virB4 和 virB11 基因缺失株之構築與致病力分析

為探討茄科植物細菌性斑點病菌 virB4 和 virB11 基因產物與致病力之關係，因此 構 築 virB4 和 virB11 基 因 缺 失 之 突 變 菌 株 以 進 一 步 分 析 。 策 略 為 以 不 具 有 Rho-independent transcription terminator 的 nptII 基因取代 virB4 和 virB11 基因 (Beck et al., 1982; Alfano et al., 1996)，如圖二、三所示。構築於質體的突變基因轉至野生菌株 染色體上之菌株 (Xvt122ΔvirB4、Xvt122ΔvirB11、Xvt45ΔvirB4 及 Xvt45ΔvirB11)，以 南方雜合法確認突變株已如預期被破壞，即進行接種試驗以評估其對宿主植物之致病 力。

首 先 將 野 生 菌 株(Xcv Xvt122、Xcv Xvt45) 和 virB4 和 virB11 基 因 缺 失 株 (Xvt122ΔvirB4、Xvt122ΔvirB11、Xvt45ΔvirB4、Xvt45ΔvirB11) 調整菌液至 5x10⁷，將 感病番茄 (Bonny Best L305) 葉片浸泡於菌液中 20 秒後，置於溫室觀察病徵的發展。

結果顯示，Xcv Xvt122 從第一星期發病指數介於 2~3，持續漸增至第四星期發病指數 為5~6，而 Xvt122ΔvirB4，Xvt122ΔvirB11 其病徴的發展的趨勢和 Xcv Xvt122 並沒有 顯著差別，至第四星期其葉片病斑皆已達40 %~60 % (圖 3-4A)。同樣發病現象亦發 生在Xcv Xvt45、Xvt45ΔvirB4、Xvt45ΔvirB11 的試驗中，持續觀察的四星期中，處理 不同菌株的植株，發病指數皆從2~3 爬升至 5~6，菌株間並無明顯的差異 (圖 3-4B)。

進一步分析病原菌於寄主番茄葉片內之生長能力，以10⁵ cfu/ml 之濃度注射至番 茄葉片，接種Xcv Xvt122 的葉片，菌量從 10³至接種第三天已爬升至10⁶~10⁷，而接 種 Xvt122ΔvirB4，Xvt122ΔvirB11 的葉片，其菌量之生長亦達 10⁶，較之野生株降低

約4~5 倍，生長至第六天，三株處理菌株雖然沒有大幅度的菌量生長，但仍可發現突

變株的生長菌量略低於野生株 (圖 3-5A)。為進一步證實突變株的生長受到抑制，以 感病甜椒 (ECW30R) 進行同樣的接種試驗，結果顯示，接種 Xcv Xvt122 的葉片，菌 量從10³至接種第三天已爬升至 10⁸，而接種 Xvt122ΔvirB4 的葉片菌量為 10⁷，明顯 降低 10 倍，而接種 Xvt122ΔvirB11 的葉片，其菌量之生長達 10⁶，較之野生株降低

100 倍，觀察至第六天，接種 Xcv Xvt122 的葉片菌量已高達 10¹⁰，而Xvt122ΔvirB4 菌量生長漸漸緩慢，較之野生株明顯降低約30 倍，Xvt122ΔvirB11 菌量持續生長，但 仍與野生株有 30 倍之差 (圖 3-5B)。但菌量生長受抑制的現象並沒有發生在 Xcv Xvt45、Xvt45ΔvirB4、Xvt45ΔvirB11 的試驗中，接種第三天，Xcv Xvt45 菌量生長已 從10³爬升至10⁶~10⁷，第六天達10¹⁰，而Xvt45ΔvirB4、Xvt45ΔvirB11 菌量生長趨勢 和Xcv Xvt45 是一致的 (圖 3-5C)。

