ORF19.6586-B 和 pSAT1-ORF19.6586AB ... 82 圖十：質體 pSAT1-ORF19.6586AB 序列分析結果 ... 84 圖十一：以 PCR 確認 CaORF19.6586 單套及雙套基因剔除株 ... 86 圖十二：建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaORF19.6586
Open Reading Frame (ORF) 之質體 ... 88 圖十三：質體 pSAT1-ORF19.6586-resB 中 CaORF19.6586 序列分析結
果 ... 90 圖十四：以 PCR 確認 CaORF19.6586 單套基因回復株 ... 91
xi 圖十五：南方點墨法檢驗 CaORF19.6586 各突變株 ... 92 圖十六：南方點墨法二次檢驗 CaORF19.6586 各突變株 ... 93 圖十七：以限制酶 Eco RI 作用於質體 pASATB ... 94 圖十八：質體 pASATB 序列分析結果 ... 97 圖十九：以 PCR 確認 CaRHD3單套及雙套基因剔除株 ... 99
圖二十：建構含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaRHD3 Open Reading Frame (ORF) 之質體 ... 101
圖二十一：質體 pRHD3r 序列分析結果 ... 103 圖二十二：以 PCR 確認 CaRHD3 單套基因回復株 ... 104 圖二十三：南方點墨法檢驗 CaRHD3 各突變株 ... 105 圖二十四：南方點墨法二次檢驗 CaRHD3 各突變株 ... 106 圖二十五：南方點墨法檢驗 CaGRE2 各突變株 ... 107 圖二十六：南方點二次墨法檢驗 CaGRE2 各突變株 ... 108 圖二十七：南方點墨法檢驗 CaORF19.173 各突變株 ... 109 圖二十八：南方點墨法二次檢驗 CaORF19.173 各突變株 ... 110 圖二十九：南方點墨法檢驗 CaORF19.7310 各突變株 ... 111 圖三十：南方點墨法二次檢驗 CaORF19.7310 各突變株 ... 112 圖三十一：CaORF19.6586 各突變株在 YPD 培養液於 30°C 靜置培養 24 H 之生長情形 ... 114 圖三十二：CaRHD3 各突變株在 YPD 培養液於 30°C 靜置培養 24 H 之生長情形 ... 116 圖三十三：芽管試驗之結果 ... 117 圖三十四：在含有 4 % FBS 之 YPD 培養基於 37°C 培養三天之菌落型 態 ... 118
xii
圖三十五：在含有 4 % FBS 之 Bacto agar 培養基於 37°C 培養七天之 菌落型態 ... 119 圖三十六：侵犯力測試之結果 ... 121 圖三十七：<A> 測試 CaORF19.6586 對 Fluconazole 在十種濃度於
35°C 培養 48 H 之結果 ... 122 圖三十七：<B> 測試 CaORF19.6586 對 Amphotericin B 在十種濃度 於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 123 圖三十七：<C> 測試 CaORF19.6586 對 Voriconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 124 圖三十七：<D> 測試 CaORF19.6586 對 Miconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 125 圖三十七：<E> 測試 CaORF19.6586 對 Micafungin 在十種濃度於
35°C 培養 24 H 之結果 ... 126 圖三十八：<A> 測試 CaRHD3 對 Fluconazole 在十種濃度於 35°C 培
養 48 H 之結果 ... 127 圖三十八：<B> 測試 CaRHD3 對 Amphotericin B 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 128 圖三十八：<C> 測試 CaRHD3 對 Voriconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 129 圖三十八：<D> 測試 CaRHD3 對 Miconazole 在十種濃度於 35°C 培 養 48 H 之結果 ... 130 圖三十八：<E> 測試 CaRHD3 對 Micafungin 在十種濃度於 35°C 培
養 24 H 之結果 ... 131 圖三十九：<A> 測試 CaGRE2 對 Fluconazole 在十種濃度於 35°C 培
xiii 養 48 H 之結果 ... 132 圖三十九： <B> 測試 CaGRE2 對 Amphotericin B 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 133 圖三十九：<C> 測試 CaGRE2 對 Voriconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 134 圖三十九：<D> 測試 CaGRE2 對 Miconazole 在十種濃度於 35°C 培 養 48 H 之結果 ... 135 圖三十九：<E> 測試 CaGRE2 對 Micafungin 在十種濃度於 35°C 培
養 24 H 之結果 ... 136 圖四十：<A> 測試 CaORF19.173 對 Fluconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 137 圖四十：<B> 測試 CaORF19.173 對 Amphotericin B 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 138 圖四十：<C> 測試 CaORF19.173 對 Voriconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 139 圖四十：<D> 測試 CaORF19.173 對 Miconazole 在十種濃度於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 140 圖四十：<E> 測試 CaORF19.173 對 Micafungin 在十種濃度於 35°C
培養 24 H 之結果 ... 141 圖四十一：<A> 測試 CaORF19.7310 對 Fluconazole 在十種濃度於
35°C 培養 48 H 之結果 ... 142 圖四十一：<B> 測試 CaORF19.7310 對 Amphotericin B 在十種濃度
於 35°C 培養 48 H 之結果 ... 143 圖四十一：<C> 測試 CaORF19.7310 對 Voriconazole 在十種濃度於
xiv
35°C 培養 48 H 之結果 ... 144 圖四十一：<D> 測試 CaORF19.7310 對 Miconazole 在十種濃度於
35°C 培養 48 H 之結果 ... 145 圖四十一：<E> 測試 CaORF19.7310 對 Micafungin 在十種濃度於
xv 附圖目錄 附圖一：抗真菌藥物的作用機制簡圖 ... 147 附圖二：Echinocandin 類藥物作用機制 ... 148 附圖三：白色念珠菌麥角固醇生合成途徑 ... 149 附圖四：細胞倍增時間計算公式 ... 150
1
一、 緒論
1.1 白色念珠菌 (Candida albicans) 白色念珠菌為雙倍體 (diploid) 且伺機性感染之病原真菌，共生 於人體口腔、皮膚、消化道及生殖道黏膜。當受藥物作用影響而導致 體內微生物菌相改變或人體免疫力低落時，白色念珠菌極有可能伺機 侵犯宿主，輕則鵝口瘡、陰道炎或甲溝炎等局部感染；重則使全身器 官造成系統性感染 (systemic infection) 威脅生命，尤其是對免疫功能 不全的病患，例如 AIDS 患者、癌症治療患者、器官移植患者或長期 服用抗生素之患者，所引發的念珠菌血症具有高達 35% 的死亡率 (Wenzel, 1995)。在台灣，目前院內感染的統計，真菌培養後分離出之 菌種中白色念珠菌所佔比例至少約一半且可高達60 % (Hsueh, et al., 2002)。然而，目前使用抗真菌的藥物並不多，且因受限於其活性範圍、對宿主造成毒性或副作用等而效用下降 (Groll et al., 1998; Jack,
1998)，以及使用的頻率增加，無形中篩選出具抗藥性的菌株 (Pfaller
et al., 2000; Bossche et al., 1994)。因此希望研究白色念珠菌中，與可
能造成伺機性感染的致病因子 (virulence factor) 相關的基因，連結抗
藥性相關的基因及其功能，以期作為日後研發專一性、低毒性以及低 副作用抗真菌藥物標的 (drug target) 之基礎 (Ernst, 2000; Garaizar et
al., 2006)。 1.2 型態轉變、致病機制與抗藥性之關聯 由於白色念珠菌是共生於人體之常在菌叢，但當宿主免疫系統與 病菌發生彼此之間失衡的情況時，病菌必須適應環境而產生相關致病 基因的表現，進而使病菌具有感染宿主且造成疾病的能力，這些基因 稱為毒力因子 (virulence factor)。文獻指出，當白色念珠菌受到外界
2
環境刺激時，能夠在酵母菌型態 (yeast form) 和絲狀型態
(filamentous form) 之間轉變，其中絲狀型態包含菌絲型 (hyphae form)
和假菌絲型 (pseudohyphae form)，而這樣的形態轉變已被視為是一
