國 立 交 通 大 學
生 物 科 技 學 系
碩 士 論 文
台灣粗榧樹葉中具生物活性成分之分離與鑑定
Isolation and Identification of Bioactive Compounds from the
Leaves of Cephalotaxus Wilsoniana
研 究 生：陳令宗
指 導 教 授：吳東昆 博士
台灣粗榧樹葉中具生物活性成分之分離與鑑定
Isolation and Identification of Bioactive Compounds from the Leaves of
Cephalotaxus Wilsoniana
研究生：陳令宗 Student: Ling-Tsung Chen 指導教授：吳東昆 Advisor: Tung-Kung Wu
國 立 交 通 大 學
生 物 科 技 研 究 所
碩 士 論 文
A Thesis
Submitted to Department of Biological Science and Technology College of Science
National Chiao Tung University In partial Fulfillment of the Requirements
For the Degree of Master
in
Biological Science and Technology March, 2007
Hsinchu, Taiwan, Republic of China 中華民國九十六年三月
台灣粗榧樹葉中具生物活性成份之分離與鑑定
研究生：陳令宗 指導教授：吳東昆
國立交通大學生物科技學系
摘要
台灣粗榧是一種常綠樹木，分佈在台灣中海拔山區。台灣粗榧已有三種 抗癌成分被分離出來，分別是Taiwanhomoflavone-A，Taiwanhomoflavone-B 和 C-3-epi-wilsonione。研究初步發現由 4.6 kg台灣粗榧樹葉的甲醇萃取物可能具 有生物活性物質且對HeLa cell具有很強的抑制效果，這與先前研究結果不一 致。為了找出此一物質，我們針對粗榧各個不同部位進行一系列甲醇、水、正 丁醇的萃取，再以HPLC分離各成份，隨後以MTT assay對分離出 17 mg的單一 成分進行生物活性確認，並運用各種光譜分析以鑑定結構。根據1H-NMR、 13C-NMR 、 HMQC 、 HMBC 和 COSY 得 到 的 結 構 命 名 為 4', 5, 7 － trihydroxyflavone，學名是apigenin。Apigenin於先前文獻中已指出此化合物對 數種癌細胞有抑制生長之作用。本研究發現apigenin對HeLa，BEAS-2B，AGS， COLO-205 的生物活性，其ED50為3.084、無反應、無反應、8.195 μg/ml（11.422， 無反應，無反應，30.35μM）。在我們成功的分離並鑑定出此藥物後，在未來 將對此化合物的抑癌機制作進一步的探討，並希望能對此化合物作官能基的修 飾以增進其抑癌的效果。 ED50 CELL μg/ml μM BEAS-2B x x AGS x x COLO-205 8.195 30.35 HeLa 3.084 11.422Isolation and Identification of Bioactive Compounds from the
Leaves of Cephalotaxus Wilsoniana
Student：Ling-Tsung Chen Advisor：Tung-Kung Wu
Department of Biological Science and Technology
National Chiao Tung University
Abstract
Cephalotaxus wilsoniana Hayata is an evergreen tree distributed over the middle mountains of Taiwan. Several antitumor components, including Taiwanhomoflavone-A, Taiwanhomoflavone-B and C-3-epi-wilsonione, have been reported from C. wilsoniana Hayata recently. A crude methanol extract of C.
wilsoniana leaves（4.6 kg） showed potent cytotoxic activity against HeLa cells in vitro. This subdivided cytotoxic activity exhibited different discrepancy than
previous research. In order to characterize the chemical constituents in different
parts of plant and to find out the bioactivities compounds of C. wilsoniana Hayata,
a series of extraction (from H2O to butanol of original methanol extraction layer)
