第二章 利用 AFLP 分析茄科細菌性斑點病菌之變異性及探討 XopE2 有效蛋白與致病
2.4 討論
茄科細菌性斑點病是台灣番椒及番茄栽培區之重要病害，尤其在高溫多溼季節時 發生更為普遍，主要是由 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 所引起。根據徐氏 (1998)的研究，此十四株菌株依據澱粉水解及果膠分解活性的有無，可歸類為 X.
campestris pv. vesicatoria A 群 (= X. axonopodis pv. vesicatoria) 和 X. campestris pv.
vesicatoria B 群(=X. vesicatoria)。本研究利用 AFLP 技術，配合 TaqI-GA IR700 和 MseI-NN (NN 代表 AC、AG、CA、CT、GA、GT、TC 及 TG)作為選擇性增幅反應(selective amplification)的引子組合，來評估十四株 X. campestris pv. vesicatoria 菌株的差異。從 建立好的八張AFLP 圖譜 (圖 2-1 為利用 TaqI-GA IR700 和 MseI-GA 引子所得到的其 中一張圖譜) 顯示，A 群菌株較為多型性，而 B 群菌株則為一致性。選殖其中的一條 多型性片段，經比對後與 X. campestris pv. vesicatoria 85-10 的 xopE2 基因是相同的，
屬於第三型分泌系統的effector 蛋白(Thieme et al., 2007)。於本研究中，發現來自 A、
B 群菌株間的 XopE2 蛋白具有以下的特性，(1)從胺基酸序列和兩側區域的基因組成 看來，A、B 群間具有極度差異性，(2) xopE2 突變會影響 Xcv B 群菌株對番茄的毒性，
(3)大量表現 A 群或 B 群的 XopE2 蛋白皆能降低細菌的繁殖與病徴的嚴重性，(4) A 群或B 群的 XopE2 蛋白皆能抑制 P. syirngae pv, syringae 在煙草上引發的過敏性反應。
茄科細菌性斑點病依形態與演化的關係在分類上一直是有爭議的 (Jones et al., 2000)。Stall (1994)和 Vauterin (1990)等人依其生理、化學、形態等特性，把 X. campestris pv. vesicatoria (Xcv)分為 A 群及 B 群，隨後，A 群菌株重新命名為 X. axonopodis pv.
vesicatoria，而 B 群菌株則修訂為新種 X. vesicatoria (Vauterin et al., 1995)。Jones 等人 於2000 年根據更詳細型態鑑定和基因型分類技術，發現 X. axonopodis pv. vesicatoria 菌株間具異質性，又可區分出A 群和 C 群，C 群重新歸屬於 X. axonopodis 的一個病 原型稱 X. perforans (Jones et al., 2000)。本研究中從 AFLP 分析結果顯示，採用的 A
群供試菌株彼此之間具有遺傳差異性，所以台灣是否也有 C 群菌株的分佈是值得進
一步探討的問題。
從本研究所使用 Xcv 兩群的 XopE2 蛋白的胺基酸序列和兩側區域的基因組成看 來，Xcv Xvt122 (A 群)和 Xcv Xvt45 (B 群)間具差異性，所以根據 xopE2 基因兩側的
序列設計適合的引子對，利用 PCR 的技術來區分兩群菌株是值得嘗試的。兩菌群的
xopE2 基因附近可發現有 Cointegrate resolution protein T, XCV 2279 (圖 2-5A)或 Phage-related integrase (圖 2-5B)存在，顯示 xopE2 基因從其他細菌經水平基因轉移方 式 (horizontal gene transfer)而來，此現象從病原性的演化觀點上看來應具有某些特別 的意義(Hacker and Kaper, 2000)。例如，某些無毒性基因可經水平基因轉移方式嵌入 細菌基因體，因為此基因的存在，有助於其對植物的毒性、病徵發展及繁殖速度造成 某些選擇性的優勢 (Alfano and Collmer, 2004; Rohmer et al., 2004)，以 B 群菌株而言，
xopE2 基因的突變會有毒性降低的效果，正可回應此論點 (圖 2-7C、D)。
來自 Pseudomonas、Ralstonia 和 Xanthomonas 菌屬的 AvrPphE (已被重新命名為 HopX)、XopE1、XopE2 和其他同源蛋白是屬於 HopX 家族蛋白，此家族包含兩個次 家族HopX1 和 HopX2 (Rohmer et al. 2004; Lindeberg et al. 2005; Nimchuk et al., 2007;