個重要的毒力因子 (Braun and Johnson, 1997; Lo et al., 1997)。已知誘
發型態轉變的因素包括：營養源、CO2、細胞密度及黏附情形 (Biswas
and Van Dijck et al., 2007)、N-acetylglucosamine (GlcNAc) (Mattia et al., 1982)、pH 值、溫度、血清 (Gow and Gooday, 1982)等。於實驗室培
養在含有血清、pH 值中性和 37°C 的條件下，能夠有效誘發菌絲型態
的生長 (Yang, 2003; Berman, 2006)。一般認為酵母菌型利於在體內散
播，而菌絲型則利於入侵；在黏膜表面共生之白色念珠菌多呈酵母菌
型，在人體免疫力下降時才會轉變為菌絲型入侵表面黏膜 (Brown et
al.,1999)。而調控型態轉變的訊息傳遞主要有 mitogen-activated
protein kinase (MAPK) pathway 及 cAMP-PKA pathway (Biswas and Van Dijck et al., 2007) 兩大路徑。在外界環境缺乏氮源 (Biswas and
Morschhauser, 2005)、存在氧化壓力 (oxidative stress) (Román et al., 2007) 和細胞的擁擠程度 (quorum sensing) (Sato et al., 2004) 都會經
由 MAPK pathway 來調控型態的轉變。其方式是經由一系列的磷酸化
反應將訊息傳給 transcription factor Cph1p (Liu et al., 1993) 來調控下
游基因的表現。研究指出，剔除 pathway 中任一基因或是 CPH1 都
會影響白色念珠菌在固態培養基中的菌絲生成 (Köhler and Fink,
1996)，但在血清的誘發下仍然有能力生長菌絲 (Román et al., 2007)。 而 cAMP-PKA pathway 已知在啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 白色念珠菌或其他種類的真菌中，在菌絲生長的調控上都扮演著重要 的角色 (Lengeler et al., 2000)。Pathway 主要包含了 cAMP-dependent protein kinase A (PKA) 和下游轉錄因子 Efg1p。cAMP 的表現增加或抑
3 制 cAMP phosphodiesterase 的活性，都能活化細胞由酵母菌型轉變 為菌絲型。白色念珠菌中兩個正向調控菌絲生成之 PKA：Tpk1p 和 Tpk2p，分別負責不同培養基的菌絲表現型；tpk1/tpk1 剔除株使白色 念珠菌喪失在固態培養菌絲生成的能力；tpk2/tpk2 剔除株則抑制白 色念珠菌在液態培養基上生長菌絲的能力 (Sonneborn et al., 2000;
Bockmuhl and Ernst, 2001; Cloutier et al., 2003)。活化的 PKA 藉由磷酸
化調控Efg1p 的活性，過量表現會刺激啤酒酵母 (S. cerecisiae) 形成
假菌絲型；但在白色念珠菌誘發菌絲生成時，表現量是下降的；但過
量表現又可促使白色念珠菌形成假菌絲，因此認為 EFG1 同時扮演著
transcription activator 和 repressor 的角色 (Stolddt, 1997)。而
efg1/efg1 剔除株會喪失於血清及 GlcNAc 誘發下形成芽管 (芽管為
菌絲早期的型態) 和菌絲的能力，但仍然可觀察到假菌絲的型態
(Biswas and Van Dijck et al., 2007)。另外，cph1/cph1 efg1/efg1 雙剔除 株會使白色念珠菌在大部分的培養條件下喪失菌絲和假菌絲生成的 能力，且對實驗小鼠也喪失系統性感染的能力，使小鼠死亡率大幅降
低 (Lo et al., 1997)。因此，CPH1 和 EFG1 下游所調控的基因和白色
念珠菌的型態轉變或是致病力有關。
另外，本實驗室先前利用抑制刪除雜交法
(Suppression Subtractive Hybridization, SSH) 來篩選和型態變化相關的
基因，找出長菌絲型 (SC5314) 與酵母菌型 (HLC54 基因型為 efg1/efg1 cph1/cph1) 兩者之間表現量不同的基因，若目標基因在兩 種型態中有所差異，則此基因可能與致病力或促進菌絲生長有關。篩 選結果中，包含了 ERG3 和 ERG11 這兩個麥角固醇生合成基因 (附 圖二) (蕭婷尹, 2006)，其功能之一是念珠菌對抗真菌藥物的感受性。 因此，型態變化/致病性途徑與藥物感受性是相關的。
4 1.3 常用臨床抗真菌藥物種類及抗藥機制 大多數抗真菌的藥物設計基礎，於作用在真菌細胞膜固醇類的主 要成分 – 麥角固醇之生合成路徑上，其成分和哺乳類細胞的膽固醇 相似，扮演維持真菌細胞膜的流動性及完整性，及影響一些膜上酵素 其蛋白質功能的穩定性；或是以非競爭型破壞細胞壁的主要成分 – (1,3)-β-D-glucan 之生合成路徑，使得細胞壁失去穩定性並對細胞體造 成壓力。以下就本實驗所使用三大類中的五種藥物做基本介紹： 一、 Polylene – 此類藥物主要作用於含麥角固醇的細胞膜上，代表 性藥物為 amphotericin B (以下簡稱為 AMB )。其作用方式為嵌 入細胞膜內，在細胞膜上形成通道，使得細胞膜的質子 (主要 是鉀離子梯度) 被破壞達到殺菌效果。(附圖一)。但受限於其和 劑量相關的腎毒性，所以此藥通常視為最後防禦線。 二、 Azole – 又可分成 Imidazole (代表藥物為 Fluconazole、
Voriconazole) 及 Triazole (代表藥物為 Miconazole) 兩類。作用
方式係經由抑制 cytochrome P450 系統的酵素
14-αdemethylase，受質 lansterol 則會受到 △5,6－desaturase (ERG3基因產物) 催化形成 3,6-diol 衍生物，此衍生物大量堆積 於體內，達到抑制真菌細胞膜上的主要成分麥角固醇之合成並 造成細胞毒性 (Sanglard and Odds, 2002)。(附圖一)
三、 Echinocandin – 破壞由 FKS1 轉錄的 (1,3)-β-D-glucan synthase
活性，抑制 (1,3)-β-D-glucan 的合成，使得細胞壁的結構支撐力
變弱，無法維持滲透壓而導致菌體破裂、死亡。代表藥物為 Micafungin。(附圖二)
5
菌而非殺菌，無形中篩選出具抗藥性的菌株。抗藥性真菌會利用以下 一種或一種以上的機制來達到抗藥目的：一、減少藥物在體內的累積。 包含了減低藥物的進入和增加藥物的排出，但藥物的進入體內機制未
明，而藥物排出是臨床上真菌抗藥最重要的因素之一，目前已知 ABC
transporter (CDR1、CDR2) 和major facilitator proteins (MDR1) 控制此
機制的膜蛋白輸出幫浦 (efflux pumps)，當其大量表現時，會促進藥
物的排出 (Sanglard et al., 2003a)。二、改變藥物標的酵素。包括藉由
大量表現、突變、改走其他代替途徑取代因藥物作用所阻斷的反應， 使真菌仍是可合成生長所需的物質。三、改變麥角固醇代謝途徑。四、 使藥物失去活性。經由抑制某些特定酵素的功能，這些酵素可以將沒 有活性的藥物轉化成有活性藥物，而達到使藥物失去活性的目的。或
真菌體內分泌酵素至細胞基質外降解藥物 (degradation)，使藥物結構
破壞而達到藥物失去活性的目的 (Ghannoum and Rice, 1999)。
1.4 篩選標記之介紹
本實驗使用質體 pSFS2-SAT1 中的 SAT1 flipper cassette 藥物篩
選標記作為基因剔除系統 (圖一)，可直接在野生株 SC5314 中剔除目
標基因，排除使用不同遺傳背景的菌株所造成的性狀影響 (Reuss et
al., 2004)。SAT1 flipper cassette 包含了由 ACT1 promoter 所調控表現
白色念珠菌基因 CaSAT1，基因產物轉譯出酵素 streptothrin
acetyltransferase 可使藥物 Nourseothricin 失活，在此為一藥物篩選
標記；及由 MAL2 promoter 調控的 CaFLP，當培養基添加 maltose
誘發 MAL2 promoter 表現下游基因 CaFLP，產生酵素 site-specific recombinase，並結合到 cassette 兩端的 FRT (minimal FLP
6
cassette pop-out 出 genome 中，只留下一個 34 bp 的 FRT 序列，減 少外來基因對白色念珠菌的影響 (Reuss et al., 2004; Ding and Bulter, 2007)。因此可再重複使用此篩選標記，將目標基因另一股 allele 剔 除；另外，在 cassette 上下游各包含一個 MCS (multiple cloning site) 利於 clone 的設計。
1.5 本論文之研究目的
先前本實驗室利用基因表現比對 (expression profiling) 比較白色
念珠菌野生株 SC5314、cph1/cph1 剔除株和 efg1/efg1 剔除株之間
下游基因的表現量，推測表現量不同的基因可能受轉錄因子 Cph1p
或 Efg1p 調控，也就是和菌絲生長相關。再利用 SAT1 flipper cassette
系統於野生株 SC5314 中將目標基因剔除，以觀察細胞生理型態是否 因此改變，連結上述推測。因此，本論文在胺基酸序列與哺乳類無序 列同源性、功能未知以及較少之文獻探討等的前提下，挑選出 CaORF19.6586 以及延續前人已在野生株 SC5314 中剔除之 CaRHD3、 CaGRE2、CaORF19.173、CaORF19.7310 等基因作為研究的目標。 1.5.1 CaORF19.6586 基因之介紹
