第四章 結果
第一節、 大黃素(Emodin)對小鼠血癌細胞株(WEHI-3)
小鼠血癌細胞株(WEHI-3)經培養、加入實驗的藥物大黃素(Emodin) 後，依觀察的時間點及濃度利用流式細胞儀偵測其存活率並以顯微鏡觀察 細胞型態。以PI (propidium iodine)核酸染劑作為染劑，當細胞凋亡時，細 胞膜通透性改變，PI 會進入細胞內與 DNA 雙股螺旋上的氫鍵結合，經雷 射光激發後，會產生488 nm 波長的螢光，由流式細胞儀的偵測器接收，
藉此細胞特性及染色原理，我們可以區別PI 染色後的細胞螢光強度較高者 為死細胞，螢光強度較弱者為活細胞，最後再以統計分析出WEHI-3 經 Emodin 作用後之生存率(viability)。
我們探討大黃素(Emodin)對小鼠血癌細胞株(WEHI-3)是否具有毒殺效
果，由型態上的變化以及統計量圖得知。在24 小時、48 小時偵測其生存 率時發現細胞的確有毒殺作用且具有劑量上之效應(Dose-dependent)。利用
生存率之試驗，找出IC50=40 μM 此濃度作為以後實驗的濃度依據，因為以 40 μM 作用經 24 小時後，便可發現細胞的存活率有明顯改變，且到 48 小 時時可達一半致死率。
結論：大黃素(Emodin)對於小鼠血癌細胞株(WEHI-3)是具有毒殺作用，且 有劑量上(Dose-dependent)以及時間效應(Time-dependent) (圖 4-1)。
0 的DNase 會在核小體(nucleosome)兩側進行分解，可列解成 180～200 bp 的DNA 片段，經電泳跑膠會出現階梯狀現象(DNA ladder)，由圖 4-2 可知 實驗結果為：將小鼠血癌細胞株(WEHI-3)經與大黃素(Emodin) (50 μM、100 μM、150 μM)共同培養 24 小時之後即有明顯的 DNA ladder 現象產生，則 表示大黃素會造成小鼠血癌細胞株(WEHI-3)的 DNA 斷裂。
圖4-2 大黃素(Emodin)以不同濃度作用於小鼠血癌細胞株(WEHI-3)共同培 養24 小時之後，觀察 DNA Fragmentation 的情形。
(二)彗星試驗(Comet assay)
彗星試驗(Comet assay)即為單細胞電泳分析法(single ce11 gel
electrophoresis assay)，是一個簡單、快速以及敏感度高的技術，可用來分 析及定量DNA 損傷(DNA damage)的程度。當細胞受到刺激而 DNA 破壞時 會形成不同片段的斷裂，可藉由電泳將斷裂的DNA 片段拖出膜外，之後 利用PI 染劑將其染色，便可觀察出拖尾的現象，由此可藉由拖尾的長短，
判斷DNA 損傷的情形，拖尾愈長則表示 DNA 斷裂情形愈嚴重。
由圖 4-3 可得知：小鼠血癌細胞株(WEHI-3)與不同濃度大黃素(Emodin) 共同培養24 小時之後，可發現隨著藥物濃度的增加，小鼠血癌細胞株
(WEHI-3)拖尾的現象越顯著，則表示 DNA 受損的情形越嚴重。
圖4-3 不同濃度大黃素(Emodin)作用小鼠血癌細胞株(WEHI-3)培養 24 小 時之後，利用彗星試驗分析觀察DNA 受損的情形。***p<0.01
(三)利用 DAPI 染色法檢測
DAPI (4-6-diamidine-2-phenyl indole)是一種核酸螢光染劑，會專一性
的結合在DNA 雙股螺旋小溝(minor groove)上，當細胞產生凋亡時會有染 色質凝結、DNA 斷裂(DNA fragmentation)情形發生，因此當細胞凋亡的現 象越嚴重，DNA 斷裂的也就越多，則 DAPI 染劑染上結合也會更多，當在 顯微鏡下觀察時，即可觀察到凋亡細胞所產生的螢光強度比正常細胞強。
由圖 4-4 可得知：小鼠血癌細胞株(WEHI-3)與不同濃度大黃素(Emodin) 共同培養24 小時之後，可發現隨著藥物濃度的增加，小鼠血癌細胞株
(WEHI-3)螢光強度越顯著，則表示細胞凋亡的情形越嚴重。
圖4-4 不同濃度大黃素(Emodin)作用小鼠血癌細胞株(WEHI-3)培養 24 小 時之後，利用DAPI 染色法檢測分析觀察細胞凋亡的情形 *p<0.05，
***p<0.01
三、大黃素影響小鼠血癌細胞株(WEHI-3)產生自由基之探討
當細胞內產生過多的活性氧化物質時，自由基(ROS)會破壞細胞內大
部分的成份，包括細胞蛋白、細胞脂質及DNA 等，而使細胞核內的 DNA 損傷(DNA damage)、造成細胞週期停滯(cell cycle arrest)，除此之外，ROS 之存在也會造成氧化壓力(oxidative stress)產生，氧化壓力能使粒線體膜通 透性改變而導致粒線體膜電位下降，由此可知自由基(ROS)的生成與粒線 體凋亡機制有密不分的關係【30】。有文獻指出，ROS 能夠誘導細胞凋亡
