材料與方法

2.2.1 供試菌株、質體、菌體生長環境

本研究所使用菌株與質體之特性及其來源分別列於表 2-1。Escherichia coli 以 Luria-Bertani (LB) medium 培養於 37 ℃。Xanthomonas 菌株以 Luria-Bertani (LB)或 523 medium (sucrose 10 g/l, casein hydrolysate 8 g/l, yeast extract 4 g/l, K2HPO4 2 g/l, MgSO47H2O 0.3 g/l) 培養於 28 ℃，Agrobacterium 以 Luria-Bertani (LB) medium 培養 於30 ℃。培養基依所需添加抗生素，其濃度分別如下：ampicillin (Amp)，100 μg/ml；

Chloramphenicol (Cm)，12.5 μg/ml；gentamycin (Gm)，10μg/ml；kanamycin (Km)，50 μg/ml；tetracyclin (Tc)，20 μg/ml。

2.2.2 重組 DNA 技術

實驗過程中所使用的各項生物技術包括：染色體質體DNA 之抽取 (chromosome or plasmid DNA extraction)，限制酵素的使用 (restriction enzyme digestion)，膠體電泳 分 (agarose gel electrophoresis)，DNA 連接作用，DNA 片段回收 (gel filtration kit, QIAGEN Chatsworth, CA)，CaCl2化學方法之菌體轉形作用 (transformation)等係參考 Sambrook 等人所述之方法 (Sambrook et al., 1989)，電穿孔法根據 Bio-Rad 出廠的 GenePulser 使用手冊操作。聚合酵素連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 的溶 液為每20 μl 之反應液中包含 0.1-0.5 μg 模板 DNA，0.5 μM 引子對 (primers)，0.2 mM dNTP (MDBio, Inc)，1X Taq reaction buffer (Protech)，以及 4 unit 的 KlenTaq DNA polymerase (Protech)/0.5 unit Pfu DNA olymerase (8:1)。PCR 的反應條件為：94 ℃初始 加熱5 分鐘，接著重複進行下列循環： 94 ℃反應 1 分鐘、55 至 65 ℃ (依據引子對之 Tm 值特性) 反應 1 分鐘、72 ℃反應 1~2 分鐘(所需時間依據所增幅之片段長度決定，

每kb 反應 60 秒)，總共作用 32 循環，最後以 72 ℃反應 10 分鐘作為最終之增幅反應。

研究中所需的引子對則列於表2-2。

2.2.3 染色體 DNA (Genomic DNA)之製備

(1) AFLP 分析和染色體基因庫建構採用之法

供試菌株以5 ml LB 液體培養液隔夜培養後，以 3,000 g 離心收集菌體並除去上 清液。以1 ml 的 pett IV 緩衝液 (1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl［pH 8.0］) 懸浮菌體，

再次離心收集菌體，並以1 ml 的 STE 緩衝液 (0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 懸浮菌體，再次離心收集菌體後，以 0.5 ml STE 緩衝液懸浮菌體，接 著加入50 μl 10% SDS 並移至 65 ℃水浴槽放置 0.5~1 小時，待菌液由渾濁轉為澄清後 移至室溫冷卻，並且加入150 μl 10 M 的 NH4OAc，均勻混搖數次直至均質化，以 12,000 g 離心 30 分鐘並收集上清液，加入 5 μl RNAase (10 mg/ml)於 37 ℃水浴槽作用 1.5~2 小時，接著加入相同體積的phenol:chloroform (1:1, pH 8.0)進行蛋白質之萃取。輕搖 離心管至上清液呈乳化狀，於 4 ℃下以 12,000 g 離心 15 分鐘以分離有機層與水層。

利用去尖頭之滴管吸取上清液至另一離心管，加入等體積的isopropanol 和 1/10 體積 的3 M NaOAc，並置於-20 ℃ 1 小時以上以沉澱核酸，接著於 4 ℃下 12,000 g 離心 60 分鐘收集 DNA 至管底。去除上清液並以 70 %酒精沖洗管壁與管底的核酸並風乾 後，將DNA 溶於 50 的 μl 的 TE 緩衝液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA）中，

將染色體DNA 置於 4 ℃冰箱保存。

(2) 南方轉漬雜合反應採用之法

供試菌株以5 ml LB 液體培養液隔夜培養後，以 3,000 g 離心收集菌體並除去上 清液。以1.5 ml 的 STE 緩衝液 (0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 懸 浮菌體並分裝至兩個1.5 ml 微量離心管，再次離心收集菌體並去除上清液，以 0.75 ml STE 緩衝液懸浮菌體，接著加入 75 μl 10% SDS 並移至 65 ℃水浴槽放置 1 小時，待 菌液由渾濁轉為澄清後移至室溫冷卻，並且加入50 μl proteinase K (20 μg/ml)於 56 ℃ 水浴槽作用2 小時，接著加入相同體積的 phenol:chloroform (1:1, pH 8.0)進行蛋白質 之萃取。輕搖離心管至有機層與水層均勻混合後，於 4 ℃下以 12,000 g 離心 10 分鐘

