天然物分離實驗流程

實驗之初，有香杉、油杉、粗榧三種植物，將三種植物之樹葉及嫩枝部份 取下洗淨，分別絞碎，用甲醇浸泡萃取 24 小時後，再經過濾和減壓濃縮，取 得香杉、油杉、粗榧三種植物之甲醇萃取物，對HeLa cell 進行四重複的 MTT assay。

於香杉，油杉和粗榧之樹葉及嫩枝等六種固狀萃取物中，各取 50mg 溶於 1mL DMEM 中，做超音波震盪後，經 0.2μm membrane 過濾，作為 MTT assay 之藥劑。HeLa 在內有 full medium（90% DMEM，10% FBS，1% PS）培養盤 中培養72 小時。之後將 HeLa cell 分裝兩離心管並離心，其中一管分裝在培養 基中繼續培養(含 90% DMEM，10% FBS，1% PS)，另一管分裝在內含 starvation medium（0.04% FBS，99.6% DMEM）之 96 孔培養盤中，培養 12 小時使 HeLa 附著於96 孔培養盤底部。抽去 96 孔培養盤中的 starvation medium，加入 180μl 培養液( 90% DMEM，10% FBS，1% PS)於每個盤孔中，加入已製備好之藥劑 20μl / well，培養 72h 後做 MTT assay（前 4~8h 加入 MTT），測吸光值。

在香杉、油杉和粗榧之葉樹及嫩枝中，以粗榧樹葉對HeLa cell 之生長具 有較強的抑制作用，換言之，粗榧樹葉在甲醇層中含有對HeLa cell 抑制生長 之成分，又因甲醇萃取物必須事先溶於full medium 中後過濾，更可進一步推 測粗榧樹葉之甲醇萃取物在水層中含有對HeLa cell 抑制生長的成分，故可將 甲醇萃取物溶於一次水中攪拌 24 小時後過濾，可得水層萃取液和不溶水層之 甲醇萃取物，取得之水層萃取液置－80℃冷凍後，進行冷凍乾燥，得水層萃取 物。

將水層萃取物溶於正丁醇中後過濾，可得正丁醇層萃取液和不溶於正丁醇 層之水層萃取物，取得之正丁醇層萃取液減壓濃縮，得正丁醇層萃取物。將正 丁醇層萃取物和不溶於正丁醇層之水層萃取物對 HeLa cell 做四重複 MTT assay。

將正丁醇層萃取物（A drug）和不溶正丁醇層之水層萃取物（B drug）分 別溶於 DMEM 中，做超音波震盪後，經 0.2 μm 孔徑的濾膜過濾，系列稀釋 配製成20、10、5.0、2.5、1.25 mg/ml 之濃度，做為測 MTT assay 之藥劑。HeLa 在內有full medium（90% DMEM, 10% FBS, 1% PS）之培養皿中培養 72 小時。

將HeLa cell 分裝兩離心管並離心，兩管分裝在兩個培養盤中，皆含 starvation medium（0.04% FBS，99.6% DMEM），培養 12 小時使 HeLa 附著於培養盤底 部。抽去培養盤中的 starvation medium，加入 180 μl 培養液( 90% DMEM，

10% FBS，1% PS)於培養盤每個孔中，加入已製備好之 20 μl 藥劑，培養 72 小時後做 MTT assay（前 4~8 小時加入 MTT），測吸光值。

經實驗測試，正丁醇萃取物對HeLa cell 之生長具有較強的抑制作用，在 此 ，接著以 HPLC 分離正丁醇層中的成分。

在 HPLC 的分析條件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流動相，此兩種 溶劑皆含有0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第 零分鐘至第七分鐘以 80% 二次蒸餾水和 20% 乙腈混合，第七分鐘至第十二 分鐘由 80% 二次蒸餾水和 20%乙腈呈線性改變為 60% 二次蒸餾水和 40%

乙腈，第十二分鐘至第十七分鐘維持在 60% 二次蒸餾水和 40% 乙腈，，第 十七分鐘至第二十二分鐘由 60% 二次蒸餾水和 40% 乙腈呈線性改變為 0%

二次蒸餾水和 100% 乙腈，第二十二分鐘至第二十五分鐘維持在 0% 二次蒸 餾水和 100% 乙腈，第二十五分鐘至第二十八分鐘由 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈呈線性改變為 100% 二次蒸餾水和 0% 乙腈。（圖 2-4）