CaORF19.6586 有 942 bp 轉譯出 313 個胺基酸。由 NCBI Blast
資料庫中比對結果，顯示出最相似的蛋白為 Candida dubliniensis CD36
XP_002421346 protein，如圖二所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 99%，其中 identity 為 61%，positive 為 72%。但 在Candida dubliniensis 中此相似蛋白功能未知。另外由 CGD (Candida genome database) 提供的文獻上得知此基因同源於酵母菌 SCYJR115 (Karababa et al., 2004)，有 510 bp 轉譯出 169 個氨基酸，在 NCBI Blast 資料庫中比對結果，顯示兩胺基酸相似度為 34%，其中 identity
7
為 41%，positive 為 59% (圖三)。但 SCYJR115 也是一個未知功能的
蛋白。另外由相關文獻歸納出幾點特性：在抗Azole 菌株中過表現
MDR1 或是在含有 Benomyl 的環境下，此基因的轉錄量會有增加的
趨勢 (Karababa et al., 2004)；也有文獻提到此基因會受到 nitric oxide 的誘導 (Hromatka et al., 2005)；另外在轉錄比對 (transcription
profiling) 中發現，剔除 ssn6 基因會有兩種 phenotype – 圓滑/皺褶，
而 CaORF19.6586 會受到圓滑表現型 up-regulate 的調控
(Garcı´a-Sa´nchez et al., 2005)。
1.5.2 CaORF19.5305 (RHD3) 基因之介紹
CaRHD3 有 615 bp 轉譯出 204 個胺基酸。由 NCBI Blast 資料
庫中比對結果，顯示出最相似的蛋白為Candida dubliniensis CD36 中
未知功能的 cell wall protein，如圖四所示，兩胺基酸相似度以 Query
coverage 表示為 100%，其中 identity 為 88%，positive 為 93%。
CaRHD3 是一個典型的 GPI-anchored protein，屬於細胞壁蛋白，藉由
β-1,6-glucan 連結到細胞壁上 (de Boer et al., 2010)，所以在對數期生
長的酵母菌型白色念珠菌的細胞壁中，Rhd3p 的表現量很高 (de
Groot et al., 2003)。CaRHD3 的表現量會受到型態轉變和鐵離子濃度
的影響；在血清誘發菌絲生成的條件下，CaRHD3 表現量下降 (de
Boer et al., 2010)；而在鐵離子濃度較高 (100 μM) 的情況下反而有較
高的表現量 (Lan et al., 2004)。在本實驗室前人的研究中，比較
CaRHD3 剔除株和野生株之間，於型態轉變方面、測試影響細胞膜和
細胞壁的化學物質反應 (ex: SDS、High concentration of NaCl、calcoflour white、β-1,6-glucanase、Zymolase) 和對上皮細胞的黏附力的實驗結 果皆無差別，但在對小鼠毒性跟野生株比起來有下降的趨勢。由於
8
Efg1p 下游所調控的基因之一 (林啟揚, 2001)，因此本實驗將會嘗試
在 HLC54 中剔除 CaRHD3，探討 CaRHD3 對型態轉變的影響。
1.5.3 CaORF19.3150 (GRE2) 基因之介紹
CaGRE2 有 1038 bp 轉譯出 345 個胺基酸。由 NCBI Blast 資
料庫中比對結果，與同源於酵母菌相似的蛋白為 SCGRE2p/YOL151Wp
，如圖五所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 98%，其 中 identity 為 39%，positive 為 62%。研究指出，CaGRE2 在低濃度
的鐵離子環境中表現量大幅提高 (Lan et al., 2004)；在轉錄比對
(transcription profiling) 中顯示 CaGRE2 受 Nrg1p 及 Tup1p 所調控 (Murad et al., 2001; Garcı´a-Sa´nchez et al., 2005)；在基因表現比對 (Gene expression profiling) 中顯示 CaGRE2 會受 benomyl
up-regulated (Karababa et al., 2004)。而 SCGRE2 基因目前已知有三大 功能：SCGRE2 會轉錄轉譯出具有 NADPH-dependent methylglyoxal reductase (D-lactaldehyde dehydrogenase) 的活性蛋白；在轉錄體學 (Transcriptome) 中分析，以 isoamyl alcohol 誘導菌絲生成的實驗中 證明SCGRE2 具有 isovaleraldehyde reductase 的活性；而在不同的壓 力來源 (osmotic、ionic、oxidative、heat shock 及 heavy metals) 的測
試下，會有不同程度上的基因表現 (Garay-Arroyo and Covarrubias,
1999; Vido et al., 2001)。
1.5.4 CaORF19.173 基因之介紹
CaORF19.173 有 3303 bp 轉譯出 1100 個胺基酸。由 NCBI
Blast 資料庫中比對結果，與同源於酵母菌相似的蛋白為 ScAzf1p (Asparagine-rich Zinc-finger)，如圖六所示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 39%，其中 identity 為 48%，positive 為 63%。
9
其表現 (Mark Ramsdale, et al.,2008)；由於蛋白質結構中含有典型
zinc finger 之區域，推測基因功能可能為 transcription factor 調控基 因的表現。
1.5.5 CaORF19.7310 基因之介紹
CaORF19.7310 有 2367 bp 轉譯出 788 個胺基酸。由 NCBI
Blast 資料庫中比對結果，與同源於酵母菌相似的蛋白為
ScMsc1p/YML128C (Meiotic Sister-chromatid recombination)，如圖七所
示，兩胺基酸相似度以 Query coverage 表示為 63%，其中 identity
為 29%，positive 為 51%。Scmsc1 剔除株影響減數分裂時期同源染
色體的重組作用 (Thompson and Stahl, 1999)；不過白色念珠菌未有已
知的有性世代，也無減數分裂期 (Bennett and Johnson, 2005)。但染
色期同源重組會發生在有絲分裂期及細胞 DNA 修補作用時期
(Graser et al., 1996; Sung and klen, 2006)，因此若重組作用發生在不適
當的時間和位置，導致染色體發生異質性缺失 (Loss of heterozygosity)
和重新排列 (rearrangement)，都可能造成白色念珠菌型態變異或抗
藥性的產生 (Rustchenkp-Bulgac et al., 1990; Forche et al., 2005; Chen
10
二、材料與儀器
2.1 菌株 (strain)(1) Escherichia coli (strain：DH5α)：
其基因型為supE44ΔlacU169 (Φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1。
(2) Candida albicans：
菌株 (Strain) 基因型
(Genotype)
來源
(Sources)
SC5314 Wild-type strain Gillum et al.,
1984; 本實驗室
SC5314B Wild-type strain Gillum et al.,
1984 HLC54 cph1/cph1 efg1/efg1 Lo et al., 1997 OHE1 OHE2 CaORF19.6586/Caorf19.6586::FRT 本實驗 OHO1 OHO2 Caorf19.6586::FRT/Caorf19.6586::FRT 本實驗 ORE2 ORE3 Caorf19.6586::FRT/ Caorf19.6586::CaORF19.6586 本實驗 RHD3HE9 RHD3HE10 CaORF19.5305/Caorf19.5305::FRT efg1/efg1 cph1/cph1 本實驗 RHD3HO9D RHD3HO10D Caorf19.5305::FRT/Caorf19.5305::FRT efg1/efg1 cph1/cph1 本實驗 RHD3R928-8 RHD3R109-10 Caorf19.5305::FRT/ Caorf19.5305::CaORF19.5305 efg1/efg1 cph1/cph1 本實驗
11 2.2 質體 (plasmid)
質體 (Plasmid) 描述 (Description) 來源 (Sources)
pSFS2 帶有SAT1 marker，可抗
nourseothricin。並含 CaFLP 及
MAL2p，可經 maltose 誘使 marker
從genome 中 pop-out。在 E. coli