以分離有機層與水層。利用去尖頭之滴管吸取上清液至另一離心管，並且加入10 μl

RNAase (10 mg/ml)於 37 ℃水浴槽作用 1 小時，再以相同體積的 phenol:chloroform (1:1) 萃取蛋白質，重複數次至有機層與水層間的蛋白質不再出現，再加入相同體積的 chloroform/isoamylalcohol (24:1)並且輕搖混合。以 12,000 g 離心分離水層後，加入等 體積的isopropanol 並置於-20 ℃1 小時以上以沉澱核酸，接著於 4 ℃下 12,000 g 離心 20 分鐘將 DNA 收集至管底。去除上清液並以 70 %酒精沖洗管壁與管底的核酸並風 乾後，將DNA 溶於 100~200 μl 的 TE 緩衝液 (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA) 中，將染色體DNA 置於 4 ℃冰箱保存。

2.2.4 AFLP 分析

AFLP 分析方法依據廠商所提供的使用手冊 (AFLP Expression Analysis Kit, LI-COR Biosciences) 操作。大致方法如下所述：250 ng 染色體 DNA 以 TaqI/MseI 截 切完全後，與相同限制酵素連合子(adapters)進行接合作用。取 2.5 μl 10 倍稀釋的接合 反 應 液 作 為 預 增 幅 反 應(Pre-amplification) 的 模 板 DNA ， 引 子 對 為 廠 商 提 供 的 MseI-N/TaqI-N，PCR 反應條件設定為 94 ℃作用 30 秒，56 ℃ 作用 1 分鐘，72 ℃作 用1 分鐘，重覆此三步驟 20 次後，保持於 4 ℃。接著進行選擇性增幅反應 (Selective amplification)，以 10 倍稀釋的 pre-amp DNA 為模板，引子對為 MseI+NN primer /IRDye^TM 700-labeled TaqI+NN primer，NN 為任意的核苷酸，依廠商所提供共有 64 種引子對組合。PCR 反應條件設定為“touchdown”程式，以 94 ℃作用 30 秒(denature)，

65 ℃作用 30 秒(anneal)，72 ℃作用 1 分鐘(amplification)，重覆此三步驟 12 次，但每 一循環將annealing 的溫度降低 0.7 ℃；接著改變反應條件為 94 ℃ 30 秒，56 ℃ 30 秒，72 ℃ 1 分鐘，重覆此三步驟 23 次，最後保持於 4℃。反應終產物則利用 LI-COR 之DNA 定序儀，以 6.5 % polyacrylamide denaturing gel (KB^PlusTM)進行電泳分析，以 0.8 X TBE 為緩衝液，電壓控制為 1500 V、溫度為 45 ℃，並以遠紅外線即時偵測與 紀錄分析結果。

2.2.5 選殖與定序 AFLP 片段

電泳分析後之膠片利用遠紅外線掃瞄儀 (LI-COR Odyssey^TM) 掃瞄，以刀片切取 並回收所需要的DNA 片段，將回收的膠片加入 20 μl 的 TE 緩衝液，經過數次重覆的 冷凍與解凍，於4℃下，以 15,000 g 離心 20 分鐘，回收之 DNA 即溶於 TE 緩衝液。

以此回收的DNA 為模板，加入 pre-amp 的引子對，進行增幅反應，反應條件為 94 ℃ 30 秒，56 ℃ 1 分鐘，72 ℃ 1 分鐘，重覆此三步驟 20 次。將增幅產物構築於 pGEM-T easy vector (Promega)，挑選數個重組質體，以 ABI 3700 自動化核酸定序儀 (中興大 學生物科技發展中心) 進行核酸序列分析。

2.2.6 選殖與定序 xopE2 基因

為選殖不同Xcv 菌株之 xopE2 基因，根據 NCBI 上註冊的 Xac306 avrXacE3 (現

更名為 xopE2) 基因序列，設計一組引子對 pavrXacE3-F/pavrXacE3-R，以不同品系的 Xcv 染色體 DNA 為模板進行 PCR，反應條件為 94 ℃作用 5 分鐘，94 ℃作用 1 分鐘，