3.4 討論

原核細菌利用質體的接合作用以達到水平式基因轉移的目的，以增加遺傳的變異 性與細菌的適應性，接合作用主要機制即為第四型分泌系統。如 Pseudomonas syringae 的pPT23A 家族質體 (pPT23A family plasmid, PFPs)，因具有病原島嶼的特色，在致

病性上扮演著很重要的角色，分析這些PFPs 的序列，發現存在有兩種基因組合的第

四 型 分 泌 系 統 ，pPSR1 (P. syringae pv. syringae) 、 pPh1448A (P. syringae pv.

phaseolicola)、pPMA4328A (P. syringae pv. maculicola)的第四型分泌系統屬於 IVA 型，與 A. tumefaciens virB/D4 基因組相同。而 pDC3000A 和 pDC3000B (P. syringae pv.

tomato DC3000)則屬於 IVB 型-tra 系統 (Zhao et al., 2005)。近幾年由於基因組解序的 快速進展，陸續發現在 Erwinia、Xanthomonas 和 Xylella 等植物病原菌的質體中皆存 在有第四型分泌系統的相關基因。而 X. campestris pv. vesicatoria 85-10，除了在 pXCV38 質體上有一套 VirB/Tra 系統，在染色體也發現有部份 virB 基因存在，反之，

H. pylori

、

L. pneumophila 的第四型分泌系統則是分佈於染色體上，利用接合作用轉 移染色體DNA 亦可見於 X. campestris pv. vesicatoria 85-10，Xcv 85-10 的 pXCV183 質體上即發現帶有一套 L. pneumophila 的 icm/dot 基因組 (Thieme et al., 2005; Sundin, 2007)。

X. axonopodis pv. citri 306 具有兩套的第四型分泌系統，皆屬於 VirB/D4 系統，一 套位於染色體上，另一套則位於 pXAC64 質體，而 X. campestris pv. campestris ATCC33913 則只擁有一套第四型分泌系統，亦屬於 VirB/D4 系統 (da Silva et al., 2002) 。 本 研 究 發 現 在 X. campestris pv. vesicatoria Xvt122 (X. euvesicatoria=X.

axonopodis pv. vesicatoria) 和 X. campestris pv. vesicatoria Xvt45 (X. vesicatoria) 的染 色體均存在有VirB/D4 第四型分泌系統，Xcv Xvt122 VirB/D4 基因組的胺基酸序列和 基因排列順序和Xcc ATCC33913 較為相似 (圖 3-2)，而 Xcv Xvt45 則和 Xcc B100、

Xac 306 較為相近 (圖 3-3)。位於 Xcv Xvt122 VirB4 下游的序列，雖比對到完整的 Hypothetical protein XCV 2804，但同時也比對到與 X. oryzae pv. oryzae 和 Ralstonia sp.

同源性很高的 transpoase 以及 IS4 family，但是個缺失 (truncated)的蛋白，而 Xcv Xvt122 VirB/D4 基因組 G+C 含量為 50.4 %，其鄰近基因的 G+C 含量則為 62 %。分 析Xcv Xvt45 VirB/D4 基因組下游的序列，亦具有 ISxac4 transposase，其 G+C 含量為 56 %，也遠較其鄰近基因的 G+C 含量 62.5 %為低。可知，Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 的VirB/D4 基因組是由其他菌屬經水平式基因轉移而來 (Hacker and Kaper, 1999)。

最典型的第四型分泌系統為 A. tumefaciens T-DNA 的傳送系統，A. tumefaciens 利 用VirB/D4 系統將腫瘤基因送進植物細胞而造成腫瘤 (crown-gall tumors) (Zhu et al.