Thieme et al., 2007)。Xcv 85-10 (=Xcv groupA= X. axonopodis pv. vesicatoria)的 XopE1
和XopE2 其胺基酸有 69 %的一致性，同屬於 HopX2 次家族(Thieme et al., 2007)。本 研究中，所有B 群菌株 (=X. vesicatoria)的 xopE2 基因不只存在於染色體上，亦存在 於質體上(圖 2-2C)，但 A 群菌株中，除了品系 Xvp169、Xvp182 和 Xvp197 外，大部 份的菌株都只有位於染色體的一套基因。而根據南方雜合反應，以 xopE1 基因當探 針，顯示 xopE1 基因似乎只存在於 A 群菌株而不存在 B 群菌株。兩菌群之間 xopE1 基因存在與否以及質體上是否能獲得 xopE2 基因等現象，說明彼此之間的演化可能是 由不同的路徑來進行。
本研究中 A 群菌株(Xcv Xvt122)的 xopE2 基因 (xopE2A)突變後，並不影響病原菌 在感病番茄品種(Bony Best L305) 上菌量的生長和病斑的形成。在 Thieme 等人研究中 (2007)也發現以 Xcv 85-10 的 xopE2 基因突變株接種感病甜椒品種(ECW)對致病力無 影響效果，在 X. campestris pv. campestris 菌株中，與 HopX2 同源的 avrXccE1 基因亦
有相同結果 (Castañeda et al., 2005; Thieme et al., 2007)。至於 XopE2A和其他同源的基
因在毒力上看不出貢獻，此乃因第三型分泌的 effector 蛋白在功能上具有互補性
(functional redundancy) (Alfano and Collmer, 2004, Kay and Bonas, 2009)。B 群菌株(Xcv Xvt45)的 xopE2 基因(xopE2B)突變後，雖然含有一套 xopE2 在質體上，但仍會降低其 在感病番茄品系的增殖能力，意謂著B 群菌株擁有不同的第三型分泌的 effector 蛋白 (如缺乏 xopE1 基因)，或位於質體上的 xopE2 基因產物也不能互補位於染色體上的 xopE2 基因產物之功能。此外，大量表現兩群的 XopE2 蛋白均能降低細菌在感病寄 主的生長量達10 倍之差，同時減緩病斑的形成(圖 2-8)，此現象和其同源蛋白 AvrPphE 有相似之點，Mansfield 等人於 1997 年曾提出，P. syringae pv. phaseolicola 不同品系 的 AvrPphE 蛋白，其對偶基因(allele)序列的變異會改變其對不同的大豆品種的毒力 性，具有“識別變阻器”(recognition rheostat)的特色，“識別變阻器”觀念由 Jones 和 Dangl (1996)等人提出，認為些微的改變能造成功能上的差異(如產生 HR 的反應)，可 能和表現蛋白量和是否具活性狀態 (active form)有關，辨認和反應並不只是控制於開 關(on/off)，而是量的效應。但發生在 Xcv 和番茄或甜椒上的交互作用上是經由什麼 機制目前並不清楚。
目前已發現許多 effector 蛋白能抑制由基因對基因所引發的防禦反應(effector- triggered immunity, ETI)，而造成對親和性或非寄主植物的致病力(Abramovitch et al., 2003; Jamir et al., 2004; Kang et al., 2004; Fujikawa et al., 2006; Cunnac et al., 2009)。ETI 防禦反應截然不同於PAMP-triggered immunity 防禦反應，ETI 的誘發在於植物的抗性 蛋白與病原菌的effector 蛋白發生辨認，產生局部組織快速壞疽現象，即為程式性細 胞死亡，而有效抑制病原菌生長及擴散，也就是所謂過敏性反應(Cunnac et al., 2009)。
藉由抑制程式性細胞死亡，如抑制 HopPsyA 所引起的過敏性反應，可使病原菌逃脫
因過敏性反應而限制其增生的機制，為成功地存活於寄主中的策略之一(Tsiamis et al., 2000; Abramovitch et al., 2003; Jamir et al., 2004; Kang et al., 2004; Fujikawa et al., 2006)。目前，已有報導指出 HopX 家族具有對 Nicotiana spp 引發細胞死亡或抑制程 式性細胞死亡的生物功能(Cunnac et al., 2009)。例如，P. syringae 的 HopPsyA 蛋白可
誘導植物的抗性表現，而其於菸草及阿拉伯芥細胞所誘導的細胞死亡，即可被 P.
