結果

2.3.1 利用 AFLP 分析 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 菌株

本研究以篩選自台灣地區的十四株 X. campestris pv. vesicatoria 菌株作為 AFLP 分析的供試菌株，宿主各為番茄和甜椒，歸屬於不同的races (表 2-3)，Xvt12、Xvt28、

Xvt48、Xvt122、Xvt185、Xvp169、Xvp182、Xvp186、Xvp194、Xvp197 屬於 A 群，

各為T1Pn (n 為 1、2、3、7 及 8)品系，具澱粉分解能力，Xvt45、Xvt46、Xvt147、

Xvt148 屬於 B 群，皆為 T2P0 品系，不具澱粉分解能力(許氏, 1998)。於此，利用 AFLP 找尋基因標幟以期能更進一步分類這些品系，因於預備實驗中，以 EcoRI/MseI 截切 後所得到的AFLP 片段少於 TaqI/MseI 截切的結果，所以本實驗採用 TaqI-GA IR700 和 MseI-NN (NN 代表 AC、AG、CA、CT、GA、GT、TC 及 TG) 作為選擇性增幅反 應的引子組合，並建立八張AFLP 的圖譜。圖 2-1 為利用 TaqI-GA IR700 and MseI-GA

引子所獲得的其中之一張圖譜，結果顯示，來自 A 群的菌株間具有高度的多型性，

而 B 群菌株則較為一致性，由取得的影像挑選出比較獨特或表現量較多的多型性條

帶，片段Xvt12-1 在各菌株間為獨特的片段，片段 Xvt48-3 不出現分離自甜椒的菌株，

片段Xvt122-4 和 Xvt197-10 並不出現在 B 菌群，片段 Xvt148-6 只出現在 B 群，片段 Xvt186-8 出現在所有的 B 和部份 A 群，利用 LI-COR Odyssey^TM掃瞄後，回收DNA 進行選殖與定序。回收的六條DNA 片段，經由 NCBI BLASTX 比對結果列於表 2-4。

其中有三條DNA 片段在基因庫中搜尋不到相似的基因，Xvt48-3 與 type I site-specific deoxyribonuclease 有 98 %的同源性；Xvt197-10 為轉移酶 Tn5044/Tn3926；由 Xcv Xvt122 菌株取得的片段大小為 271bp (即 Xvt122-4)與 X. axonopodis pv. citri 306 的 AvrXacE3 (accession no. AAM39257) 胺基酸序列達 85 %相似性，與 X. campestris pv.

vesicatoria 85-10 的 XopE2 (accession no. AAM39257)有 92 %的相似性。XopE2 為新被 確認的第三型分泌系統effector 蛋白，可造成 Solanum pseudocapsicum 植物的細胞死 亡 (Thieme et al., 2007)，後續將探討 Xvt122-4 (XopE2)在兩群菌株間的差異。

2.3.2 xopE2 基因在 X. campestris pv. vesicatoria 菌株間具高度保留性

由 AFLP 分析的結果顯示，片段 Xvt122-4 (xopE2)並不出現在 B 群，為了瞭解 xopE2 在 Xanthomonas spp.不同族群間之差異，首先根據 Xac306 avrXacE3 的序列設 計一組引子，選殖出Xcv Xvt122 xopE2 完整的基因，以此當作探針進行南方雜合反 應。供試菌株除十四株 Xcv 菌株外，另外有四株 Xanthomonas spp.對照組菌株，X.

campestris pv. campestris 70 (Xcc 70)寄主為甘藍，X. campestris pv. diffenbachiae A49 (Xcd A49)寄主為火鶴，X. campestris pv. oryzae 84 (Xco 84)寄主為稻米，X. axonopodis pv. citri XW19 (Xac XW19)寄主為瓦倫西瓦柑橘 (表 2-3)。圖 2-2A 為所有菌株以 EcoRI 截切後之電泳膠片，以此膠片進行南方雜合反應 (圖 2-2B)，結果顯示十四株 Xcv 菌株和 Xco 84、Xac XW19 皆有 xopE2 基因的存在，而 Xcc 70、Xcd A49 則不具 有 xopE2 基因。大部份的 A 群 Xcv 菌株和 Xco 84 只有一個 copy 的 xopE2 基因，而 A 群中的 Xvp169、Xvp182 及 Xvp197 和所有的 B 群菌株則有二個 copy 的 xopE2 基 因。