中篩選標記為抗ampicillin。 (Reuß et al.,2004) pSAT1-ORF19.6586-B pSFS2 質體外接 CaORF19.6586 下游約 244 bp 的片段 本實驗 pSAT1-ORF19.6586-AB pSAT1-ORF19.6586-B 質體外接 CaORF19.6586 上游約 238 bp 的 片段 本實驗 pSAT1-ORF19.6586-Res pSAT1-ORF19.6586B 質體外接 CaORF19.6586 上游至下游約 999 bp 之片段，經定序確認包含
CaORF19.6586 open reading
frame 正確之序列。 本實驗 pRHD3r pSATB 質體外接 CaRHD3 上游 至下游約 1524 bp 之片段，經定 序確認包含 CaRHD3 open reading frame 正確之序列 本實驗 (pSATB 為陳 柏伶所建構) (陳柏伶，2009) 2.3 引子 (primer) 引子 序列5’~ 3’ 位置
12 OAF TTTGGGCCCCTATCACCACTTCTGCAATT Apa I CaORF19.6586 gene: -20~-1 OAR TTTCTCGAGCTAGAACTCTTCTGGGTGTTGG Xho I CaORF19.6586 gene: +223~+244 OBF AAACCGCGGCAATTGTACGTTCTAATTCTACC Sac II CaORF19.6586 gene: +743~+765 OBR AAAGAGCTCTCATAAGCCTGTCCATATCGTG Sac I CaORF19.6586 gene: +959~+980 O-preA TTTGGGCCCCACTCACTCACTCACTTACTC Apa I CaORF19.6586 gene: -300~-280
O-proB TTCCCCCAAAATCTTCTTGCTCTAACGTA CaORF19.6586
gene: +1332~+1360 O-resB TTTCTCGAGTCATAAGCCTGTCCATATCGT XhoI CaORF19.6586 gene: +959~+980
OS1 TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGG CaORF19.6586
gene: -193~-164
OS2 GTACCTTAGTCCTGAATCTTCAATGG CaORF19.6586
gene: +228~+253
OS3 TATTGCCATAGAAGCTACTATTCCT CaORF19.6586
13
+633~+657
OS4 AAAAGATTGACTGACACGATATGGAC CaORF19.6586
gene: +945~+970
PAS1 GGCCTTTTGCTGGCCTTTTG pSFS2-SAT1
plasmid: +1782 ~+1800
PAS2 CAGCTATGACCATGATTACG pSFS2-SAT1
plasmid: +2141 ~+2160 PBS1 AAGATTGAACTCAACTCAAC pSFS2-SAT1 plasmid: +5897 ~+5916 PBS2 AAGGGTGGTAATTATTACTA pSFS2-SAT1 plasmid: +6298 ~+6217 RS1 GCAGCTGGCACGACAGGTTT pSFS2-SAT1 plasmid: +1981~ +2000
RS2 GTGACGTCCGTTATACATTG CaRHD3 gene:
-180~ -161
RS3 GTTTCACTGGTGATGACAAA CaRHD3 gene:
+323~ +342 HJL02559 (SAT1-MAL2) GGAACTAACGATGCATACGACTACATCAATG pSFS2-SAT1 plasmid: +2355~+2385
R-resB AAAGGGCCCTTGGAAAAAGAATATTAGGG CaRHD3 gene:
+1052~ +1071
14 (R-preA) -708 ~ -735 LPCp-9R CGAACGAGCTCTTGGAAAAAGAATATTAGGG Sac I CaRHD3 gene: +1052~ +1071 LPCp-12F CGGGGTACCAATCTTTACTTTATACGCCA Kpn I CaRHD3 gene: -452~ -434 LPCp-12R AAAGGGCCCAACTAGAAGTCGAAGAATGG Apa I CaRHD3 gene: -89~ -70 HJL02558 (R-proB)
GGCAACCTGAACAGACCATAGCTACCC CaRHD3 gene:
+1287 ~+1313 HJL02564
(R-F)
ATCCTTGTCTAGCTCTGCTCTTGCTACC CaRHD3 gene:
+21 ~ +48 HJL02565
(R-R)
ACATGACTAATCCAGCAACAACAGCAG CaRHD3 gene:
+587 ~ +613 GRE2-preA CTCTGGAATTTTAACTTCGAAAGCCAAATTGCC CaGRE2 gene:
-577 ~ -545
GRE2-AR CAGCCCTCGAGTTTCAATTGTTCACCTTT CaGRE2 gene:
+115~ +132 HJL02560 (7-preA) AACAAGGGTAGAAACTCTGTGGGATCCCTCC CaORF19.7310 gene: -219 ~ -188 HJL02561 (7-AR) CCGCTCGAGAAATCATCTTTGGTATCCTTT CaORF19.7310 gene: +404 ~ +384 HJL02562 (1-SF) ATCTTTATTCGTTTCATTGCTTACTACAG CaORF19.173 gene: +658 ~ +630 HJL02563 (1-SR) ATCTCCTCCAAATCGTATTATGGAAATTC CaORF19.173 gene: -154 ~ -182 粗體為外加序列，底線為酵素切位 2.4 化學藥品 Amphotericin B: Lot # 6G17073
15
Alpha Biociences Inc.: LB agar (Cat. No. L12-111)
Ameresco: Agarose (Cat. No. 0710-500G), EDTA (Cat. No. 0105-1KG), Glycerol (Cat. No. 0854-1L-PTM), Phenol (Cat. No. 0945-400ML), Sodium chloride (Cat. No. 0241-1KG), Tris base (Cat. No. 0826-1KG), Tris-hydrogen chloride (Cat. No. 0234-500G)
AppliChem: Ampicillin
Biochain○R: FastHyb-Hybridization solution (Cat # L1031250)
Difco laboratories: Bacto agar (Cat. No. 143175), D-mannitol (Cat. No. 17217020), Nutrient broth (Cat. No. 149018), Yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 145368), YPD broth (Cat. No. 235141XB), Sabouraud Dextrose Agar (Cat. No. 210950)
Fermentas: DreamTagTM DNA polymerase (5 unit /μl, Cat. No. EP0701)
Fluka: Maleic acid (Cat. No. 63190-1KG )
GIBCOTM: RPMI Medium 1640 (Cat. No. 31800-014)
Invitrogen: Goat serum (Cat. No. 01-6201) J. T Baker: Formaldehyde (Cat. No. 15512),
3-N-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (Cat. No. 1132612), Sodium hydroxide (Cat. No. 3722-01), Triton X-100 (Cat. No. X198-07)
Kodak: X-film (Cat. No. 1651454)
Merck: Ethanol (Cat. No. K33534874), Sodium acetate (Cat. No. 1.06268.0250), Sodium hydrogen carbonate (EC number 205-633-8), Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No. S26740)
16
Panreac: K2HPO4 (Cat. No. 141512)
Protech: 100 bp DNA ladder (Cat. No. M1-100T)
Pfizer Inc.: Fluconazole (PF-00345508-00), Voriconazole (Lot # 052301-008-09)
Riedel-de Haёn: Chloroform (Cat. No. 32211), Sodium citrate tribasic dehydrate (Cat. No. 25116), Sodium dodecyl sulfate (Cat. No. 62862), Sodium hydroxide
Roche: Anti-DIG-AP (Cat. No. 12930025), Blocking reagent (Cat. No. 1096176), DIG DNA labeling mix (Cat. No. 1277065), DIG Easy Hyb (Cat. No. 11603558001)