was carried out. Moreover, HPLC chromatography was utilized to separate each component. The cytotoxic activity of these extracts against HeLa cells were analyzed by the MTT assay. Structure elucidation, using 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, and COSY, revealed the structure as 4', 5, 7－trihydroxyflavone and thatz the scientific name is apigenin（17 mg）. Researches on apigenin has shown inhibitory effect on the growth of various cancer cells. Our study showed
that apigenin showed bioactivity ageinst the HeLa, BEAS-2B, AGS, and
COLO-205 in concentration-dependent manner with ED50 values of about 3.084, no
reaction, no reaction, and 8.195 μg/ml（11.422, no reaction, no reaction, 30.35 μM）. In the future, research will focus on the mode of action of the drug and the functional group modification of the drug for the improvement of anti-cancer efficacy. ED50 CELL μg/ml μM BEAS-2B x x AGS x x COLO-205 8.195 30.35 HeLa 3.084 11.422
誌謝
時光匆匆，猶記得當初帶著忐忑不安的心負笈北上，如今我將懷著感恩的 心滿載而歸。 兩年多來的實驗室生活，首先要感謝的是我的指導教授吳東昆 博士總提 供不虞匱乏的實驗室資源，並且以有教無類的精神，灌輸學生正確的實驗觀念 及遇事所應有的積極態度；感謝口試委員刁維光 教授及林敬堯 教授能在百忙 之中撥空審閱論文，並對論文中的各項細節提供諸多真知灼見的寶貴意見，使 論文得以完備。 研究期間，感謝實驗室的大學長程翔學長，對我的實驗總能適時提供意見 和正確方向，以及最後的結構光譜上的幫忙，才得以順利解出結構；感謝裕國 學長，在 cell culture 方面指導許多技術層面的問題，讓 cell culture 實驗 最後順利進行；感謝媛婷學姊，她總無時不刻的適時付出關心、鼓勵，也在實 驗意見上給予我相當大的幫助；感謝晉豪學長，從我實驗之初，直到論文完成 前的最後一刻，不厭其煩的從旁指導，和我討論實驗中的各個相關細節，直到 現在能夠獨立操作實驗及思考；感謝文鴻學長，對任何人總是熱情毫無私心， 總會在我需要協助時伸出援手；感謝號稱天才的晉源，在實驗室裡陪我一路走 來，一起哭一起笑一起瘋狂；感謝大鳥和宏明兩位一起奮鬥的同學，一起熬過 許多似無止盡的夜晚，並在最艱辛的畢業衝刺，能互相扶助、關心；還有可愛 的學弟妹文暄、小妹、皓宇、大景、小高、文祥、世勳、采婷，總為實驗室帶 來歡笑氣氛，並為在口試時的幫忙。 感謝袁俊傑老師實驗室的弘毅、威震、奕榮、佳穎，世昌、詩穎、彥棋及 彭慧玲老師實驗室的智凱，在實驗最後階段不斷關懷打氣；感謝大學同學旭 宇、志偉、蓮蒂、靜宜、曉青，在我研究期間從旁加油打氣。 最後，要感謝一路默默支持著我的爸爸媽媽，不時的噓寒問暖，給予精神 上最大支柱，讓在實驗室的我，能心無旁鶩的完成學業。目錄
中文摘要……….……i 英文摘要………...………….ii 誌謝………..…….iv 目錄………..………..v 圖表目錄………...…………...vii 一、序論... 1 1.1 天然產物化學 ...1 1.2 細胞週期（Cell Cycle）和細胞凋亡（Apotosis） ...7 1.2.1 細胞週期 ...7 1.2.2 細胞凋亡 ... 11 1.2.3 細胞凋亡的研究方法 ...131.3 台灣粗榧（Cephalotaxus wilsoniana Hayata.） ...15
1.3.1 三尖杉屬（Cephalotaxus） ...15
1.3.2 三尖杉屬（Cephalotaxus）先前之研究...15
1.3.3 台灣粗榧（Cephalotaxus wilsoniana Hayata）之簡介...24
1.4 台灣粗榧之研究文獻回顧...25 1.4.1 Taiwanhomoflavone-A ...25 1.4.2 Taiwanhomoflavone-B ...26 1.4.3 C-3-epi-wilsonione...27 1.5 研究動機與目的 ...28 二、材料與方法... 30 2.1 實驗材料 ...30 2.2 實驗儀器 ...31 2.3 分離方法簡述 ...32 2.4 癌細胞毒殺活性檢測（MTT assay）...35 2.5 天然物分離實驗流程...38 三、結果與討論... 44
