細胞凋亡(Apoptosis)與細胞壞死兩者(Necrosis)廣義上來說皆為 細胞死亡，兩者最大的不同在於細胞凋亡(Apoptosis)為細胞產生計畫 性死亡機制(programmed cell death; PCD)，而細胞壞死(Necrosis)則是 惡性死亡。因此 Apoptosis 在生物體內扮演相當重要的角色，當正常 細胞受到外在環境刺激時，便會受基因調控而啟動細胞凋亡的機制，
在整個細胞凋亡過程中，是不會產生發炎反應的，其特徵為細胞皺 縮、細胞膜保持完整性、染色質濃縮、DNA 斷裂以及形成凋亡小體 (apoptotic bodies)，是一種對周圍細胞及組織傷害最小的細胞自殺性 死亡【50】。而細胞壞死(Necrosis)則是會有發炎反應的產生，其特徵
為細胞型態腫脹、細胞膜喪失完整性造成細胞破裂、發炎因子釋出，
導致周圍鄰近的組織或細胞受到傷害，出現壞死現象【51】。故細胞
凋亡機制可被應用在治療癌症藥物方面的研究，以減少藥物對體內細 胞所引發的併發症及副作用。
大黃素(Emodin)是一種由大黃植物中所萃取出來的黃色粉末藥 物，許多研究報告指出，Emodin 在抗細胞增生、抗癌或是輔助癌症 治療過程中扮演著重要的角色，由細胞培養實驗模式當中得知大黃素 對於子宮頸癌、肝癌、黑色素瘤等癌細胞都可抑制腫瘤發生及生長而 達到治療改善的功效【4-6】，除此之外，大黃素也具有抗發炎、抗潰
瘍、抗病毒、止血、健胃、利膽、瀉下、解熱、鎮痛、利尿、降脂、
降壓等功能【2、3】。而細胞凋亡的主要機制分為兩大類，一是死亡
接受器路徑，另一則是粒線體活化路徑，過去的文獻證實Emodin 誘 導人類大腸癌細胞株(colon 205)產生細胞凋亡、是藉由粒線體凋亡路 徑(Mitochondria-dependent apoptosis pathway)【52】，因此本研究則是 探討大黃素誘導小鼠血癌細胞株(WEHI-3)產生凋亡之相關機制及細 胞吞噬免疫機轉。
首先就細胞存活率而言，藉由流式細胞儀分析實驗結果可得知，
Emodin 對小鼠血癌細胞株(WEHI-3)在藥物濃度差上有
Dose-dependent、藥物作用時間上有 Time-dependent，同時 IC50濃度
在48 小時約為 40 μM 。而在過去的文獻中指出 Emodin 對於人類骨 髓性白血病細胞株(HL-60)所選用的藥物濃度為 60 μM【53】，由此可 知，Emodin 對於不同細胞株所造成的藥物毒性強度是不相同的。
在先前有提到 Death receptor pathway 和 Mitochondria-dependent pathway 為細胞產生凋亡的兩大機制，過去也有研究證實 Emodin 誘 導人類肝癌細胞株(Hep3B)、人類大腸癌細胞株(colon 205)產生細胞凋
亡，皆和粒線體凋亡分子機制有關。以下是對於 Mitochondria 與 Apoptosis 兩者之間的探討：粒線體除了可提供 ATP 供給細胞生長、
代謝、活動所需的能量之外，在細胞凋亡作用當中也扮演著重要的角
色【54】，粒線體上的 mitochondria permeability transition pore (MPT pore)粒線體過渡性通透孔，它控制了粒線體的膜通透性能夠誘導存在 粒線體內的凋亡蛋白釋出，MPT pore 含有兩大部分，一是在粒線體 外膜的蛋白質(porin、voltage-dependent anion channel; VDAC)，另一
個則是與adenine nucleotide translocator (ANT)相關位於粒線體內膜的 蛋白質，當此通道打開會使得粒線體膜電位(Δψm)下降、內膜兩側的 H+ gradient 消失、基質滲透壓增高，而造成粒線體漲大、外膜破裂，
導致凋亡蛋白 AIF、Endo-G (caspase-independent factor)釋放至細胞 核，造成DNA damage，而 Cytochrome c (caspase-inducing factor)則是 釋放到細胞質中，活化下游的caspase protein 誘導細胞產生凋亡。因 此粒線體膜電位的改變被當作是偵測早期細胞凋亡的重要指標。和粒 線體凋亡機制相關的重要蛋白還有Bcl-2 family protein，此家族蛋白 結合在粒線體膜上主要功能為調控粒線體膜電位以及膜通透性的表 現，當Bcl-2 family 的 anti-apoptosis 蛋白 Bcl-2 表現量下降時，會導 致粒線體膜電位下降，而pro-apoptosis 的蛋白 Bax 則是表現量增加，
Bax 與 Bcl-2 結合亦會讓粒線體的膜通透性增加、膜電位下降時，這
時AIF、Endo-G 等蛋白會釋放至細胞核內造成 DNA 斷裂進而走向細 胞凋亡【55,56】。由實驗結果顯示 Emodin 的添加，可使 Bax 蛋白表 現增加、抑制Bcl-2 蛋白表現、釋出 Cytochrome c、AIF、Endo-G 使
其蛋白表現量增加，並使粒線體相關凋亡蛋白因子 Caspase-9，-3 被 裂解活化，其活化態蛋白表現量增加。另外作為 DNA 修復蛋白的 PARP 也被裂解活化，使 PARP 失去修復功能而造成 DNA 斷裂損傷。