Scharlau: LB broth (Cat. No. 02-385)
Sigma Chemical Co.: Arginine (Cat. No. A5131), Dithiothreitol (Cat. No. D9779) Formaldehyde (Cat. No. 33220), Glassbeads (425~600 μm) (Cat. No. G9268-50G), Histidine (Cat. No. H8125), Lithium acetate (Cat. No. L-6883), Sorbitol (Cat. No. S-0900), Tween 20 (Cat. No. p-1379), Uridine (Cat. No. U3750), MOPs (Lot# BCBH5347V), Miconazole nitrate salt (Cat. No. 22832-87-3)
Subenzyme: 1kb DNA ladder (Cat. No. SEM11C001) Werner Bioagents: Nourseothricin (Cat. No. 5.1000) 景明化工: Ethanol
2.5 緩衝溶液與試劑
50 X TAE buffer: 48.4 g Tris base, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml, 11.42 ml acetic acid added dd H2O to 200 ml
17
20 X SSC buffer: 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate (pH 7.0)
Prehybridization/Hybridization solution: 0.5 M sodium phosphate (pH 7.2), 7 % (w/v) SDS, 1 mM EDTA (pH 7.0)
Maleic acid buffer: Maleic acid, 0.15 M NaCl (pH 7.5)
Washing buffer: Maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.3 % (v/v) Tween 20 (pH 7.5)
2 X Washing buffer: 10 X SSC, 0.1% (w/v) SDS 0.5 X Washing buffer: 5 X SSC, 0.1% (w/v) SDS
10 X Blocking solution: 1 % (w/v) blocking reagent (Roche) dissolved in maleic acid buffer
Detection buffer: M Tris-Cl, 0.1 M NaCl (pH 9.5) Denaturation solution: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl
Neutralization solution: 0.5 M Tris-Cl, 1.5 M NaCl (pH 7.5)
1 M Lithium Acetate: 40.8 g Lithium Acetate added dd H2O to 400 ml (pH 7.5)
10 X Tris-EDTA buffer: 100 mM Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH7.5) 3 M Sodium acetate (NaOAC): 40.83 g NaOAC dissolved in dd H2O to
100 ml (pH 7.0)
1 M Dithiothreitol(DTT): 3.09 g DTT dissolved in 0.01 M NaOAC 20 ml, store at -20°C
1 M Sorbitol: 33.4 g sorbitol in dd H2O to 200 ml
Lysis buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1% (w/v) SDS, 2 % (v/v) Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA
20 mM MaCl2:0.406 g MaCl2 dissolved in ddH2O to 100 ml Freezer solution: 50 mM CaCl2, 15 % glycerol
18
0.85 % NaCl: 8.5 g Sodium Chloride dissolved in ddH2O to 1 L
RPMI solution: 10.4 g RPMI medium 1640, 34.53 g MOPs, 2 g NaHCO3 dissolved in ddH2O to 1 L (pH 7.0)
2.6 酵素
Fermentas: T4 DNA Ligase (EL0331), Taq DNA Polymerase (EP0402) TAKARA: EX TagTM (Cat. No. RR001A)
NEB: Apa I (Cat. No. R0114S), Ava I (Cat. No. R0558S), Kpn I (Cat. No. R0142S), Sac I (Cat. No. R0156S), Sac II (Cat. No. R0157S), Xho I (Cat. No. R0146S), Nsi I (Cat. No. R0127S), Nco I (Cat. No. R0193S), Eco RV (Cat. No. R0195S), Swa I (Cat. No. R0604S), Bsa BI (Cat. No. R0537S),
Nru I (Cat. No. R0192S), Pst I (Cat. No. R0140S), Bam HI (Cat. No.
R0136S)
2.7 培養基配置
LB (Luria-Bertni) 培養液: 1 % tryptone，0.5 % yeast extract，1 % NaCl
LB (Luria-Bertni)/Ampicillin 培養基: 1 % tryptone，0.5 % yeast extract，1 % NaCl，1.5 % agar，50 µg/ml Ampicillin
YPD 培養液: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose
YPD/maltose 培養液: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % maltose YPD 培養基: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose，2 %
agar
YPD/10% FBS 培養液: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose， 10 % FBS
19
YPD/nourseothrcin 培養基: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose，2 % agar，200 µg/ml Nourseothricin
YPD/1 ml FBS 培養基: 1 % yeast extract，2 % peptone，2 % dextrose， 2 % agar，1 ml FBS
Bacto agar/1 ml FBS 培養基: 2 % agar，1 ml FBS
Solid spider 培養基: 1 % nutrient broth，1 % mannitol，0.2 % K2HPO4，1.35 % agar
SDA 培養基: 0.5 % peptic digest of animal tissue，0.5 %pancreatic digest of casein，4 % Dextrose，1.5 % agar
2.8 儀器設備
微量高速冷凍離心機 Centrifuge 5415R (eppendorf) 雜交連結器 (UVITEC)
分光光度計 20GENESYSRT (SPECTRONIC INSTRUMENS)
核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 梯度核酸增殖儀 labcycler (SENSQUEST)
PCR 溫度控制儀 Gene CyclerRT (BIO-RAD) 基因脈衝儀 (BIO-RAD)
脈衝控制器 (BIO-RAD)
程式溫度控制儀 PTC-200 Thermal Cycler (MJ RESEARCH) 震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 (SCIENTIFIC INDUSTRICS) 試管震盪器 IK1-VIBRAX-VXR
平面式震盪器 S-101 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 加熱攪拌器 S101 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 乾燥加熱板 DB102 (Violet BioSciences, Inc.)
20
酸鹼值檢測計 Φ360 (BECKMAN)
電子天秤 PB153-S (METTLER TOLEDO) 往復式恆溫水槽 B206 (FIRSTEK SCIENTIFIC)
水平式電泳槽 MJ-105 (MEDCLUB)
微量離心機 MICRO 240A (DINVILLE SCIENTIFIC INC.)