的機制【31】，例：Death receptor apoptosis pathway、Mitochondria apoptosis pathway 等，故此實驗是藉由偵測細胞中活性氧化物質(ROS)的表現情形來
了解ROS 與 Apoptosis 之間的關係。利用流式細胞儀及 H2DCF-DA 染劑去 偵測並觀察大黃素(Emodin)引發小鼠血癌細胞株(WEHI-3)內部自由基的變 化，H2DCF-DA 為本實驗中所利用的 ROS 染劑，主要是與 H2O2結合產生 螢光，結果圖4-5 得知，當小鼠血癌細胞株(WEHI-3)與大黃素(100 μM)共 同培養0、l、3、6、12 小時之後，在短時間內即有大量的自由基(ROS)生 成。
(A)
(B)
圖 4-5 大黃素(100μM)作用於小鼠血癌細胞株(WEHI-3) 0、l、3、6、12 小 時
(A) 流式細胞儀分析細胞內 ROS 表現量分析圖 (B) 細胞內 ROS 表現量之相對統計圖；***p<0.05
四、大黃素影響小鼠血癌細胞株(WEHI-3)粒線體膜電位(
⊿
ψm)改變之探討 粒線體能將產生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜，稱之為 mitochondril membrane potential (Dym)，而最終產生 ATP 以供細胞代謝所使用，故粒線體在細胞有能量工廠之稱。近年來在粒線體的研究越來越多，
已有文獻證實粒線體除了提供能量之外，也能調控細胞凋亡機制【32】。
粒線體上有一種由多種蛋白質所組成的特殊通透管道稱為粒線體過渡性 通透孔(mitochondria permeability transition pore) (MPTP)，它能誘發數種凋 亡蛋白從粒線體內釋出，同時也和細胞凋亡作用的產生有關。當粒線體遭 受過多鈣離子累積、氧化壓力增加、或粒線體膜電位改變時，都會導致 MPT 膜孔打開，進而促使多種凋亡蛋白的釋放，如：Cytochrome c (細胞 色素)，AIF (apoptosis inducing factor)，和 endonuclease G 等蛋白，並活化
下游caspases 等一連串反應，誘導細胞走向細胞凋亡(apoptosis)。文獻指出 粒線體膜功能不良(mitochondrial dysfunction)通常伴隨著早期細胞凋亡的 發生【33,34】，因此粒線體異常通常在細胞凋亡過程中扮演著重要的角色，
而細胞經呼吸所產生的能量會累積儲存在粒線體膜間，稱之為粒線體膜電 位，此電位會受到細胞凋亡的擾動，利用一些陽離子染劑偵測出其螢光強 度的改變可觀察得知粒線體膜電位變化。本實驗為利用流式細胞儀及 DiOC6 染劑去偵測粒線體膜電位的改變，由實驗結果圖 4-6 可得知，當小 鼠血癌細胞株(WEHI-3)與大黃素(100 μM)共同培養 0、1、3、6、12 小時之
後，在短時間作用下粒線體膜電位便有明顯的下降趨勢。
(A)
圖4-6 大黃素(100μM)作用小鼠血癌細胞株(WEHI-3)培養 0、1、3、6、12 小時
(A) 流式細胞儀分析細胞內粒線體膜電位變化分析圖 (B) 細胞內粒線體膜電位變化之相對統計圖；***p<0.05
(B)
圖4-6 續
五、大黃素影響小鼠血癌細胞株(WEHI-3)鈣離子釋放之探討
當細胞中鈣離子濃度平衡時，細胞的生理活性是正常的，而細胞內鈣 離子濃度改變時則會影響許多生理功能，如:肌肉收縮、細胞分化、細胞凋 亡(apoptosis)與基因調控等等，在一般正常情況之下，鈣離子是儲存在細胞 的內質網中，倘若細胞受到外在刺激導致內質網受到壓力(ER stress)時，此
時鈣離子便會從內質網釋出進入粒線體內，造成粒線體膜電位異常而促使 細胞走向凋亡路徑，因此鈣離子(Ca2+)在細胞凋亡過程中扮演著重要的調節 角色【35】。本實驗則是探討小鼠血癌細胞株(WEHI-3)經大黃素處理過後，
細胞內鈣離子濃度的變化，而利用流式細胞儀及鈣離子螢光染劑
(Fluo-3/AM)去偵測細胞內鈣離子濃度的改變，其結果可由圖 4-7 得知，小 鼠血癌細胞株(WEHI-3)在加入大黃素(100 μM)共同培養 0、1、3、6、12、
24 小時之後，短時間內便有大量鈣離子釋出的現象產生。
(A)
圖4-7 大黃素(100μM)作用小鼠血癌細胞株(WEHI-3)培養 0、1、3、6、12、
24 小時
(A) 流式細胞儀分析細胞鈣離子濃度變化分析圖
(B) 細胞鈣離子濃度變化之相對統計圖；*p<0.05，***p<0.01
(B)
圖4-7 續
六、大黃素影響小鼠血癌細胞株(WEHI-3)Caspase-3、-8、-9 活性之探討 實驗結果可知粒線體膜電位改變促使細胞早期凋亡(apoptosis)，當粒線 體上的過渡性通透孔-mitochondria permeability transition pore(MPTP)通透