根據 da Silva 等人(2002)的文獻指出，來自 X. axonopodis pv. citri 306 的 xopE2 (XACb0011，之前命名為 avrXacE3)位於 64 kb 的質體上，為了確定 xopE2 是否可能 存在於質體上，抽取十四株Xcv 菌株和 Xac XW19 的質體 DNA 進行南方雜合反應，

圖2-2C 結果顯示，B 群菌株和 A 群中的 Xvp169、Xvp182 及 Xvp197 有一個 copy 的 xopE2 基因是位於質體上，而對照菌株 Xac XW19 的 xopE2 基因也出現在質體上，和 X. axonopodis pv. citri 306 所述相同 (da Silva et al. 2002)。

2.3.3 A 群 XopE2 (XopE2

A

)與 X. campestris pv. vesicatoria 85-10 XopE2 的基因距離 (genetic distance) 較之 B 群 XopE2 (XopE2

_B

)為近

因為 xopE2 存在於本實驗的所有 Xcv 菌株中，為探討究竟此兩群菌株間 xopE2 是否有序列之變異來佐證AFLP 的結果，設計一組 pavrXacE3-F/pavrXacE3-R 引子對，

利用PCR 將十四株 Xcv 的 xopE2 進行選殖定序，由 Clustal W program 比對的結果顯 示 (圖 2-3)，無論是 A 群或 B 群，各群間所選殖出的 xopE2，其胺基酸序列幾乎是

99~100 %一致性 (少數菌株有 1-2 個胺基酸的差異)，而 A 群 (如 Xvt122 XopE2) 和 B 群 (如 Xvt45 XopE2)間也有 93 %一致性。此外，此十四株 Xcv 菌株皆具有保留性 N-myristoylation motif (G2) 和三元催化胺基酸 (catalytic triad)，這些特色亦存在於 HopX 蛋 白 家 族 內 ( 圖 2-4A; Nimchuk et al., 2007) 。 利 用 NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、vector NTI (Informax) 和 SDSC Biology Workbench (http://workbench.sdsc.edu)進行同源蛋白胺基酸比對和親源樹狀分析 (圖 2-4A、

2-4B)，Xcv 85-10 XopE2 和 Xac 306 XopE2、Xcv Xvt122 XopE2

、

Xcv Xvt45 XopE2 親源關係非常接近，胺基酸序列分別有98 %、97 %及 92 %的一致性 (identity)；而 Xcv 85-10 XopE2、Xcv Xvt122 XopE2 及 Xcv Xvt45 XopE2 則與同屬 HopX2 族群的 HopPmaB (P. syringae pv. maculicola)同源性較遠，分別為 79 %、78 %及 77 %的一致 性；而Xcv Xvt122 XopE2

、

Xcv Xvt45 XopE2 則與 Xcv 85-10 XopE1 的一致性約 62 % 及61 %。根據 XopE2 親源樹狀分析結果顯示，A 群 Xvt122 與 Xcv 85-10 的基因距離 較之B 群 Xvt45 為近。

2.3.4 以 xopE2 兩側基因序列可區分出 X. campestris pv. vesicatoria A 群和 B 群

根據前人研究指出，屬於 HopX1 族群的 avrPphE 存在於所有的 P. syringae pv.

phaseolicola 的品系中，其 DNA 序列的變異能導致菌株對某些寄主大豆植物毒性 (virulence)改變 (Stevens et al. 1998)。為證實 xopE2 (HopX2 族群)序列之差異是否會造 成毒性的改變，以及瞭解 xopE2 座落於 Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 基因體上之差異，