3.1 有機層分析 ...44 3.1.1 植物之篩選 ...44 3.1.2 有機層之分析 ...44 3.2 HPLC分析...46 3.2.1 第一層HPLC分析...46 3.2.2 第二層HPLC分析...48 3.2.3 第三層HPLC分析...51 3.2.4 第四層HPLC分析...55 3.2.5 第五層HPLC分析...59 3.3 細胞生物活性測試分析...61 3.4 結構之解析 ...62 3.4.1 EI-MS ...62 3.4.2 1H-NMR...63 3.4.3 13C-NMR ...64 3.4.4 DEPT ...65 3.4.5 HMQC ...66 3.4.6 HMBC ...67 3.4.7 COSY ...68 3.4.8 結構 4'，5，7－trihydroxyflavone ...69 3.5 討論 ...70 四、未來展望... 75 五、參考文獻... 76
圖表目錄
圖1-1 paclitaxel………..………...………4 圖1-2 camptothecin………...………4 圖1-3 1981-2002 年新藥開發統計………...…5 圖1-4 細胞週期（cell cycle）……….………...…8 表1-1 三尖杉屬先前之研究………...……15 圖1-5 台灣粗榧………..……….…25 圖1-6 Taiwanhomoflavone-A結構………...…26 圖1-7 Taiwanhomoflavone-B結構………...……27 圖1-8 C-3-epi-wilsonion 結構……….…27 圖2-1 粗榧葉有機層萃取流程圖………...……….…33 圖2-2 粗榧葉 HPLC 分析流程圖………...……….…34 圖2-3 MTT assay 流程圖………36 圖2-4 第一層 HPLC 移動相比例示意圖………...……40 圖2-5 第二層 HPLC 移動相比例示意圖………...……41 圖2-6 第五層 HPLC 移動相比例示意圖………...…42 圖3-1 香杉、油杉和粗榧之葉子及嫩枝的 MTT assay 比較……….…44 圖3-2-1 不溶於正丁醇萃取物之 MTT assay………45 圖3-2-2 溶於正丁醇萃取物之 MTT assay………45 圖3-3 正丁醇萃取物之 HPLC 分析………...…46 圖3-4-1 由圖 3-3 中 HPLC 分析收得 fraction I 之 MTT assay………...…47 圖3-4-2 由圖 3-3 中 HPLC 分析收得 fraction II 之 MTT assay…………...…..…47圖3-4-3 由圖 3-3 中 HPLC 分析收得 fraction III 之 MTT assay………47
圖3-5 正丁醇萃取物之第二層 HPLC 分析………...…48
圖3-6-1 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得 fraction I 之 MTT assay……….…49
圖3-6-2 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得 fraction II 之 MTT assay……….…49
圖3-6-3 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得 fraction III 之 MTT assay……….………50 圖3-6-4 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得 fraction IV 之 MTT assay……….…50 圖3-7 正丁醇萃取物之第三層 HPLC 分析………...…51 圖3-8-1 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得 fraction I 之 MTT assay……….…52 圖3-8-2 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得 fraction II 之 MTT assay……….…52 圖3-8-3 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得 fraction III 之 MTT assay……….…53 圖3-8-4 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得 fraction IV 之 MTT assay……….………53 圖3-8-5 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得 fraction V 之 MTT assay……….…54 圖3-9 正丁醇萃取物之第四層 HPLC 分析………...…55 圖3-10-1 由圖 3-9 中正丁醇第四層 HPLC 分析收得 fraction I 之 MTT assay……….…56 圖3-10-2 由圖 3-9 中正丁醇第四層 HPLC 分析收得 fraction II 之 MTT assay……….…56 圖3-10-3 由圖 3-9 中正丁醇第四層 HPLC 分析收得 fraction III 之 MTT assay……….…57 圖3-10-4 由圖 3-9 中正丁醇第四層 HPLC 分析收得 fraction IV 之 MTT assay………...57 圖3-10-5 由圖 3-9 中正丁醇第四層 HPLC 分析收得 fraction V 之 MTT assay……….…58 圖3-10-6 由圖 3-9 中正丁醇第四層 HPLC 分析收得 fraction VI 之 MTT assay……….…58 圖3-11 正丁醇萃取物之第五層 HPLC 分析………...…59 圖3-12 由正丁醇萃取物之第五層 HPLC 分析中所分離出來的單一峰之確