電子防潮箱 DX106 (台灣防潮科技)
恆溫式震盪培養箱 B206 (FIRSTECK SCIENTIFIC)
迴轉式震盪培養箱 721SR (WISDOM APPARATUS MFG COMPANY)
迴轉式震盪培養箱 OSI500 (KS)
電泳影像處理系統 GEL DOC 2000 (BIO-RAD)
電泳影像擷取分析系統 (Alphalmager TM)
微電腦多功能冷凍高速離心機 Centrifuge 5804R (eppendorf)
桌上型高速離心機 5100 (KUBOTA CORPORATION)
桌上型冷凍離心機 GS-15R (BECKMAN)
24孔高速離心機 LEGEND MICRO17 (THERMO) 4°C三門冰藏櫃 KS-101-MS (MINI KINGKON) -20°C冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE) -80°C冷凍櫃 925/926 (Forma Scientific) 倒立顯微鏡 CK40 (OLYMPUS) 超純水製造機 Simplicity (MILLIPORE) 水浴槽 B-100 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 脈衝器 MicroPulserTM (BIO-RAD) 電磁式奈米級偵測儀 ND-100 (NamoDrop) 數位相機 C-5050ZOOM (OLYMPUS) 數位相機 K200D (PENTAX)
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數位相機 G11 (CANON)
雙光束紫外/可視光分光光譜儀 U-3010 (HITACHI)
無菌操作箱二級 SC4TXSB (BAKER)
落地形高速離心機 J2-MC (BECKMAN)
柯達全自動洗片機 X-OMAT 2000 PROCESSOR (KODAK)
倒立顯微鏡 IX70 (OLYMPUS)
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三、方法與步驟
3.1 質體 DNA (plasmid DNA) 的萃取使用 PROTECH Gene-SpinTM-V2 Miniprep Purification Kit
取單一菌落培養約 12~16 小時後，取 1.5ml 離心 15,700 × g、 10 分鐘，去上清液。加入 200 µl Solution I，混合均勻。加入 200 µl Solution II，溫和反轉 5 次，靜置 5 分鐘。再加入 300 µl Solution III，
混合均勻，溫和反轉 5 次，靜置 5 分鐘。離心 15,700 × g、5 分鐘，
小心取上清液至 spin column。離心 15,700 × g、30 秒，倒掉濾液。
加入 700 µl Washing Solution，離心 15,700 × g、1 分鐘，倒掉濾液。 再加入 700 µl Washing Solution，離心 15,700 × g、1 分鐘，倒掉濾液。 Spin column 15,700 × g 空轉 3 分鐘。將 spin column 移置新的 1.5 ml
離心管，於乾燥加熱板上 60°C、5~10 分鐘。以 50 µl 二次無菌水加
入 spin column 中，靜置 2 分鐘。15,700 × g、1 分鐘收下質體 DNA， 儲存於 -20°C。
3.2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction)
以設計好之一對 primer，配合 DNA template 及 taq polymerase，
可將欲得到之 DNA 片段合成出來。將下列材料混合於 200 µl 微量
離心管內：
3.2.1 一般 PCR 反應
0.25 µl Taq Polymerase (1.25 U) (DreamTaq)、10 X PCR buffer 5 µl、 50 µM 引子各 1 µl、2.5 mM dNTPs mixture 4 µl、25 mM MgCl2 4 μl、1
µg template DNA，補二次無菌水至總體積 50 µl，置於 PCR 溫度控制
儀進行聚合酶連鎖反應。以此方法反應預計得到 CaOrf19.6586 上游
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3.2.2 Rescued CaORF19.6586 及 CaRHD3 PCR 反應
欲合成目標基因上游之 A region 包含 open reading frame 至下游 B region 之片段。以 Genomic DNA 為 template (300~500 ng)、10 X Taq buffer 5 μl、25 mM dNTPs 4 μl、一對 50 μM 引子各 1 μl、DreamTaq DNA polymerase 0.25 μl (1.25 U)，補二次無菌水至總體積 50 μl，再置於 PCR 溫度控制儀進行反應。 PCR 溫度控制儀的設定如下︰ 一般PCR Rescued CaORF19.6586 PCR Rescued CaRHD3 PCR 95°C 5 分鐘 95°C 5 分鐘 95°C 1 分鐘 95°C 1 分鐘 58°C 1 分鐘 56~60°C 1 分鐘
72°C 1 分鐘 (repeat 30 cycles) 72°C 2 分鐘(repeat 30 cycles)
72°C 10 分鐘 72°C 10 分鐘
20°C 停止反應 20°C 停止反應
反應完成後，利用 1 % 洋菜膠電泳確認 PCR 產物片段大小是否正確，
再利用PCR Purification Mini Kit (FAVORGEN) 來純化 DNA 去除酵素及 鹽類。 3.3 大腸桿菌勝任細胞 (Competent cell) 的製備 挑選 DH5α 的單一菌落接種於 5 ml LB 培養液中，37°C、180 rpm 震盪培養12~16 小時。取 2 ml 的菌液轉養於 100 ml LB (含 5% glucose 和 2 mM MgCl2) 培養液中，37°C、200 rpm 震盪培養 90~120 分鐘，直到 OD600nm 約為 0.5~0.7。將菌液移入 50 ml 離心管中，靜
24 置於冰上 20 分鐘。以 1620 xg、4°C 離心 10 分鐘，移除上清液。 每管加入 25 ml ice-cold 0.1 M CaCl2 將菌體重新懸浮，放置於冰上 30 分鐘。以 720 xg、4°C 離心 10 分鐘，移除上清液。每管加入 2.5 ml 冰的 0.1 M CaCl2 將菌體重新懸浮，放置於冰上約 20 小時，以 720 xg、 4°C 離心 5 分鐘，移除上清液。加入 2.5 ml Freezer solution 將菌體 重新懸浮，分裝成每管 100 μl，保存於 -80°C 中。(以上均為無菌操 作)。 3.4 大腸桿菌勝任細胞的轉型 (Transformation) 將約 20 ng~500 ng 的質體 (體積約 0.5 μl~2 μl) 和 50 μl 勝任 細胞混和，靜置於冰上約 20~30 分鐘。以 42°C 熱休克 45 秒後立 刻放回冰上，靜置 1 分鐘。加入 事先放置於 37 °C 預熱之 500 μl LB 培養液，於 37°C、150~180 rpm 條件下培養一小時，之後取 100 μl 的 菌液塗盤。塗完的盤子倒放於 37°C 隔夜培養。(以上均為無菌操作)。 若菌落太少可將剩餘菌液以 900 x g 離心五分鐘，吸取掉 700 μl 上清 液後，留下 100 μl 回溶菌液塗盤。塗完的盤子倒放於 37°C 隔夜培 養。 3.5 限制酶反應 (Enzyme digestion) 3.5.1 確定質體 DNA 片段大小之限制酶反應
取質體 DNA 1 μg、1 U/kb 限制酶、10 X buffer 1.5 μl、10 X BSA 1.5 μl，補充無菌二次水至總體積 15 μl，37°C 水浴培養 2~4 小時，再
以 1.0 % 洋菜膠電泳進行片段大小之分析。
3.5.2 為 clone 所需之限制酶反應
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補二次無菌水至總體積為50 μl ， 37°C 反應 3 小時至 18 小時 (依
酵素特性)。反應完成後，以 clean up kit (FAVORGEN) 去除限制酶、
buffer 及鹽類等，所得到之 DNA 片段用以進行下一步接合反應。
3.6 接合反應 (Ligation)
將以酵素處理過並經過純化的質體 (vector DNA) 和欲插入之片 段 (insert DNA) ，以 vector DNA 50~400 ng 的量和 insert DNA 計算
莫耳濃度比為 3︰1 的比例在微量離心管中混合，接著加入 2 μl 10X
Ligase Buffer、0.5 μl T4 Ligase (5 unit/μl)，並補無菌二次水至總體積為 20 μl。22°C 培養 1 小時。
3.7 洋菜膠內之 DNA 萃取 (gel extraction) 3.7.1 結晶紫洋菜膠之製備
將 0.4 g agarose 粉末加入 50 ml 1 X TAE buffer 中，微波爐加熱
溶解 agarose，稍冷後加入 40 μl 結晶紫溶液 (2.5 mg/ml)，混合均勻，
倒入製膠台中，冷卻凝固即可使用。
3.7.2 洋菜膠內之 DNA 片段萃取
將欲萃取之洋菜膠上的 DNA 片段以電泳方式分離，以刀片切下
欲得到之 DNA 片段。將洋菜膠片段 (up to 300 mg) 放置微量離心管
中，以 FevorPrepTM GEL Extraction kit (FAVORGEN)，加入 500 μl FADF buffer，於 60°C 加熱板上加熱 10~15 分鐘，確定洋菜膠片段完全融
化後，冷卻至室溫。將混合液移至 spin column，15,700 ×g、30 秒、
倒掉濾液。加入 750 μl Wash buffer，15,700 ×g、30 秒、倒掉濾液。
再加入 750 μl Wash buffer，15,700 ×g、30 秒、倒掉濾液。column 空 轉 15,700 ×g、3 分鐘。將 spin column 移至新的 1.5 ml 微量離心管，