因此可推論：老鼠血癌細胞株(WEHI-3)經大黃素處理後會產生凋亡作 用，可能和粒線體活化路徑有關。
接下來則是探討細胞內活性氧化物(Reactive oxygen species; ROS) 的生成，從實驗中可發現，利用流式細胞儀偵測經Emodin 作用過之 血癌細胞株在短時間時即有大量自由基釋出，這表示Emodin 能夠促 使血癌細胞株產生ROS，在過去也有文獻指出 ROS 的表現是會影響 細胞凋亡的作用【30,31】。為了證實Emodin 所誘發出的 ROS 是造成
細胞凋亡因素之一，因此我們以N-acetylcysteine (NAC)此胺基酸作為 ROS 的抑制劑【57,58】，進而偵測分析活性氧化物的改變情形，由實 驗數據得知，當細胞同時以Emodin 以 N-acetylcysteine (NAC)共同作 用過後，活性氧化物的增加量有明顯的減少，這表示 ROS 的生成走 受到了 N-acetylcysteine (NAC)的影響而被抑制住，進一步則是偵測 N-acetylcysteine (NAC)對於細胞存活率的影響，從結果發現當 ROS 被N-acetylcysteine (NAC)抑制住的同時，細胞存活率則是明顯上升，
由此可證明，經Emodin 所誘發出的活性氧化物質的確是造成血癌細 胞株凋亡的因素之一。而細胞經Emodin 刺激後之所以會釋放出大量
的ROS，可能走因為 Emodin 在穿透細胞膜進入細胞內時，會破壞細 胞 膜 的 組 成 份 - 磷 脂 質 (Phosphohpid) 使 得 膜 上 脂 質 過 氧 化 (Peroxidation)因而產生大量的自由基，造成細胞 DNA damage【59】。
而另一個和細胞凋亡相關路徑-ER stress pathway 的研究方面，過去有 文獻指出內質網壓力(ER stress)產生的機制和蛋白質的摺疊(fold)是 有相關性的【60】，當內質網發生 ER stress 時，此時蛋白質摺疊訊息 會發生錯誤，而具有修復蛋白質摺疊功能的蛋白－GRP78 便會大量
活化表現量增加，因此GRP78 (glucose-regulated protein)亦可當作走 內質網壓力的指標之一【61】。此外，內質網上的三個感應器蛋白 PERK、IRE1 和 ATF6 在 ER stress 無法排除或累積過多時也會被啟動 活化進行一連串和凋亡作用相關的反應【62】，包括：(a) PERK 和 ATF6
會藉由不同路徑促使下游的 GADD153 (modulators)大量表現，而 GADD153 (growth arrest and DNA damage inducible gene 153)是一種 轉錄因子，能夠抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表現及促進促凋亡蛋白 Bax 的表現，以調控細胞凋亡作用，另外當細胞生長抑制及DNA 受損時 GADD153 亦會增加。(b) IRE1 會啟動 TRAF2-ASK-JNK pathway 誘導
細 胞 走 向 凋 亡 路 徑 等 反 應 。 由 西 方 墨 點 法 的 實 驗 結 果 得 知 GADDl53、GRP78 蛋白表現皆增加，而在粒線體中 Bcl-2 蛋白表現下 降、Bax 上升，皆符合上述之理論，另外鈣離子濃度的偵測在短時間
也有大量的釋放，因此可推論：經Emodin 作用過的小鼠血癌細胞株 (WEHI-3)可能是受到外來藥物的刺激後，而使得內質網受到嚴重壓力
導致細胞中鈣離子濃度不平衡，進而活化ER stress pathwa)造成細胞 凋亡。
從細胞株各項實驗結果可證實 Emodin 能夠誘導小鼠血癌細胞株 (WEHI-3)產生凋亡作用，我們便以此藥物應用在動物試驗且探討其作
用，實驗以WEHI-3/BALB/c 小鼠作為 Emodin 的抗癌評估。
實驗結果顯示：
(一)從觀察小鼠活動力、毛色、型態外觀的改變以及測得體重、脾
臟重量，可發現大黃素確實能夠減緩WEHI-3/BALB/c 小鼠病變 的程度。
(二)利用流式細胞儀分析 WEHI-3/BALB/c 小鼠週邊白血球細胞族 群的分佈，可得知給予 Emodin 治療後的 WEHL-3/BALB/c 小 鼠，其免疫系統中 B 細胞-CD19 及調控細胞吞噬作用-CD11b 族群比起未給予藥物治療的致癌小鼠有顯著性的增加。
(三)經 Emodin 治療後的 WEHI-3/BALB/c 小鼠，其脾臟組織裡癌細 胞浸潤的區域比起未給予藥物治療的致癌小鼠有明顯減少的現 象，由此推測Emodin 可能可以殺死 WEHI-3/BALB/c 小鼠體內 的癌細胞。
根 據 上 述 實 驗 結 果 ， 我 們 可 初 步 推 論 Emodin 在 WEHL-3/BALB/c 小鼠體內可能具有毒殺癌細胞(WEHI-3 cells) 的能力，而使得小鼠週邊血液裡的未成熟血球細胞數目減少，
進而提升修復免疫功能讓B 細胞(CD19)族群表現大量增加並增 加巨噬細胞吞噬能力(CD11b)，甚至是直接增強小鼠體內的免疫 力等等。因此Emodin 具有抗癌功效但是否真的可被應用在臨床 治療血癌的病人，這都值得再做進一步研究探討，而 Emodin 確實是一個極具有開發潛力的抗癌藥物。