syringae pv. tomato DC3000 的 HopX1 蛋白所抑制 (Jamir et al., 2004；Guo et al., 2009)。本研究中顯示，來自兩群的 XopE2 蛋白 (XopE2A和 XopE2B) 均能透過第三 型分泌系統，進入煙草植物細胞內而抑制 P. syringae pv. syringae 61 的 HopPsyA 造成 的過敏性反應(圖 2-9)；而對 Xcv85-10 而言，XopE1 會造成 N. benthamiana 植物細胞 的死亡，XopE2 則會引發 Solanum pseudocapsicum 植物細胞的死亡 (Thieme et al., 2007)，XopE2 蛋白因在不同的非寄主作物上表現至少兩種的功能，可知其生物功能 比預期的複雜。
HopX 家族蛋白屬於具有保留性三元催化胺基酸的 TGase (transglutaminase)家族 (Makarova et al., 1999; Nimchuk et al., 2007)。將 HopXPph race4蛋白中可能的催化胺基 酸，包括C179、H215和 D233進行突變後，可破壞其對抗病大豆品系(表現R2 蛋白)的 無毒性反應，同時也會抑制其在阿拉伯芥上所造成的細胞死亡。如同HopXPph race4的 反應結果，HopXPto DC3000和HopXPsy B728a在表現R2 的大豆品系上所造成過敏性反應，
也和保留性三元催化胺基酸有關(Nimchuk et al., 2007)。然而，本研究中將 XopE2 蛋 白的保留性三元催化胺基酸 (C159)和 His 硫醇蛋白酶胺基酸 (H47)突變後，仍然保有
完整 XopE2 蛋白所具有的功能，依然具有減低對感病植物的致病力和抑制過敏性反
應的能力(圖 2-8、圖 2-9)，意謂著 XopE2 蛋白與植物細胞內標靶 (target)的辨識是不 同於 HopX 蛋白，或者是另有其他的 domain 參與其生物功能。Xcv 兩菌群的 XopE2(XopE2A 和 XopE2B) 在 N 端 皆 具 有 保 留 性 N-myristoylation motif ， 此 N-myristoylation motif 具有趨使 effector 蛋白與寄主細胞膜辨認的功能 (Nimchuk et al., 2000; Shan et al., 2000; Robert-Selaniantz et al., 2006; Thieme et al. 2007)。此 motif 對 Xcv85-10 的 XopJ 蛋白而言，為引發 N. benthamiana 植物細胞死亡所必須，相反地，
將XopE1 的第二個胺基酸由 glycine 置換為 alaine，破壞此 N-myristoylation motif 後，
卻會加速且加強細胞死亡的反應 (Thieme et al., 2007)。究竟本研究中 XopE2 蛋白的 生物功能是否需要此motif，仍需進一步評估。
表2-1. 研究中所使用之菌株及質體
Table 2-1. Bacterial strains and plasmids used in this study
Designation Relevant characteristics Source or reference Strains
E. coli
DH10B endA1 hsdR17 recA1 relAΔ(argF-lacZYA)U169Φ80d lacZΔM15 Life Sciences Technologies (Gaithersburg, MD) EPI300TM E. coli carrying inducible trfA gene for amplification of high copy
number. Used for genomic DNA library.
CopyControlTM BAC Cloning Kit
(Epicentre) MC4100 F-araD139Δ(argF-lacZYA)U169 relA rpsL150 flb-5301 ptsF25
deoC1 thi, Smr
Casadaban (1976)
A. tumefaciens LBA4404 Wild type Life Technologies
X. c. pv. vesicatora Xvt12, Xvt28, Xvt48,
Xvt122, Xvt185,
Wild types isolated from tomato, classified into group A, no amylolytic activity
Hsu (1998)
Xvp169, Xvp182, Xvp186, Xvp194, Xvp197
Wild types isolated from pepper, classified into group A, no amylolytic activity
Hsu (1998)
Xvt45, Xvt46, Xvt147, Xvt148
Wild types isolated from tomato, classified into group B, amylolytic activity
Hsu (1998)
Plasmids
pBluescript II SK+ ColE1 mcs-lacZ, Apr Stratagene
pBBR1MCS-5 A broad host range vector containing lac promoter, compatible to IncP, IncQ, or IncW group plasmids, Gmr
Kovach et al. (1995)
pCC1BACTM Used for construction of genomic DNA library, Cmr Epicentre
pGEM-T easy T/A cloning vector, Apr Promega Inc.