26 加入 40 μl 無菌二次水於 spin column 正中央，靜置 2 分鐘，15,700 ×g、2 分鐘離心後，即得欲萃取之 DNA，儲存於 -20°C。 3.8 白色念珠菌的轉型反應 (Transformation) 將白色念珠菌之單一菌落接種至 3 ml YPD broth 培養液中，30°C、 300 rpm 震盪培養 18~24 小時。取 3 μl 菌液轉養至 50 ml YPD 培 養液 30°C，300 rpm，震盪培養 12~15 小時至 OD600 約 1.6~2.2 (由 於分光光度計線性測量範圍為 O.D 595nm = 0.1~1.0，故菌液需先稀釋再 進行測量)。接著將菌液移至 50 ml 離心管中，離心 1,620 ×g、5 分 鐘，去上清液。加入 1 ml 1 M Lithium acetate 及 1 ml 10 X TE 和 8 ml 無菌二次水重新懸浮菌體。30°C、300 rpm 培養 1 小時。再加入 250 μl 1 M DTT，30°C、300 rpm 培養半小時。之後加入 40 ml 無菌二次 水，離心 1,620 ×g、5 分鐘。以下開始冰上操作：加入 25 ml 預冷 之無菌二次水懸浮菌體，4°C 低溫離心 1,620 ×g、5 分鐘，去上清液。 再加入 5 ml 預冷之 1 M sorbitol 懸浮菌體，4°C 低溫離心 1,620 ×g、 5 分鐘，去上清液。重複加入 5 ml 1 M sorbitol 懸浮菌體，4°C 低溫 離心 1,620 ×g、5 分鐘，去上清液。靜置於冰上，即為白色念珠菌之 勝任細胞。接著在無菌的 1.5 ml 微量離心管中混合 40 μl 勝任細胞 和 1 μg 的 DNA 片段。將混合好的勝任細胞加入電穿孔用的 cuvette 中，靜置於冰上 5 分鐘。以 1.8 kV 進行電穿孔，馬上在 cuvette 中 加入 1 ml 冰的 sorbitol，混合後吸出菌液，移入新的 1.5 ml 微量離 心管中，800 xg、離心 5 分鐘，移除上清液。加入 1 ml YPD 培養液， 30°C、300 rpm 震盪培養 1 小時。取 100 μl 的菌液塗佈在合適的培 養基 (nourseothricin: 200 μg/ml) 上，30°C 培養 2 天。
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3.9 Maltose 誘發 SAT1 flipper cassette 之剔除 (pop-out)
在白色念珠菌轉型後，將篩選得到的單一菌落先在 YPD/Nourseothricin (200 μg/ml) 培養基上劃開，之後挑選單一菌落培 養在 3 ml YP/ Maltose 培養液中，以 30°C，300 rpm 震盪培養 24 小 時後，取 100 μl 菌液轉養至新鮮的 3 ml YP/Maltose 中，30°C、300 rpm 再次震盪培養 24 小時後，取 500 μl 菌液抽取 Genome DNA， 進行 PCR 確認是否有轉型成功。若無，則剩餘菌液取 100 μl 菌液轉 養至新鮮的 3 ml YP/Maltose 中，30°C、300 rpm 再次震盪培養 24 小 時，取 500 μl 菌液抽取 Genomic DNA，進行 PCR 確認是否有轉型 成功。剩餘菌液暫存於 4°C 中。 3.10 複製平皿培養法 (Replica plating) 將 3.9 確認成功的菌株之保存菌液於 YPD 培養基上畫出單一 菌落，此為 Master plate。培養於 3 °C、1~2 天。接著將菌盤轉印在 無菌的絨布上，再將無篩選性的培養基 (YPD) 和有篩選性的培養基 (YPD/Nourseothricin: 200 μg/ml) 依序蓋在絨布上，以沾取在絨布上的 菌，於 30°C 培養 1~2 天。之後挑選在無篩選性的培養基會生長， 但在具有篩選性的培養基上不會生長的菌落。 3.11 建構白色念珠菌單套剔除株 (Heterozygote) 及雙套剔除株 (Homozygote) 利用前端加上限制酶切位之引子，以 PCR 方式分別將目標基因 上游片段 (稱為 A region) 及下游片段 (稱為 B region) 增幅，依序
cloning 接進 SAT1 flipper cassette 的前後兩端。如圖<一>所示，將帶
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電穿孔轉型至白色念珠菌野生株 SC5314B 中。送入的片段利用目標
基因上下游同源的區域進行同源重組置換 (homologous
recombination)，將目標基因以 SAT1 flipper cassette 取代，達到基因
剔除的目的。接著藉由藥物 nourseothricin 篩選出帶有 SAT1 flipper
cassette 的菌株。再將篩選到的菌株培養在 YP/maltose 培養液中進
行 pop-out，二日後抽取菌株 genomic DNA，以 PCR 確認是否得到
預期菌株後，藉由複製平皿培養法 (replica plating)，排除部分未將
SAT1 flipper cassette 剔除的菌株，再一次抽取菌株 genomic DNA，以
PCR 確認菌株。獲得目標基因其中一個 allele 被剔除並且不帶有
SAT1 flipper cassette 的單套基因剔除株 (heterozygous knock-out
strain)後，便可重複使用 SAT1 flipper cassette 將另一個 allele 作剔
除，得到雙套基因剔除株 (homozygous knock-out strain)。
3.12 建構白色念珠菌單套基因回復株 (rescued strain)
首先須建構一 SAT1 flipper cassette 上游帶有目標基因 ORF 完
整序列，以及 cassette 下游帶有目標基因 B region 的片段。因此利
用目標基因上游 A region 5’ 的 primer 與下游 B region 3’ primer，將 整個基因片段 PCR 並 clone 進一個帶有 B region 的 SAT1 flipper cassette 前端，完成後將帶有整個 ORF 和 B region 的 SAT1 flipper cassette 由質體上切下，如圖<八>所示，轉型到雙套基因剔除株 (homozygote)，經過同源重組置換和 pop-out 的動作，得到單套基因 回復株 (rescued strain)。
3.13 白色念珠菌染色體 DNA 之萃取
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DNA Purification kit (Cat. Nos. MPY80010 and MPY80200) 抽取 gDNA。 操作方法如下：
將隔夜培養之 3 ml 菌液以 15,700 x g 離心 10 分鐘。去上清液，
加入 300 μl Yeast Cell Lysis solution 回溶菌液，置於 65°C 加熱板 15 分鐘；冰上靜置 5 分鐘，加入 MPC protein precipitation reagent 150 μl vortex 10 秒，以 15,700 x g 離心 10 分鐘。吸取上清液至新 1.5 ml tube 中，加入 Isopropanol 500 μl 上下翻轉 tube 均勻混和，以 15,700 x g 離心 10 分鐘。倒掉上清液，加入 70 % Ethanol 500 μl 清洗 pellet， 以15,700 x g 離心 5 分鐘。加入 TE buffer 100 μl 及 Rnase A 1 μl (5 μg/μl) 於 37°C 加熱板作用 30 分鐘。加入 99.9 % Ethanol 200 μl 及 3 M pH 5.2 NaOAC 12.5 μl 上下翻轉 tube 均勻混和，置於 -20°C 冰箱 5
分鐘。以15,700 x g 離心 10 分鐘，倒掉上清液，加入 70 % Ethanol 500
μl 清洗 pellet，以 15,700 x g 離心 5 分鐘。待 gDNA pellet 乾燥後加
入50~100 μl 無菌二次水回溶。存放於 -20°C。
3.14 南方墨點法
3.14.1 製備 DNA 探針 (DNA probe labeling)
使用 Roche 廠商產品 DIG labeling dNTP mix 以及 DreamTaq DNA polymerase system。做法是將一半的 dNTP 以 DIG labeling dNTP mix 取代。在 200 μl 微量離心管中混合以下材料：約 300~500 ng Template DNA、5 μl 10 X DreamTaq DNA Polymerase Buffer、2.5 μl DIG DNA labeling mix、2 μl 2.5 mM dNTP mix、0.5 μl 50 mM primer、0.25 μl DreamTaq DNA Polymerase (2 unit/μl)，補無菌二次水至總體積為 50 μl。
30 95°C 5 分鐘 95°C 5 分鐘 58°C 1 分鐘 72°C 1 分鐘 Repeat 30 cycles 72°C 10 分鐘 20°C 終止反應 3.14.2 轉漬 DNA (Transfer) 取 10 μg Genomic DNA 以適當的酵素作用 12~16 小時。先取大 約500 ng genomic DNA 以 0.8 % 洋菜膠進行電泳，確認酵素作用效 果後，再將剩餘的 genomic DNA 以適當濃度洋菜膠進行電泳，電泳 緩衝液為 1 X TAE，電場強度為 50 伏特。接著將膠以現配之 1 μg/ml EtBr 染色 20 分鐘，以影像處理系統拍照。接著將膠泡入 Denature Buffer 中，以 60 rpm 平面震盪 15 分鐘。換新的 Denature Buffer 再
次平面震盪 15 分鐘，移除 Buffer。以無菌二次水沖洗膠體，然後將
膠泡入 Neutralization Buffer，以 60 rpm 平面震盪 15 分鐘。換新的 Neutralization Buffer 再次平面震盪 15 分鐘，移除 Buffer。以無菌二
次水沖洗膠體，接著將膠泡入 20 X SSC 中，以 60 rpm 平面震盪 10
分鐘。分別準備比膠體大之四張乾燥的 Whatman 3 MM 濾紙 (Cat.