本實驗構築了 X. campestris pv. vesicatoria A 群 (以 Xcv Xvt122 為代表品系) 和 B 群 ( 以 Xcv Xvt45 為 代 表 品 系 ) 的 染 色 體 基 因 庫 (CopyControl^TM BAC Cloning Kit, EPICENTRE)。利用菌落雜合法，以 xopE2 為探針從 Xcv Xvt122 基因庫中篩選出內插 片段為8 kb 大小的重組質體 (pNCHU1227)。同法從 Xcv Xvt45 基因庫中篩選出內插 片段為30 kb 大小的重組質體 (pNCHU1226)，以 EcoRI 截切可區分出 13 kb、7 kb、5 kb、3.5 kb 及 1.5 kb 等五片段，以南方雜合法偵測顯示 xopE2 落於 13 kb 的片段中，

將此 13 kb 片段以 EcoRI/EcoRV 處理後，次選殖至 pBluescript II SK 載體，得到

pNCHU1275 和 pNCHU1276。將 pNCHU1227、pNCHU1275 和 pNCHU1276 以 ABI 3700 進行解序 (中興大學生物科技發展中心)。

利用NCBI BLAST、vector NTI 和 SDSC Biology Workbench 進行序列比對分析，

結果顯示於圖2-5A 與表 2-5，pNCHU1227 (accession no. HM125707)包含六個完整的 轉譯框架 (open reading frame, ORF)，二個不完整的轉譯框架，依序為 Hypothetical protein XCV2276 (incomplete)、Putative secreted protein XCV2277、Pectate lyase precursor XCV2278、Cointegrate resolution protein T (fragment) XCV2279、Avirulence protein XCV2280 (XopE2) 、 Hypothetical protein XACb0012 、 Hypothetical protein XCV2282、Hypothetical protein XCV2283 (incomplete)，除了 XACb0012 取代了 XCV2281 外，基因的相似性與組合順序與 Xcv 85-10 幾乎是相同的(Thieme et al., 2005)。而 Xcv Xvt45 xopE2 兩側的基因序列和 Xcv Xvt122 明顯不同，如圖 2-5B、表 2-6 所示，pNCHU1275 和 pNCHU1276 (accession no. HM125708)共包含十三個完整的 轉譯框架，二個不完整的轉譯框架，其中十一個轉譯框架可自基因庫中比對到相似的 同源基因，四個為新預測的轉譯框架。此外，兩菌株的 xopE2 基因上游皆可發現受植 物 調 控 的 保 留 性 起 動 子 序 列 (plant-inducible promoter box, PIP box) 5’-TTCG-N16-TTCG-3’ (Fenselau and Bonas 1995)，此兩菌株序列同時也發現具有保留 性的Cointegrate resolution protein T 和 Phage-related integrase 等基因，推測 xopE2 可 能從其他 Xanthomonas spp.經水平基因轉移方式 (horizontal gene transfer)而來。

2.3.5 B 群 XopE2 (XopE2

_B

) 突變株會降低對寄主植物番茄的致病性但 A 群 XopE2 (XopE2

A

) 突變株不具影響作用

因 Xcv 85-10 XopE2 可造成 Solanum pseudocapsicum 植物的細胞死亡 (Thieme et al., 2007)，為評估 Xcv Xvt122、Xcv Xvt45 兩菌株的 XopE2 與致病性的關係，構築非 極性突變之重組質體pNCHU1301 (圖 2-5A)和 pNCHU1362 (圖 2-5B)，並以電穿孔法 將此重組質體送入Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 菌株後，進行標記置換突變，利用抗生 素篩選出置換成功的 xopE2 缺失菌株，並以南方雜合法確認是否為正確的突變株。結

果顯示(圖 2-6)，Xcv Xvt122 之染色體 DNA 以 EcoRI 處理後，並以 xopE2 基因為探 針時，Xcv Xvt122 出現 7 kb 的雜合訊號，當以 nptII 基因為探針時，突變株會出現約 7.4 kb 的雜合訊號，表示 nptII 基因已取代了 xopE2 基因。但 Xcv Xvt45 之染色體 DNA 以 EcoRI 處理後，並以 xopE2 基因為探針時，Xcv Xvt45 於 13 kb 和大於 13 kb 處各 出現一條雜合訊號，但突變株在大於13 kb 處也出現了訊號，表示二個 copy 的 xopE2 只剔除了一個copy，當以 nptII 基因為探針時，Xcv Xvt45 於 13 kb 處出現雜合訊號，