pDrive T/A cloning vector carrying T7 & SP6 RNA polymerase, Kmr, Apr Qiagen pCPP2988 pBluescriptII SK- carrying 1.5 kb HindIII-SalI terminator-lacking
nptII gene fragment from pRZ102
Aflano et al. (1996)
pHIR11 P.s. pv. sringae 61 hrp/hrc/hrmA cluster in pLAFR3, Tcr Huang et al. (1988) pNCHU1068 1.3 kb pavrXacE3-F/pavrXacE3-R-generated fragment containing
xopE2 from Xcv Xvt122 cloned in pGEM-T easy
This study
pNCHU1070 1,1 kb pavrXacE3-F/pavrXacE3-R -generated fragment containing xopE2 from Xcv Xvt45 cloned in pGEM-T easy
This study
pNCHU1071
~pNCHU1073
1,1 kb pavrXacE3-F/pavrXacE3-R -generated fragment containing xopE2 from Xcv Xvt46, Xvt147, Xvt148 cloned in pGEM-T easy
This study
pNCHU1075
~pNCHU1084
1,3 kb pavrXacE3-F/pavrXacE3-R-generated fragment containing xopE2 from Xcv Xvt12, Xvt28, Xvt48, Xvt185, Xvp169, Xvp182, Xvp186, Xvp194, Xvp197 cloned in pGEM-T easy
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pNCHU1200 1.1 kb pavrXacE3-F-XbaI/pavrXacE3-R-SmaI-generated fragment containing xopE2 from Xcv Xvt45 cloned in pBI121
This study
pNCHU1201 1.3kb pavrXacE3-F-XbaI/pavrXacE3-R-SmaI-generated fragment containing xopE2 from Xcv Xvt122 cloned in pBI121
This study
pNCHU1226 30 kb EcoRI fragment containing xopE2 from Xcv Xvt45 cloned in pCC1BACTM
This study
pNCHU1227 7 kb EcoRI fragment containing xopE2 from Xcv Xvt122 cloned in pCC1BACTM
This study
pNCHU1275 7.8 kb EcoRI-EcoRV fragment from pNCHU1226 subcloned in pBluescript II SK
This study
pNCHU1276 5.8 kb EcoRI-EcoRV fragment from pNCHU1226 subcloned in pBluescript II SK
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pNCHU1229 1 kb pXvt122-8K-7-XbaI-F/pXvt122-8K-7-HindIII-R-generated XbaI-HindIII fragment containing upstream region of xopE2 from Xvt122 cloned in pCPP2988
This study
pNCHU1300 0.9 kb pXvt122-8K-7-XhoI-F/pXvt122-8K-7-KpnI-R-generated XhoI-KpnI fragment containing downstream region of xopE2 from Xvt122 cloned in pBBR1MCS-5
This study
pNCHU1301 2.5 kb XbaI-XhoI fragment from pNCHU1229 cloned in pNCHU1300, creating Xvt122 xopE2 non-polar mutant.
This study
pNCHU1360 1 kb pXvt45852-XhoI-F/Xvt45857-KpnI-R-generated XhoI-KpnI fragment containing downstream region of xopE2 from Xvt45 cloned in pBBR1MCS-5
This study
pNCHU1361 1 kb pXvt45857-XbaI-F/pXvt45857-HindIII-R-generated
XbaI-HindIII fragment containing upstream region of xopE2 from Xvt45 cloned in pCPP2988
This study
pNCHU1362 2.5 kb XbaI-XhoI fragment from pNCHU1361 cloned in pNCHU1360, creating Xvt45 xopE2 non-polar mutant.