No. 3030 917) 和四張以 2 X SSC 泡濕的 Whatman 3 MM 濾紙；裁切 一大張符合轉漬槽 (Schleicher & Schuell 產品之 TurboBlotterTM and Blotting Stack) 寬度及長度的 Whatman 3 MM 濾紙並以 2 X SSC 泡濕； 準備一張比膠大的 Nylon membrane (GENESCREEN PLUSTM
HYBRIDIZATION TRANSFER MEMBRANE Lot Number: 668634) ，同樣以 2 X SSC 泡濕備用。依照轉漬槽說名片架設，首先在 STACK TRAY 中央
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濾紙、Nylon Membrane、將膠體小心放置於 Nylon Membrane 上，
排除氣泡，再覆蓋三張濕的 3MM 濾紙；將 BUFFER TRAY 組裝後，
倒入 20 X SSC，將較大張之 3MM 濾紙橫跨於 BUFFER TRAY 兩端並
沒入液面形成鹽橋，注意不要沾溼擦手紙，最後輕放上 WICK COVER，
放置約 14~16 小時。
3.14.3 雜交反應 (Hybridization)
將轉漬完之 nylon membrane 進行 cross-linking: 先將 nylon membrane 及一張大於 nylon membrane 的 3 MM 濾紙置於 2 X SSC 潤濕，將 nylon membrane 置於 3 MM 濾紙之上，以 UV 254 nm 120 mJ 照射 nylon membrane (有 DNA 的那面) 兩次，將 DNA 固定
於 Nylon Membrane 上。之後將 nylon membrane 泡入無菌二次水洗
過，再泡入 DIG FastHyb 中，放置於 65 °C HYBRIDIZATION WATER BATH
震盪一小時。將 3.12.1 所製備的探針放置於 95°C 加熱板上加熱 5
分鐘，然後置於冰上 5 分鐘。將探針和 DIG Fast Hyb 以 1 μl 探針加
1 ml DIG FastHy 的比例混合均勻。將 nylon membrane 泡入含有探針 的 DIG FastHy 中，放置於 65°C HYBRIDIZATION WATER BATH，震盪一 個小時。之後將 nylon membrane 泡入 Low Stringency buffer (0.5 X SSC，0.1 % SDS) 中，室溫下以 60 rpm 平面震盪 5 分鐘；再將 nylon membrane 泡入新的 Low Stringency buffer 中，室溫下以 60 rpm 平 面震盪 5 分鐘。接著將 nylon membrane 泡入 High Stringency buffer (2 X SSC，0.1 % SDS) 中，置於 65°C HYBRIDIZATION OVEN，60 rpm 平 面震盪 15 分鐘；再將 nylon membrane 泡入新的 High Stringency buffer 60 rpm 平面震盪 15 分鐘。
3.14.4 免疫偵測 (Detection)
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盪5 分鐘。將 nylon membrane 泡入 1 X Blocking buffer (5 ml 10 X Blocking buffer 溶於 45 ml Maleic acid buffer) 中，室溫下 60 rpm 平 面震盪 30 分鐘。將 nylon membrane 泡入 Antibody solution (1 μl Antibody (Roche Anti-DIG-AP，以 4°C、15,700 xg 離心 5 分鐘) 加於 10 ml 1 X Blocking buffer) 中，室溫下 60 rpm 平面震盪 30 分鐘。將 nylon membrane 泡入 Wash buffer 中，室溫下 60 rpm 平面震盪 15
分鐘；再將 nylon membrane 泡入新的 Wash buffer 中，室溫下 60
rpm 平面震盪 15 分鐘。將 nylon membrane 泡入 Detection buffer
中，室溫下 60 rpm 平面震盪 5 分鐘。接著將 nylon membrane 放
置在透明資料夾中 (帶有 DNA 的那面朝上)。於 Nylon membrane 上
均勻加入 2 ml CDP-STAR○R (Chemiluminescence Reagent Lot. 0706013)。
小心覆蓋資料夾，室溫靜置 5 分鐘，放置於 37°C 培養箱中避光反 應 15 分鐘，之後在暗房進行壓片。將底片隔著投影片放置於 nylon membrane 上，待感光適當時間之後，放入洗片機中，沖洗後的底片 即可永久保存。 3.15 突變株之性狀分析 (Characterization) 3.15.1 生長曲線之測定 (Growth curve) 從 – 80°C 存菌管將待測菌株劃於 YPD plate 在 30°C 隔夜培養。 刮取適量菌落加入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃試管，充分混合均勻 後在 530 nm 波長下利用比色計測量其波長，調整到菌液濃度約為 0.5 McFarland。接著取 100 μl 菌液至 900 μl YPD 培養液中，重複上 述稀釋，再取 500 μl 菌液至 500 μl YPD 對半稀釋，達到總稀釋 200 倍。接著取最後稀釋那管 200 μl 菌液至生長曲線專用盤，每個菌株 三重複，並取 200 μl YPD 當作空白對照組 (Blank)。放入微生物生長
33
曲線快速分析系統中 (Bioscreen C)，設定一小時測量一次 O.D600 值，
靜置連續 24 小時後收集數據並作圖分析。
3.15.2 芽管試驗 (Germ tube assay)
將含有 10 % FBS 之 YPD 培養液，以每個 well 有 2 ml 加至 24-well plate 中，用無菌牙籤沾取新鮮的單一菌落於 well 裡，於 37°C 培養 3 小時，利用倒立式顯微鏡 40 倍觀察芽管生成情形。 3.15.3 誘發菌絲生長觀察型態變化 (Colony morhpology) 將單一菌落接種在含 4% FBS YPD 培養基中，置於 37°C 培 養三天，使用倒立式顯微鏡觀察菌落生長的型態。 將單一菌落接種在 4% FBS Bacto agar 培養基中，置於 37°C 培養七天，觀察單一菌落生長情形。
3.15.4 侵犯力測試 (invasion assay) (Navarro-Garcia et al., 1998) 將單一菌落接種在 Solid Spider 培養基上，置於 37°C 培養 7 天，之後以定時定量流水沖洗菌落，先觀察菌落是否會因菌絲侵入培 養基而殘留。再戴手套將培養基表面的菌落推除，觀察是否有菌絲埋 入培養基。
3.16 CLSI Broth Microdilution Method
3.16.1 藥盤配製
首先將實驗所需的藥物 Amphotericin B、Miconazole、Fluconazole、
Voriconazole 溶於有機溶劑 dimethyl sulfoxide (DMSO) 中，而
Micafungin 溶於無菌二次水並過 0.22 μm filter。使用 RPMI 1640（無 bicarbonate 及含 glutamine 與酸鹼指示劑）的培養基來稀釋藥物配
成本實驗使用最高藥物濃度的二倍濃度：Fluconazole (128 mg/l)、