表示 nptII 基因取代了 xopE2 基因。Xcv Xvt122 已成功篩選出 xopE2 缺失菌株 (Xvt122ΔxopE2) ， 但 Xcv Xvt45 只 篩 選 到 其 中 一 個 copy 缺 失 的 突 變 株 (Xvt45ΔxopE2)，因前述之實驗(圖 2-2C)推論有一個 copy 位於質體上，可能因其上下

游的序列不同於染色體上之序列導致無法置換，因此以保留一個 copy 突變株繼續往

後之接種實驗。

將Xcv Xvt122、Xcv Xvt45 野生株及 xopE2 缺失株 (Xvt122ΔxopE2、Xvt45ΔxopE2) 接種於感病的番茄品系(Bonny Best L305)，觀察其菌落的生長和病徵的發展。由圖 2-7A 結果顯示，Xvt122ΔxopE2 其病徴的發展趨勢和 Xcv Xvt122 並沒有顯著差別，

而在菌數的生長方面，Xcv Xvt122 和 Xvt122ΔxopE2 菌量從 10²至接種第三天已爬升 至10⁵，接種第九天為10⁶~10⁷，兩菌株沒有差異 (圖 2-7B)。相反地，接種 Xvt45ΔxopE2 於感病的番茄品系明顯地延遲病徵的發展 (圖 2-7C)，接種一星期後即可觀察到 Xvt45ΔxopE2 減輕 10 %~20 %的病斑，此現象持續至第三星期。觀察菌量之生長，無 論野生株或突變株,接種三天後菌量皆急速生長，但 Xvt45ΔXopE2 菌量數明顯地比 Xcv Xvt45 降低 10 倍 (圖 2-7D)，此抑制效果持續至第九天更為顯著，高達 100 倍之 差距。

2.3.6 大量表現 (overexpress) XopE2 蛋白會抑制 X. campestris pv. vesicatoria 對寄主植

物番茄的毒力性

為評估在兩群菌株中多量表現 XopE2 蛋白是否會改變對寄主的毒力，首先將 Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 的 xopE2 基因分別構築於廣寄主載體 pBBR1MCS-5，得到的重

組質體pNCHU1921 (以 XopE2A表示) 和 pNCHU1925 (以 XopE2B表示) 分別送至 Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 野生株內，共可得到四株異質表現 XopE2 的菌株，分別為 Xcv Xvt122/XopE2A、Xcv Xvt122/XopE2B、Xcv Xvt45/XopE2A及Xcv Xvt45/XopE2B。據 文獻報告指出 HopX 家族的 effector 蛋白具有保留性三元催化胺基酸 (consensus catalytic triad)，經比對後此保留性胺基酸位於 XopE2 的第 159 個胺基酸 cysteine 和第 211 個 胺 基 酸 aspartic acid (Nimchuk et al., 2007) 。 此 外 ， 利 用 PSORT II (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp) 程式預測，XopE2 第 47 個胺基酸 histidine 可能為 His 硫醇蛋白酶胺基酸 (thiol-protease His residue)。為瞭解這幾個胺基酸對 XopE2 的影 響，構築單點突變重組質體，以alaine 取代第 159 個胺基酸 cysteine 和第 47 個胺基 酸 histidine ， 共 得 到 下 述 重 組 質 體 pNCHU1922 (XopE2A-H47A) 、 pNCHU1923 (XopE2A-C159A)、pNCHU1924 (XopE2A-H47A/C159A)、pNCHU1926 (XopE2B-H47A)