性改變時，一些粒線體膜上的致死蛋白會釋放至細胞質中，如：cytochrome c，進而活化 caspase family 蛋白，經由 caspases 對自己的水解而活化更多
的Caspases 蛋白，並且誘發下游 caspases 等一連串反應，此 caspase cascade 一旦開始便啟動了自殺機制，促使細胞走向細胞凋亡(apoptosis)【36】。
caspase-3 會活化細胞核內和 DNA repair 相關的 PARP (poly-ADP ribose polymerase)，使之產生裂解失去修復 DNA 的功能，當 DNA 無法修補時細
胞終究走向死亡，而Caspase-8 則是在 death receptor-dependent apoptosis pathway 扮演著重要的角色【37】，Caspase-9 是細胞凋亡信號轉導過程中 比較上游的一個caspase。線粒體釋放細胞色素 C 以後，caspase-9 可以和 細胞色素C 以及 Apaf1 形成複合物，同時被啟動。啟動的 caspase-9 可以 啟動細胞凋亡的最關鍵酶caspase-3，從而促進後續的細胞凋亡信號。本實 驗主要是利用吸光值偵測細胞內caspase-3、-8、-9 活性的變化，吸光強度 愈強則表示caspase-3、-8、-9 活性愈高，結果顯示，大黃素(100 μM)作用 小鼠血癌細胞株(WEHI-3)，在 24 小時便可發現 caspase-3 及 caspase-9 活性 皆有明顯上升的現象而caspase-8 則無明顯差異，推測大黃素可能主要透過 激活caspase-3、-9 路徑促使細胞凋亡。 Pan-caspase inhibitor 可以穿透細 胞膜的caspase 抑制劑，可以抑制由 caspase 啟動導致的細胞凋亡，實驗結 果發現，在有抑制劑存在下，caspase 活性下降且細胞存活率明顯增加。
N-乙醯基半胱胺酸(N-acctylcysteine; NAC)為包含 thiol 的複合物且具
有膜通透性，可以透過增加細胞內glutathione 的濃度或直接作用在活性氧 化物上清除細胞內過多的自由基(free radical)，使細胞免於 ROS 所造成的 傷害而達到抗氧化的能力【38】，因此把 N-acetylcysteine (NAC)作為 ROS
的抑制劑。利用N-乙醯基半胱胺酸(N-acetylcysteine; NAC)作用於細胞後，
再加入實驗藥物並觀察其細胞內活性氧化物(Reactive oxygen species; ROS) 的生成量是否有減少的情形。
實驗發現，加入 N-acetylcysteine (NAC) 2 小時之後，再加入實 驗藥物大黃素(100 μM)共同作用 12 小時，由結果可發現到：加
入N-acctylcysteine (20 mM)的細胞組別與只有加入實驗藥物大黃素(100μM) 兩組相比較，得知其細胞內活性氧化物(Reactive oxygen
圖4-8 大黃素(100 μM)作用小鼠血癌細胞株(WEHI-3) Caspase-3、-8、-9 活 性分析
(A) 大黃素作用小鼠血癌細胞株(WEHI-3) Caspase-3、-8、-9 活性分析 圖，***P<0.05
(B) 大黃素和 N-acetylcysteine (NAC)及 Pan-caspase inhibitor 作用小鼠血 癌細胞株(WEHI-3)細胞存活率分析圖，***p<0.05
(B)
(一) 探討與細胞凋亡粒線體路徑(Mitochondria-dependent apoptosis pathway)相關之蛋白表現
粒線體路徑在誘發細胞凋亡機制中是最具意義的，而 Bcl-2 蛋白位
於粒線體膜的外層，調控細胞的存活。像是細胞受到細胞外或細胞內的 壓力及傷害時，如：放射性輻射、氧氣不足、藥物、DNA damage 等，
會使細胞質的粒線體膜電位下降，促使Cytochrome c 從粒線體的
intermembrane space 釋放到細胞質中，與 Apaf-1 與 Caspase-9 結合形成
apoptosome，之後 ATP 進而活化 Caspase-9 的複合物，Caspase-9 也促使
下游的caspase-3 活化，最後誘導走向細胞凋亡。
(1)Bcl-2 family 家族蛋白【39-41】
Bcl-2 family 在細胞凋亡中扮演著細胞存活調控的重要角色，可分 為促使凋亡蛋白分子(pro-apoptotic protein)及抑制凋亡蛋白分子
(anti-apoptotic protein)這兩類蛋白(表 4-1)。
表 4-1 Bcl-2 family 家族蛋白分類 功能 種類
pro-apoptosis Bax、 Bak 、Bok/Mtd 、Bcl-xs 、Bcl-GL、Bad、Bid、
pro-apoptosis Bax、 Bak 、Bok/Mtd 、Bcl-xs 、Bcl-GL、Bad、Bid、