2000)。VirB/D4 第四型分泌系統中，VirB4、VirB11 和 VirD4 是保留性最高的組成蛋 白，具有NTP-binding domains，參與此系統組合之能量提供 (Li et al. 2005)。將 Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 的 virB/D4 基因組和及其他已發表之 Xanthomonas spp.作比較 (表 3-5、表 3-6)，確實可發現 VirD4、VirB4、VirB11 是保留性最高的，高達 90 幾百分比 的相似性。Qian 等人(2005)分析 X. campestris pv. campestris 8004 的基因組資料得知，

Xcc 8004 的 VirD4 及 VirB4 蛋白，分別具有 TraG/TraD 和 ATPase 的 domains。在 H.

pylori 和 A. tumefaciens 中，這兩個蛋白具有 NTPase 的功能，扮演著偶合因子 (coupling factors)的角色，能幫助聯繫受質分子進入分泌通道 (Israel et al., 2001; Cascales and Christie, 2003)。將 Xcc 8004 virD4 和 virB 基因組等 9 個基因全部剔除後之突變株接 種於宿主植物甘藍菜，發現並不影響其對宿主植物的致病力 (He et al., 2007)。本研究 亦嘗試將Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 的 virB4 及 virB11 基因進行突變，評估其對寄主 番茄植物致病力之影響。結果顯示，Xcv Xvt45 的 virB4 和 virB11 基因突變株，對病 徴的發展和病原菌在寄主內的生長並沒有影響 (圖 3-4B、圖 3-5C)。但 Xcv Xvt122 的 virB4 和 virB11 基因突變株，雖然對發病指數沒有顯著差異 (圖 3-4A)，但對病原 菌的生長確實有抑制作用 (圖 3-5A)，此抑制效果在宿主甜椒 ECW30R 上更為明顯 (圖 3-5B)，Xvt122 在不同寄主反應略不同是否因 T4SS 受質只在甜椒上作用，有待探 討。例如，Mesorhizobium loti R7A 所分泌的受質在 Lotus corniculatus 植物會產生無 毒性而阻止病原菌侵入，對 Liucaena leucocephala 可能會抑制植物防禦反應而幫助入 侵。將 M. loti R7A 共生島嶼 (symbiosis island)上的 virB/D4 基因組突變後，對 L.

corniculatus 植物會延遲根瘤作用，但對 L. leucocephala 則能有效的產生根瘤作用 (Marie et al., 2001; Hubber et al., 2004)。

L. pneumophila 所具有的 Dot/Icm 第四型分泌系統，同時兼具接合和傳送的功能 (Nagai and Roy, 2003)，而 H. pylori 同時擁有兩套的第四型分泌系統來擔任不同的角 色，Cag 分泌系統負責分泌 CagA 至宿主細胞，而 Com 系統則用來吸收 DNA，以加 速基因組的改變來幫助細胞的存活 (Dhar et al.,2003; Ding et al., 2003)。Bartonella 則 需要 Trw 和 VirB/VirD4 兩套第四型分泌系統同時作用，才能成功的侵入紅血球 (Schuein and Dehio, 2002; Seubert et al., 2003)。Burkholderia cenocepacia strain K56-2 位於質體的PtwT4SS 為 VirB/D4 和 F-specific 單位的嵌合系統，ptwD4(VirD4-like)的 突變株會抑制洋蔥組織水浸狀病徵的產生，而位於染色體的第四型分泌系統則與 VirB/D4 相似，突變株並不會影響病徵的表現 (Engledow et al., 2004)。X. campestris pv.

vesicatoria 85-10 的 pXCV38 質體帶有一套 Vir/Tra 的 T4SS，扮演的功能可能和接合 作用有關，在 pXCV183 質體上則帶有另一套 Icm/Dot T4SS，這是第一株發現具 Icm/Dot T4SS 的植物病原菌，推測可能和 Xanthomonas 的致病性有關 (Thieme et al., 2005)。位於 Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 中的 VirB/D4 第四型分泌系統，其胺基酸序列 和 Xcv 85-10 的 Vir/Tra 系統只有 20~30 %的相似度，究竟 VirB/D4 基因組在 Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 中所扮演的角色，是負責接合作用、受質傳送或同時具有兩者 功能，值得進一步探討。Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 是否也和 Xcv85-10 一樣，具有另 一套Dot/Icm 系統，和 VirB4/D4 系統並存下互相影響致病力，需待實驗證明。