、pNCHU1927 (XopE2B- C159A)及 pNCHU1928 (XopE2B-H47A/ C159A)，同樣的將這 些重組質體送至Xcv Xvt122 和 Xcv Xvt45 野生株內後進行接種實驗，觀察菌量之生 長 以 評 估 其 致 病 力 。 圖 2-8A 結 果 顯 示 ， 大 量 表 現 Xvt122/XopE2A、 Xvt122/XopE2A-H47A、Xvt122/XopE2A-C159A、Xvt122/XopE2A-H47A/C159A，無論 是第三天或第六天，其菌量生長明顯地比 Xcv Xvt122 野生株降低 10 倍。表現 Xvt122/XopE2B、Xvt122/XopE2B-H47A、Xvt122/XopE2B-C159A、Xvt122/XopE2B- H47A/C159A 亦可觀察到相同的生長趨勢(圖 2-8B)。然而，過量表現 Xvt45/XopE2A、 Xvt45/XopE2A-H47A、Xvt45/XopE2A-C159A、Xvt45/XopE2A-H47A/C159A，其菌量 生 長 受 生 長 的 現 象 直 到 接 種 第 六 天 才 出 現( 圖 2-8C) ， 但 表 現 Xvt45/XopE2B、 Xvt45/XopE2B-H47A、Xvt45/XopE2B-C159A、Xvt45/XopE2B-H47A/C159A，於接種第 三 天 後 就 出 現 生 長 延 遲 的 現 象( 圖 2-8D) 。 觀 察 接 種 葉 片 的 病 徵 發 展 ， 處 理 Xvt122/XopE2A或Xvt122/XopE2B的葉片黃化程度明顯比野生株Xcv Xvt122 輕微(圖 2-8E)。將上述結果作一歸納，過量表現 XopE2 蛋白可降低細菌在植物內之生長和減 緩病徴的嚴重性，但第47 個胺基酸 histidine 或第 159 個胺基酸 cysteine 的突變並不 會影響XopE2 蛋白之效果。

2.3.7 XopE2 蛋白會透過第三型分泌系統抑制過敏性反應發生

為證實 XopE2 具有抑制 P. syringae pv. syringae 61 (Psy61)在非寄主作物煙草所引

起的過敏性反應，利用農桿菌短暫表現系統表現 XopE2 來進行實驗。首先將 Xcv

Xvt122 和 Xcv Xvt45 的 xopE2 基因分別構築於表現載體 pBI121，得到重組質體 pNCHU1201 (XopE2A) 和 pNCHU1200 (XopE2B)，將載體 pBI121 和重組質體轉形至 A. tumefaciens LBA4404，獲得的菌株標示為 At-pBI121、At-XopE2A和At-XopE2B。

利用接種區域重疊之方式直接觀測過敏性反應的抑制情形。分別將 At-pBI121、

At-XopE2A和At-XopE2B接種至煙草葉片 N. tabacum (圖 2-9A)和 N. benthamiana (圖 2-9B)，24 小時後再以 Psy61(5 x 10⁶ cfu/ml)於同一葉片區域作第二次接種，6 天後可 觀測到At-XopE2A和At-XopE2B會延遲Psy61 所引起的過敏性反應，此抑制效果只持 續約12~24 小時。

pHIR11 攜帶一段由 Psy61 所選殖出之 30 kb 片段，含有完整 hrp/hrc 基因組及 hopPsyA，其產物可組裝第三型分泌系統及含 effector 蛋白 HopPsyA。在 pHIR11 中的 hopPsyA 基因產物會在煙草中引發過敏性反應，將 pHIR11 送入 E. coli MC4100 菌株

pHIR11 攜帶一段由 Psy61 所選殖出之 30 kb 片段，含有完整 hrp/hrc 基因組及 hopPsyA，其產物可組裝第三型分泌系統及含 effector 蛋白 HopPsyA。在 pHIR11 中的 hopPsyA 基因產物會在煙草中引發過敏性反應，將 pHIR11 送入 E. coli MC4100 菌株

在文檔中 利用AFLP分析茄科細菌性斑點病菌之變異性並選殖與致病性相關之基因產物 (頁 38-46)