65 ℃作用 1 分鐘，72 ℃作用 1 分鐘，2~4 步驟重覆 35 次，最後 72℃作用 10 分鐘。

將增幅產物構築於pGEM-T easy vector (Promega)，每個品系挑選 3 個重組質體，以 ABI3700 自動化核酸定序儀 (中興大學生物科技發展中心)進行核酸序列分析，利用 BLASTN 和 BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)於資料庫進行資料搜尋與比對，如 此可選殖出十四株Xcv xopE2 基因，分別命名為 pNCHU1068~pNCHU1084 (表 2-1)。

2.2.7 染色體基因庫之建構

(1)染色體 DNA 以 EcoRI 作非完整截切 (partial digestion)

將30 μg 的染色體 DNA 溶於最終體積為 1 ml 的 1 倍 EcoRI 溶液中，混合均勻。

依1~7 號標示 7 支 1.5 ml 離心管，取 60 μl 稀釋的 DNA 置於編號 1 的離心管，取 30 μl 稀釋的DNA 置於編號 2~7 的離心管。首先，取 1 μl (5 unit/μl)的 EcoRI 到編號 1 的離 心管中，均勻混合後取30 μl 的混合液到編號 2 的離心管中混勻，如此操作至編號 6 的離心管後，拾棄30 μl 的混合液，編號 7 的離心管則作為不含 EcoRI 的控制組。將

此7 管的混合液置於 37 ℃中作用 30 分鐘後，立刻加入 1 μl 的 0.5 M EDTA 終止反應。

取3 μl 的反應液以 0.8 %的洋菜膠分離 DNA，DNA 條帶在 15~20 kb 即為所要的 DNA 大小，以此方法可決定最適合的非完整截切酵素濃度。之後利用膠體電泳分析大量收 集10-25 kb 的 DNA 片段，並以 Elutrap Electro-Separation System (Schleicher & Schuell) 回收DNA。

(2)利用 CopyControl

^TM

BAC Cloning Kit (EPICENTRE)建構染色體基因庫

操作方法依據廠商提供之使用手冊，大致方法如下所述：取100 ng 回收的 DNA 與廠商提供的CopyControl pCC1BAC Cloning-Ready vector 進行接合作用，置於 16 ℃

隔夜反應後，以65 ℃處理 15 分鐘終止反應。接合反應液經過去鹽作用後，接合反應

液以電穿孔法送入TransforMax EPI300 E. coli

.

，並加入1 ml SOC medium 於 37℃培 養1 小時，最後取 50 μl 塗抹於含 chloamphenicol，X-gal and IPTG 的 LB 固體培養基，

置於37 ℃培養隔夜後，計算白色菌落的數目以評估染色體基因庫之建構是否完整。

2.2.8 南方轉漬雜合反應 (Southern hybridization)

(1)探針之製備

質體經限制酶處理後進行電泳分析，回收特定之 DNA 片段再以非放射性之 DIG (disodium2-chloro-5-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2’- (5’-chloro) tricycle [3.3.1.1^3,7] decan}-4-yl)-1-phenyl phosphate)標識作為探針，標定之方法參照廠商提供之手冊進行 (DIG Labeling Kit, Roche)。將質體 DNA 定量於 10 ng~3 μg 之間，以 100 ℃加熱 10 分鐘後立即置於冰上5 分鐘，使 DNA 保持單股之變性狀態。分別加入 2 μl dNTP labeling mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-dUTP)、2 μl hexanucleotide mixture (random primer)及 1 μl Klenow enzyme (2 unit/μl)，補水至總體積為 20 μl，混合均勻後於 37 ℃下作用 16 小時，再以 2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0)終止標定反應。加入 2 μl 4 M LiCl 及 60 μl 95%酒精並置於-70 ℃下至 少六小時以沉澱DNA，以 4 ℃、12,000 g 離心 20 分鐘，並以 100 μl 70 %酒精洗去鹽

類後再次離心 (12,000 g，5 分鐘，4 ℃)，去除上清液後將 DNA 真空乾燥並溶於 50 μl TE 緩衝液中並保存於-20 ℃中，以備核酸雜合反應進行。

(2)轉漬 DNA 至 Hybond-N 濾膜

將 5 μg EcoRI 截切完全的染色體 DNA，以 1 %瓊膠電泳分離後，將含 DNA 的 膠片置於0.25 N HCl 溶液中輕搖 20 分鐘，以去離子水沖洗後，再浸泡於鹼性緩衝液 (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl)中輕搖 30 分鐘，再以去離子水沖洗，接著浸泡於中和緩衝 液(1 M Tris-HCl[pH 8.0]，1.5 M NaCl)中輕搖 30 分鐘後準備轉漬。Hybond-N (Amersham)濾膜以 2 X SSC 緩衝液潤濕，將處理好的電泳膠片置於 Hybond-N 濾膜 上，以 2 X SSC 緩衝液為轉漬溶液，利用真空轉漬器 (Vacuum blotter model 785, Bio-Rad) 以真空度 5 in Hg 轉漬 40 分鐘。取出轉漬濾膜以 2 X SSC 緩衝液漂洗後，

