第三章 實驗材料及方法
第二節 實驗方法
第二節 實驗方法
一、實驗藥品配置
大黃素(Emodin; 6-methyl-1,3,8-trihydroxyanthraquinone)分子量 270.24 g/mol。以 DMSO 為溶劑，將大黃素配置成 25 μM、50 μM、100 μM、150 μM 等濃度作為實驗用的加藥濃度，配置好的藥物放置於-20℃作為保存。
二、細胞培養
(一)配置細胞培養基(RPMI-l640 medium)【15】
培養小鼠血癌細胞株(WEHI-3)所使用的培養基均為 RPMI-1640
medium，並且其培養基內還添加胎牛血清(fetal bovine serum;FBS)、抗生素 (PS)，麩胺酸(LG)，此培養基最終含有 10% FBS，100 units/ml Penicillin、
100 μg/ml Streptomycin 以及 2 mM L-Glutamine。
(二)細胞株培養條件
首先將新鮮的培養基回溫至 37℃，使用 70%的酒精擦拭檯面。所有放
入無菌操作檯的物品都要以70%的酒精擦拭，並帶無菌手套進行以下的實 驗。老鼠血癌細胞株(WEHI-3)培養在已配置好的 RPMI-1640 medium 培養
基中，置於37℃、5% CO2的培養箱中培養，定期更換新鮮的培養液，當 其細胞長到八分滿時即繼代下來做實驗。
(三)活化冷凍細胞【15,16】
細胞解凍的過程必須以快速的原則，否則形成冰晶將會對細胞造成傷 害，為了避免在凍細胞的過程中，因水分形成的冰晶傷害細胞，往往將
DMSO 的濃度調高到 7%以作為抗凍的保護措施，所以當快速解凍後也必
須快速的加入培養基以稀釋DMSO 到 1%以下，因為 DMSO 具有介面活性 劑的性質，對於細胞膜具有傷害性，DMSO 濃度小於 1%的情況下則是安
全的。首先將新鮮的細胞培養基放入37℃水浴鍋中，等待培養基回溫至 37℃時，接著取已回溫好的培養基 10 ml 至滅菌的 15 ml 離心管中，再從 液態氮中取出冷凍管，迅速的將冷凍管移至37℃水浴鍋中，使冷凍管裡的 細胞液快速解凍，盡量能在l～2 分鐘內融化，融化之後將冷凍管裡的細胞 液取至含有回溫好的新鮮培養基中。使其混和均勻後，以1500 rpm 的速度 離心5 分鐘後，去除上清液，再加入新鮮的培養基 10 ml，接著移入 37℃、
5% CO2的培養箱中培養，隔日更換新鮮的培養基。
(四)冷凍細胞【15,16】
將小鼠血癌細胞株(WEHI-3)大量培養後可用液態氮冷凍保存細胞，欲 保存冷凍的細胞盡量是採用細胞處於生長旺盛且存活率高的細胞情況來 進行冷凍。首先需配製冷凍保存液，將DMSO 加入新鮮培養基中，最後濃 度為7%混合均勻，置於室溫下待用。取少量細胞液來計數細胞。之後細 胞離心後去上清液，加入事前配製好的保存液，使細胞數保持在1～5x106 cells/ml，混合均勻後分裝至冷凍保存管中(1 ml/vial)，在管外標示細胞名 稱、數目以及日期。冷凍過程為冷凍管置於4℃：10 分鐘→ -20℃：30 分 鐘→ -80℃：16～18 小時→最後置入液態氮桶中(-196℃)長期儲存，並取少
量細胞懸浮液作污染檢測。
(五)細胞計數【16】
計算細胞數目是用血球計數盤，血球計數盤一般有二 chambers，每個 chamber 中細刻 9 個 1 mm2大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻 16 個 小格，深度均為0.1 mm。當 chamber 上方蓋上蓋破片後，每個大正方形之 體積為1 mm2x 0.1 mm=1.0xl04 ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞 數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml 之細胞數目(圖 3-1)。
圖3-1 細胞計數示意圖
(細胞計數盤)存活細胞測試的原理為 dye exclusion，因染料會滲入死細胞中 而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍 色trypan blue 染料。步驟:取 50 μl 細胞懸浮液與 50 μl trypan blue (0.4% w/v trypan blue)等體積混合均勻於 1.5 ml 小離心管中。取少許混合液約(15 μl) 自血球計數盤chamber 凹槽加入，蓋上蓋玻片，於 100 倍倒立顯微鏡下觀
察，活細胞不染色，死細胞為藍色。計數四個大方格之細胞總數後除4 平 均，再乘以稀釋倍數2，最後乘以 104即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數。
若細胞位於線上只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。如所含 細胞密度過高，則算出的數目誤差較大(每一大格過 100 個細胞)，需再加 入更多的培養液稀釋。
三、流式細胞儀的應用