表3-1. 研究中所使用之菌株及質體

Table 3-1. Bacterial strains and plasmids used in this study

Designation Relevant characteristics Source or reference Strains

E. coli

DH10B endA1 hsdR17 recA1 relAΔ(argF-lacZYA)U169Φ80d lacZΔM15 Life Sciences Technologies (Gaithersburg, MD) EPI300^TM E. coli carrying inducible trfA gene for amplification of high copy

number. Used for genomic DNA library.

CopyControl^TM BAC Cloning Kit

(Epicentre) X. c. pv. vesicatora

Xvt12, Xvt28, Xvt48, Xvt122, Xvt185,

Wild types isolated from tomato, classified into group A, no amylolytic activity

Hsu (1998)

Xvp169, Xvp182, Xvp186, Xvp194, Xvp197

Wild types isolated from pepper, classified into group A, no amylolytic activity

Hsu (1998)

Xvt45, Xvt46, Xvt147, Xvt148

Wild types isolated from tomato, classified into group B, amylolytic activity

Hsu (1998)

Plasmids

pBluescript II SK⁺ ColE1 mcs-lacZ, Ap^r Stratagene

pBBR1MCS-5 A broad host range vector containing lac promoter, compatible to IncP, IncQ, or IncW group plasmids, Gm^r

Kovach et al. (1995)

pCC1BAC^TM Used for construction of genomic DNA library, Cm^r Epicentre

pGEM-T easy T/A cloning vector, Ap^r Promega Inc.

pDrive T/A cloning vector carrying T7 & SP6 RNA polymerase, Km^r, Ap^r Qiagen pCPP2988 pBluescriptII SK^- carrying 1.5 kb HindIII-SalI terminator-lacking

nptII gene fragment from pRZ102

Aflano et al. (1996)

pNCHU1103 1.1 kb pVirB1-F-NdeI/pVirB1-R-EcoRI-generated fragment containing virB1 from Xcv Xvt122 cloned in pGEM-T easy

This study

pNCHU1186 1.1 kb pVirB1-F-NdeI/pVirB1-R-EcoRI -generated fragment containing virB1 from Xcv Xvt45 cloned in pGEM-T easy

This study

pNCHU1224 30 kb EcoRI fragment containing virB1 from Xcv Xvt45 cloned in pCC1BAC^TM

This study

pNCHU1267 1.2 kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1268 2.2 kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1269 2.6 kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1270 2.8 kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1271 3.2 kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1272 5.0 kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1286 18 kb EcoRI fragment containing virB1 from Xcv Xvt122 cloned in pCC1BAC^TM

This study

pNCHU1287 6 kb HindIII fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1288 2.2 kb PstI-HindIII fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1289 1.3 kb PstI fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1290 2.1 kb PstI fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1291 4kb EcoRI fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1292 2 kb EcoRI-HindIII fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1293 1.2 kb EcoRI-HindIII fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1294 1.5 kb EcoRI-HindIII fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1295 1.3 kb EcoRI-HindIII fragment from pNCHU1286 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1393 17 kb EcoRI fragment containing virB1 from Xcv Xvt45 cloned in pCC1BAC^TM

This study

pNCHU1363 6kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1364 7kb EcoRI fragment from pNCHU1224 subcloned into pCC1BAC^TM

This study

pNCHU1387 3 kb EcoRI-HindIII fragment from pNCHU1363 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1388 1.7 kb HindIII fragment from pNCHU1363 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1389 1.3 kb EcoRI-HindIII fragment from pNCHU1363 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1390 3 kb EcoRI-BamHI fragment from pNCHU1364 subcloned into pBluescriptII SK