置於乾淨的3 MM 濾紙上，以紫外光固定器 (UV stratalinker 1800, Stratagene) 進行聯 結(cross-linking)，使 DNA 固定在濾膜。

(3)前雜合反應 (pre-hybridization)與雜合反應 (hybridization)

將轉漬濾膜置於雜合管中，加入 10 ml 雜合溶液 (0.25 M NaHPO4[pH 7.2], 7 % SDS) 於 65 ℃進行前雜合反應至少 1 小時，再加入已處理之探針 (於 100 ℃加熱 10 分鐘接著立即置於冰上5 分鐘)，於 65 ℃進行雜合反應 12 小時以上。

(4)洗滌與偵測

雜合反應後，倒去含探針之雜合溶液，轉漬濾膜以Wash solution I (2 X SSC, 0.1 % SDS)於室溫下清洗二次，每次 10 分鐘；再以 Wash solution II (0.1 X SSC, 0.1% SDS) 於65 ℃下清洗二次，每次 15 分鐘。將轉漬濾膜以 Buffer I (0.1 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.3 % Tween 20, pH 8.0) 於室溫浸洗二次，每次 5 分鐘；加入適量的 Buffer II (含 0.5%

blocking regent 之 Buffer I) 於室溫下作用 30 分鐘。倒掉 Buffer II，加入以 Buffer II 稀釋10,000 倍之 10 ml 二次抗體溶液 anti-digoxigenin-alkaline phosphatase conjugate

(Roche)，於室溫下反應 30 分鐘。倒出二次抗體溶液後以 Buffer I 於室溫下沖洗濾膜 二次，每次15 分鐘；之後將轉漬濾膜於室溫下浸泡 Buffer III (0.1 M Tris-base, 50 mM MgCl2, 0.1 M NaCl, pH 9.5) 5 分鐘，再將轉漬濾膜置於塑膠袋中。將 CDP-Star^TM以 Buffer III 稀釋 100 倍，依 0.5 ml/100 cm²之比例加入內含轉漬濾膜的塑膠袋中，使其 均勻分布於轉漬濾膜上，反應10 分鐘之後抹除 CDP-Star 溶液，以 X-ray 底片進行壓 片10 分鐘後即可進行底片之顯影與定影。

2.2.9 菌落雜合反應 (Colony hybridization)

將細菌點在含 chloamphenicol 抗生素的 LB 固體培養基，於 37 ℃培養約 12~16 小時後 (菌落直徑大小以不超過 1 mm 為宜)，置於 4 ℃至少 30 分鐘。將圓形的 Hybond-N 濾膜放在含菌落的 LB 固體培養基上 1 分鐘，並以針頭在濾膜的外緣穿刺 三孔成不等邊三角形的記號後，以鑷子快速地將濾膜掀起，置於含有變性緩衝液 (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl) 的 3 MM 紙上 15 分鐘後，將濾膜放在乾淨的 3 MM 紙上約 1 分鐘以吸去多餘的變性緩衝液；再將濾膜放在含有中和緩衝液 (1 M Tris-HCl[pH 8.0]，1.5 M NaCl) 的 3 MM 紙上 15 分鐘後，再置於乾淨的 3 MM 紙上吸去多餘的中 和緩衝液；最後將濾膜放在含有2 X SSC 的 3 MM 紙上約 10 分鐘，再置於乾淨的 3 MM 紙上吸去多餘的SSC 緩衝液。以紫外光固定器 (UV stratalinker 1800, Stratagene) 進行 聯結(cross-linking)，使 DNA 固定在濾膜。取 1 ml Proteinase K (2 mg/ml)均勻佈在濾 膜上，以鋁箔包覆後，置於37 ℃至少 1 小時，再將濾膜放到清洗緩衝液 (5 X SSC, 0.1

% SDS, 1 mM EDTA)中，手戴手套將濾膜上菌體殘骸搓掉，直到膜上不再有顆粒殘留 為止，再將濾膜置於2 x SSC 中浸潤 1 分鐘，作後續的前雜合及雜合反應，方法同前

% SDS, 1 mM EDTA)中，手戴手套將濾膜上菌體殘骸搓掉，直到膜上不再有顆粒殘留 為止，再將濾膜置於2 x SSC 中浸潤 1 分鐘，作後續的前雜合及雜合反應，方法同前

在文檔中 利用AFLP分析茄科細菌性斑點病菌之變異性並選殖與致病性相關之基因產物 (頁 27-38)