(一)細胞存活率(Viability)之分析【17】
原理：流式細胞儀分析原理是藉由接收不同波長的螢光來區分及定量。當 細胞死亡的時候，其細胞膜會呈現不完整狀態，因此利用Propidium Iodine (PI)染劑，可以染細胞核內的核酸，而細胞膜完整的細胞則會被 PI 染上，
因為細胞是處在正常健康狀態下，其細胞膜是完整且具良好通透性，但細 胞若是發生凋亡、壞死等作用時，細胞膜則呈現不完整、破裂等狀態，當 細胞膜破損便會使細胞核的DNA 被 PI 染劑染上，被染上 PI 的細胞再利用 流式細胞儀分析，可以在488 nm 的位置激發出螢光，死亡的細胞會會呈 現出較高的紅色螢光，存活的細胞則有較弱的紅色螢光，再以Cell Quest 軟體分析。
步驟：將小鼠血癌細胞(WEHI-3)，加入 12 well 的培養盤以 1x105 cells/ml 的密度培養實驗需要的時間，以DMSO (dimethylsulfoxide)為溶劑，最後加 入不同濃度的大黃素(Emodin) ( 25 μM、50 μM、100 μM、150 μM 為最終
濃度)，l% DMSO 為 control 組。等待培養時間(分別培養 6、12、24、48 小時)到之後，收取細胞以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 2ml PBS
清洗後再離心去上清液，於避光加入500 μl (400 μg/ml PBS) PI (propidium iodine) solution，接著以固定計數秒數(20 秒)及流速(35 μl/min)的速度進行 流式細胞計數儀檢測。每個實驗組皆三重複取平均值增加實驗的準確度。
¾ PBS (Phosphate Buffer Saline)的配製製備 10 倍的 PBS，秤取 NaCl l60 g；KCl 4 g；Na2HPO4 23 g；KH2PO4 4 g，加 D.D.Water (double deionized water)至 2 公升，利用攪拌子攪拌使完全溶解，以 0.22 μm 的濾膜過濾，使用時在加以稀釋成1 倍的濃度。
表3-1 10 倍濃度磷酸鹽緩衝液(10x phosphate buffer saline，PBS)成分
組成 重量(g)
NaCl 160.0
KCl 4.0
Na2HPO4 28.8 KH2PO4 4.8 Add D.D.Water 2000 ml
¾ PI (propidium iodine)染劑配置
先配置出濃度為2 mg PI/l00 ml PBS 作為 PI stock，於要進行實驗時再 利用PBS 將 PI stock 稀釋五倍，最後足以 0.4 mg PI/l00 ml PBS 作為實驗 所使用濃度。
(二)細胞內粒線體膜電位(Δψm)的分析
原理：細胞膜電位探針，DiOC6 (3，3，-dihexyloxacarbocyanine)為對粒線 體具專一性之親脂性陽離子螢光染劑，容易跟帶有負電性之粒線體內膜結 合，當粒線體受刺激去極化而失去內膜之負電荷時，內膜被標定的DiOC6 會減少，因此螢光強度也降低，可作為偵測粒線體膜電位(MMP)之指標
【18】。在流式細胞儀中可由 488 nm 雷射激發出 525 nm 的螢光，以 FLl
之濾鏡偵測所放出的螢光強度，藉以分析MMP。而粒線體的去極化 (mitochondria membranes depolarization)伴隨早期的細胞凋亡發生，因此亦 可當做細胞早期凋亡偵測上的指標。
試劑：DiOC6 (3，3，-dihexyloxacarbocyanine)10 μl DiOC6/500 μl PBS
步驟：培養細胞之細胞數約2x105 cells/well，要有 1～2 個 well 做空白對照 (blank)。將小鼠血癌細胞株(WEHI-3)分別種於 12well 培養盤中，均給予大 黃素(Emodin) 100 μM(最終濃度) ，分別培養 l 小時、3 小時、6 小時、12 小時後收集細胞，離心到第二次時，準備MMP 試劑(每支離心管所需的量 是10 μl MMP 試劑加 500 μl 之 l 倍的 PBS)，離心後，去上清液，避光加入 配製好的MMP 染劑，於 37℃中避光 30 分鐘，之後上流式細胞儀分析。
將blank (紅色的 peak)調在 100～10l之間，control (藍色的 peak)調在 101～ 102之間，Ml 及 M2 其 gate 約等於 50％，樣品上機後，分析 MMP (peak 往右代表樣品的膜電位上升，往左代表膜電位下降)。
(三)細胞內活性氧化物質(Reactive oxygenspecies; ROS)的檢測
原理：進行細胞染色，可藉由2，，7，-Dichlorohyhydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)，為一種具有螢光性質可通過細胞膜並特異性追蹤評估細胞內