This study
pNCHU1921 (pNCHU1925)
1.1 kb pXvt45E3-F-XhoI/pXvt45E3-R-XhaI-generated fragment containing xopE2 from pNCHU1068 (pNCHU1070) and cloned in pBBR1MCS-5
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pNCHU1922 (pNCHU1926)
1.1 kb pXvt45E3-F-XhoI/prH47A-1 and
prH47A-3/pXvt45E3-R-XhaI-generated XopE2(H47A) fragment from pNCHU1068 (pNCHU107) and cloned in pBBR1MCS-5
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pNCHU1923 (pNCHU1927)
1.1 kb pXvt45E3-F-XhoI/prC159A-1 and
prC159A-3/pXvt45E3-R-XhaI-generated XopE2(C159A) fragment from pNCHU1068 (pNCHU107) and cloned in pBBR1MCS-5
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pNCHU1924 (pNCHU1928)
1.1 kb pXvt45E3-F-XhoI/prC159A-1 and
prC159A-3/pXvt45E3-R-XhaI-generated XopE2(H47AC159A) fragment from pNCHU1914 (pNCHU1918) and cloned in pBBR1MCS-5
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表2-2. 研究中所使用之引子 Table 2-2. Primers used in this study
Primer Sequence Restriction
enzyme pavrXacE3-F 5’-GTGAGGCGAAGCGAAGCGGA-3’
pavrXacE3-R 5’-TCACCAACTCAAGGGGGGGC-3’
pavrXacE3-F-XbaI 5’-AGCCTCTAGAACCATGGGGCGGAGCGAA-3’ XbaI pavrXacE3-R-SmaI 5’-ATTCACCCCGGGTTTCACCAACTCAAGGG-3’ SmaI pXvt122-8K-7-XbaI-F 5’-ATCGCCTCTAGACATGCGATGGAGAACC-3’ XbaI pXvt122-8K-7-HindIII-R 5’-GCGATGAAGCTTTCGAGTTCGCCAACGG-3’ HindIII pXvt122-8K-7-XhoI-F 5’-TGACGCTCGAGCAAGCCGGATGAGCG-3’ XhoI pXvt122-8K-7-KpnI-R 5’-GGCCGGTACCGCCTGGACGAACTCG-3’ KpnI pXvt45857-XbaI-F 5’-GCGGTCTAGACCGTTTGCCCGAGCTG-3’ XbaI pXvt45857-HindIII-R 5’-CCGAAAGCTTGGCTGGGATGGCGAAG-3’ HindIII pXvt45852-XhoI-F 5’-GACGCTCGAGTAAACCGGATGAGCG-3’ XhoI pXvt45857- KpnI-R 5’-TGGCGGTACCGATCAACGCAACCTTG-3’ KpnI pXvt45-E3-F-XhoI 5’-CGCCACTCGAGCCTCTACAGTCACTG-3’ XboI pXvt45-E3-R-XbaI 5’-GGTTTTCTAGAGCGTCACCAACTCAAG-3’ XhaI prH47A-1 5’-CACCAAGCCAGCCAGGCTGGGTG-3’
prH47A-3 5’-CACCCAGCCTGGCTGGCTTGGTG-3’
prC159A-1 5’-TGTGGTCAGCGTTGCCTGCC-3’
prC159A-3 5’-GGCAGGCAACGCTGACCACA-3’
表2-3.研究中所使用之 Xanthomonas 菌株
Table 2-3. List of Xanthomonas spp. used in this study
Strains Host Region Race
Xanthomonas campestris pv. vestrictoria (Xcv) Group A: non-amylolytic
Xvt-12 Tomato5138 Taichung T1 P8
Xvt-28 Tomato Furan Co T1 P1
Xvt-48 Tomato Nantou T1 P2
Xvt-122 Tomato Pingtung T1 P3
Xvt-185 Tomato(ASVEG 5) Hsinchu T1 P7
Xvp-169 Queen Star Nantou T1 P3
Xvp-182 Pepper Hualien T1 P8
Xvp-186 Pepper Hualien T1 P1
Xvp-194 H. Pepper Tainan T1 P7
Xvp-197 H. Pepper Tainan T1 P2
Xanthomonas campestris pv. vestrictoria (Xcv) Group B: amylolytic
Xvt-45 Tomato Nantou T2 P0
Xvt-46 Tomato Nantou T2 P0
Xvt-147 Tomato Nantou T2 P0
Xvt-148 Tomato Nantou T2 P0
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc)
Xcc 70 cabbage Changhuwa
Xanthomonas campestris pv. diffenbachiae (Xcd)
Xcd A49 Anthrium TainanXanthomonas campestris pv. oryzae (Xco)
Xco 84 rice Nantou
Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac)
Xac XW19 Valencia orange Taiwan
表2-4. AFLP 片段分析
Table 2-4. Similarities at the protein level between AFLP fragment sequences and the sequences in genebank.
AFLP fragments
Size (bp)
Matching sequence from the database
Origin of matching sequence and accession no.
% Similarity (BLASTX Evalue) Xvt12-1 262 none
Xvt48-3 186 type I site-specific deoxyribonuclease (modification subunit)
Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria str. 85-10, YP_362244
98 % (6e-24)
Xvt122-4 271 avirulence protein AvrXacE3
Xanthomonas axonopodis pv.
Xanthomonas axonopodis pv.