-This study

pNCHU1391 4 kb EcoRI- BamHI fragment from pNCHU1364 subcloned into pBluescriptII SK

-This study pNCHU1394 4.7 kb HindIII fragment from pNCHU1393 subcloned in pSK This study pNCHU1502 1.2 kb SacII-EcoRI fragment from pNCHU1394 containing This study

upstream region of virB11 from Xvt45 cloned in pCPP2988 pNCHU1503 1.2 kb pXvt45-VirB11-SalI-F2/PXvt45-VirB11-XhoI-R-generated

SalI-XhoI fragment containing downstream region of virB11 from Xvt45 cloned in pBBR1MCS-5

This study

pNCHU1504 2.7 kb SacI-SalI fragment from pNCHU1502 cloned in pNCHU1503, creating Xvt45 virB11 non-polar mutant.

This study

pNCHU1506 1.2 kb pXvt122-VirB11-XbaI-F/pXvt122-VirB11-HindIII-R -generated XbaI- HindIII fragment containing downstream region of virB11 from Xvt122 cloned in pCPP2988

This study

pNCHU1507 1.2 kb pXvt122- VirB11-XhoI-F/pXvt122-VirB11-KpnI-R -generated XboI-KpnI fragment containing upstream region of virB11 from Xvt122 cloned in pBBR1MCS-5

This study

pNCHU1508 2.7 kb XbaI-XhoI fragment from pNCHU1506 cloned in pNCHU1507, creating Xvt122 virB11 non-polar mutant.

This study

pNCHU1699 1.2 kb pXvt122-VirB4-XbaI-F/pXvt122-VirB4-EcoRI-R-generated XbaI- EcoRI fragment containing upstream region of virB4 from Xvt122 cloned in pCPP2988

This study

pNCHU1700 1.2 kb pXvt122-VirB4-XhoI-F/pXvt122-VirB4-KpnI-R-generated XhoI-KpnI fragment containing downstream region of virB4 from Xvt122 cloned in pBBR1MCS-5

This study

pNCHU1701 2.7 kb SacI-SalI fragment from pNCHU1699 cloned in pNCHU1700 creating Xvt122 virB4 non-polar mutant.

This study

pNCHU1705 1.2 kb pXvt45-VirB4-XbaI-F/pXvt45-VirB4-EcoRI-R-generated XbaI-EcoRI fragment containing downstream region of virB4 from Xvt45 cloned in pCPP2988

This study

pNCHU1706 1.2 kb pXvt45-VirB4-XhoI-F/pXvt45-VirB4-KpnI-R-generated XboI-KpnI fragment containing upstream region of virB4 from Xvt45 cloned in pBBR1MCS-5

This study

pNCHU1708 2.7 kb XbaI-XhoI fragment from pNCHU1507 cloned in pNCHU1706, creating Xvt45 virB4 non-polar mutant.

This study

表3-2.研究中所使用之引子 Table 3-2. Primers used in this study

Primer Sequence Restriction

enzyme pVirB1-F-NdeI 5’-GACTCATATGCTGCCTGGCATGGAG-3’ NdeI pVirB1-R-EcoRI^＊ 5’-GCCTGAATTCYTAAAAAACRAATGCKSTRTC-3’ EcoRI pXvt122-VirB11-XbaI-F 5’-TGGTTCTAGACGGCGATAATGTTGTCG-3’ XbaI

enzyme pVirB1-F-NdeI 5’-GACTCATATGCTGCCTGGCATGGAG-3’ NdeI pVirB1-R-EcoRI^＊ 5’-GCCTGAATTCYTAAAAAACRAATGCKSTRTC-3’ EcoRI pXvt122-VirB11-XbaI-F 5’-TGGTTCTAGACGGCGATAATGTTGTCG-3’ XbaI

在文檔中 利用AFLP分析茄科細菌性斑點病菌之變異性並選殖與致病性相關之基因產物 (頁 81-105)