產生ROS 的多寡。當 H2DCF-DA 在細胞內的乙醯脂(easterase)去乙醯化 (deacetylate)後會形成非螢光性的 DCFH，DCFH 會被細胞內的 H2O 氧化成 具螢光性質的DCF，並聚集在粒線體中，在流式細胞儀中可由 488 nm 雷 射激發出355 nm 的螢光，藉以分析細胞內的 ROS 含量 【19】。
試劑：2，，7，-Dichlorohyhydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)
1 μl H2DCF-DA/500 μl PBS; H2DCF-DA stock sol’n: 20 Μm; Working sol’n:
200 μM。
步驟：培養細胞之細胞數約2x105 cells/Well，要有 1～2 個 Well 做 blank。
將小鼠血癌細胞株(WEHI-3)分別種於 12 well 培養盤中，均給予大黃素 (Emodin) 100 μM (最終濃度)，分別培養 1 小時、3 小時、6 小時、12 小時
後收集細胞，離心到第二次時，準備ROS 試劑(每支離心管所需的量足 1 μl ROS 試劑加 500 μl 之 1 倍的 PBS) ，離心後去除上清液，避光加入配製好 的ROS 染劑，於 37℃中避光 30 分鐘後上流式細胞儀分析，將 blank (紅色 的peak)調在 100～101之間，control (藍色的 peak)調在 101～102 之間，M1 及M2 其 gate 約等於 50％，樣品上機後，分析細胞內活性氧化物質的變化 情形(peak 往右代表樣品的活性氧化物質 ROS 增加，往左代表 ROS 被清 除)。
(四)細胞內鈣離子濃度(Intracellular calcium concentration)之分析
原理： Fluo-3/AM 為螢光染劑，當通過乙醯甲酯(AE)導入細胞後，與鈣 離子特異性結合，可螯合鈣離子，蝥合鈣離子之螢光染劑會有光學特性上 的改變，並且會隨著細胞內鈣離子的濃度的改變，而發散出不同強度的螢 光，來偵測細胞內鈣離子的濃度變化【20】。
試劑：Fluo-3/AM
步驟：培養細胞之細胞數約2x105 cells/well，要有 l～2 個 well 做 blank。
將小鼠血癌細胞株(WEHI-3)分別種於 12 well 培養盤中，均給予大黃素 (Emodin) 100 μM (最終濃度)，分別培養 3 小時、6 小時、12 小時、24 小 時後收集細胞，離心到第二次時，去上清液，避光加入配製好的Fluo-3/AM 染劑，每管加入1 ml (3 μg/1 ml)於 37℃中避光 40 分鐘，每 10 分鐘拿出 來上下搖動試管，反應時間結束後，將樣品取出離心1500 rpm、5 分鐘，
PBS 洗兩次，最後加 500 μl PBS 進行流式細胞儀分析。將 blank (紅色的 peak)及 control (藍色的 peak)調在 100～101之間，樣品上機後，分析鈣離 子釋放的情形(peak 往右代表樣品中的鈣離子濃度增加)。
(五)細胞內 Caspase-3，-8，-9 活性分析
原理:PhiPhiLux 主要為一個 loop 的形狀且兩端皆標有螢光的 peptid，它會 被Caspase-3 及 Caspase-3-1ike 蛋白所辨識，並且可以被細胞主動吞入。當 細胞因受刺激而產生凋亡作用時，此時若是加入PhiPhiLux 則會大量被凋
亡細胞吞入，而同時在細胞內部所誘發生成的Caspase-3 也會與 PhiPhiLux 上的特定位置結合，造成PhiPhiLux 結構斷裂，使得 loop 結構兩端上的螢 光物質結合，因而產生螢光，而PhiPhiLux 也具有放大細胞內 Caspase-3 及Caspase-3-like 訊號的功能，因此利用流式細胞儀偵測樣品中的螢光強 度，便可推得知其Caspase-3 的活性【21-23】。另外偵測 Caspase-8 之活性 也是相同原理，但用CaspaLux 染劑來偵測，之後利用流式細胞儀以 488 nm 激發螢光，分析定量與定性，偵測到更早期、更完整、更準確的活細胞凋 亡狀態。
試劑：Caspase-3: PhiPhiLux; Caspase-8: CaspaLux LlD2.
步驟：培養細胞之細胞數約2x105 cells/well，要有 1～2 個 well 做 blank。
將小鼠血癌細胞株(WEHI-3)分別種於 12 well 培養盤中，均給予大黃素 (Emodin) 100 μM (最終濃度)，分別培養 24 小時、48 小時後收集細胞，離
心到第二次時，去上清液，避光加入染劑，每管加25 μl (10 μM substrate Phiphilux for Caspase-3, CaspaLux LlD2 forCaspase-8)，於 37℃中避光 60 分 鐘，之後利用流式細胞儀進行分析。Control (藍色的 peak)調在 10l～102 之 間，樣品上機後，分析Caspase-3，-8 之活性(peak 往右則代表樣品的 Caspase-3，-8 活性增加)。
四、DNA 裂解與電泳分析
原理：當細胞產生凋亡作用時，會有DNA 斷裂現象的發生，細胞核內的
原理：當細胞產生凋亡作用時，會有DNA 斷裂現象的發生，細胞核內的