圖2-4 第一層 HPLC 移動相比例示意圖

第一層 HPLC 分析圖共分為三個時間區域收集（第零分鐘至第八分三十 秒為第一個時間區域；第八分三十秒至第十三分鐘為第二個時間區域；第十三 分鐘至第二十八分鐘為第三個時間區域），再將此三個時間區域所收集之樣品 做MTT assay。第二個時間區域和第三個時間區域較具生物活性，決定由第二 個時間區域之樣品作進一步的 HPLC 分析。在 HPLC 的分析條件中，以二次 蒸 餾 水 和 乙 腈 搭 配 做 為 流 動 相 ， 此 兩 種 溶 劑 皆 含 有 0.1% 三 氟 乙 酸

（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第零分鐘至第十五分鐘以 58% 二次蒸餾水和 42% 乙腈混合，第十五分鐘至第二十分鐘由 58% 二次蒸 餾水和 42% 乙腈呈線性改變為 0% 二次蒸餾水和 100%乙腈，第二十分鐘至 第二十五分鐘維持在 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈，，第二十五分鐘至第二 十八分鐘由 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈呈線性改變為 100% 二次蒸餾水 和0% 乙腈。（圖 2-5）

圖2-5 第二層 HPLC 移動相比例示意圖

第二層 HPLC 分析圖共分為四個時間區域收集（第三分鐘至第五分三十 秒為第一個時間區域；第五分三十秒至第十五分鐘為第二個時間區域；第十五 分鐘至第二十分鐘為第三個時間區域；第二十分鐘至第二十八分鐘為第五個時 間區域），再將此四個時間區域所收集之樣品做MTT assay。

實驗結果得知以第二個時間區域和第三個時間區域之樣品具生物活性，

決定以第二個時間區域作進一步 HPLC 分析，將之細分。在 HPLC 的分析條 件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流動相，此兩種溶劑皆含有 0.1%三氟乙 酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第零分鐘至第二十六分鐘 以 62% 二次蒸餾水和 38% 乙腈混合。

第三層HPLC 分析圖共分為五個區域收集（第三分鐘至第五分三十秒為第 一個時間區域；第五分三十秒至第十一分三十秒為第二個時間區域；第十一分 三十秒至第十四分鐘為第三個時間區域；第十四分鐘至第二十二分鐘為第四個 時間區域；第二十二分鐘至第二十四分鐘為第五個時間區域），再將此五個時 間區域所收集之樣品做MTT assay。經實驗結果顯示，第二個時間區域和第三 個時間區域兩者具有生物活性，決定用HPLC 對第二個時間區域所收集之樣品

作分析，將之細分。在HPLC 的分析條件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流 動相，此兩種溶劑皆含有0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相 搭配方式為第零分鐘至第二十六分鐘以 62% 二次蒸餾水和 38% 乙腈混合。

第四層HPLC 分析圖共分為六個區域收集（第四分鐘至第八分鐘為第一個 時間區域；第八分鐘至第十二分三十秒為第二個時間區域；第十二分三十秒至 第十五分鐘為第三個時間區域；第十五分鐘至第十七分鐘為第四個時間區域；

第十七分鐘至第二十二分鐘為第五個時間區域；第十五分鐘至第二十六分鐘為 第六個時間區域），再將此六個時間區域所收集之樣品做 MTT assay。經實驗 結果顯示，第五個時間區域和第六個時間區域之樣品具有較強生物活性。決定 以生物活性最強之第六個時間區域以 HPLC 作進一步的分析。在 HPLC 的分 析條件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流動相，此兩種溶劑皆含有 0.1%三 氟乙酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第零分鐘至第三十二 分鐘以 80% 二次蒸餾水和 20% 乙腈混合，第三十二分鐘至五十二分鐘由 80% 二次蒸餾水和 20% 乙腈呈線性改變為 0% 二次蒸餾水和 100% 乙 腈，第五十二分鐘至第五十七分鐘維持在 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈。（圖 2-6）

圖2-6 第五層 HPLC 移動相比例示意圖

第五層HPLC 分析圖共分為兩部份收集（第四十八分三十秒至第四十九分 鐘為單一峰收為一部分，其餘收為另一部分），再將此兩部份做 MTT assay。

經實驗顯示，單一的部份有較高的生物活性，另一部份則無，到此，單一生物 活性成分已被分離出來。

三、結果與討論

The rate of HeLa's survive (%) 0 50m g/m l m ethanol extract

The rate of HeLa's survive (%)

圖3-1 香杉、油杉和粗榧之樹葉及嫩枝的 MTT assay 比較