認………...………..59 圖3-13-1 由圖 3-11 中正丁醇第五層 HPLC 分析收得的單一峰之 MTT assay……….…60 圖3-13-2 由圖 3-11 中正丁醇第五層 HPLC 分析收得的單一峰以外之 MTT assay……….………60 圖3-14 EI-MS 圖譜………..…62 圖3-15 1H NMR圖譜………...…...…63 圖3-16 13C NMR圖譜……….…64 圖3-17 DEPT 圖譜………...…65 圖3-18 HMQC 圖譜……….…66 圖3-19 HMBC 圖譜……….…67 圖3-20 COSY 圖譜………..…68 圖3-21 4'，5，7－trihydroxyflavone 結構………69 圖3-22 由圖 3-11 中正丁醇第五層 HPLC 分析收得的單一峰對 HeLa cell 之 MTT assay………70 圖3-23 由圖 3-11 中正丁醇第五層 HPLC 分析收得的單一峰對 AGS cell 之 MTT assay………..………..71 圖3-24 由圖 3-11 中正丁醇第五層 HPLC 分析收得的單一峰對 COLO 205 之 MTT assay………...71 圖3-25 由圖 3-11 中正丁醇第五層 HPLC 分析收得的單一峰對 BEAS-2B 之 MTT assay………72 圖3-26 Flavopiridol………...…..…74 圖3-27 Apigenin 在子宮頸癌細胞凋亡途徑中所造成之影響………..…74
一、序論
1.1 天然產物化學
中草藥醫學對人類來說是最古老的用藥方式，它是許多早期文明社會治 療的依靠，也仍是現今世界醫學中廣泛熟悉的方式，傳統中藥在東亞地區的使 用情形相當普遍，形成了西藥之外的另一種用藥文化；但日本、中國等國家受 西方價值觀念影響，曾分別在明治維新初期及民國初年毅然提倡西醫治療方 法，幸賴少數有識之士承傳中國醫學，直至現代，中國醫學才又逐漸受到重視。 西方對於中藥，一般的印象都是認為中藥的製程不夠科學、療效緩慢而不明 顯、而適應的病症則是模糊且非單一的，因此許久以來一直遭受西方科學界的 存疑。但隨著科技發展，中藥材的成分逐一被分離鑑定，並且其治療的功效也 受到科學方法的証實，逐漸扭轉西方人對中草藥的觀念，也帶動了我國國人重 新省思自己祖先累積數千年經驗所遺留下來的寶藏。 中草藥在人類的生長發展扮演著一個重要的部份，它提供我們生活所需的 食物、用藥和化妝品之來源，因此我們能夠深刻地體認到在自然界中蘊藏著能 治療各種不同疾病的天然物。如今約有25%的處方用藥取自於樹木、矮灌木和 藥草。例如洋地黃（Digitalis）是被萃取自毛地黃（Foxglove）3，嗎啡（morphine）和可待因（codeine）是被分離自鴉片罌粟（opium poppy）4，奎寧（Quinine）
是來自於金雞納（cinchona）樹皮5等等。
實驗室合成出具活性的成分結構得以製成藥物；中草藥醫學是將整株植物進行 萃取，得到混合的萃取物並用於治療行為。一般中醫師都相信，一整株植物當 中所有具活性成分的整體治療成效，要比其中任何單一主要成分來的有療效。 例如，在植物當中具有很強活性之有害成分的效力非常強，則同一植物當中其 他成分可能限制其活性；若在植物當中具有活性之有益成分的效力不高，則同 一植物當中其他成分可能加強其活性，或者能幫助有效成分能抵達身體中所需 治療的器官組織。也因如此，中草藥醫學是以天然植物為原料並非合成的化學 物質，故中草藥醫學與一般現代用藥相比，中草藥醫學有著較低副作用和負面 影響的特性。因此，假使超過中草藥所指定的服用劑量，人類身體應該能夠承 受服用過量草藥所帶來強而有力的效力及危險性。除了用於治療的中草藥外， 還有一些植物化學成分是具生物活性的；吡咯啶植物鹼（pyrrolizidine alkaloids） 6是一種肝細胞毒，若大量服用會引發身體機能的混亂及迅速死亡。這些植物 鹼（alkaloids）能夠在一些植物中被發現到，如澤菊（ragwort）、灌木（bush
tests），這些都是從野百合屬（crotalaria species）和紫草（comfrey）中被發現。
所有的中草藥治療原料皆來自各種植物，原料之取得方式如下： 1 製成藥片7 2 浸泡8：將葉子或花果置入沸水製得 3 煎煮9：將樹皮或樹根置入沸水中熬煮一段時間製得 4 酊劑10：將植物的某部位，以酒精和水混合的液體泡製 草藥可包含各種不同的植物化學物質，如礦物、維他命和微量元素。某些 植物化學物質具備藥性反應並能對身體進行治療行為。在草藥處方中，不同植 物有著不同特性，且處方中的草藥搭配可根據完整的病歷資料和透過物理診斷
對患者檢查出的問題來進行調整。中草藥的使用可伴隨著飲食、運動和任何的 生活方式的改善來幫助病患減輕病狀。 人類對於中草藥和天然鹼藥物的使用已有相當長久的歷史，並且，中國傳 統民俗藥物的神奇治療效果已廣為世人所知，然而如先前所述，一整株植物當 中所有具活性成分的整體治療成效，要比其中任何單一主要成分來的有療效， 但是將含有複雜成分的整株植物用於治療會有幾個缺點，包括： 1. 對藥材的收集、貯藏、製備，會因過程的變異而造成生物活性降低。 2. 非必要成分所引起生物活性的協同作用、拮抗作用及其它不可預知的 生物活性之調控。 3. 植物的成分構成會因地域差異而有不同；氣候和生態條件；採收季節； 植物部位（根、葉、樹皮、嫩枝、花、果實、種子、乳汁等）等等。11 因此天然藥物化學在研究領域上扮演著重要角色，天然物化學的研究是植 物物質化學研究的入門。從天然物分離出抗癌或抗HIV的藥劑已被證實，這些 具有生物活性的成分，已被用於臨床當中，如紅豆杉醇（Taxol）12和喜樹鹼 （Camptothecin）13。紅豆杉醇（Taxol），一種大有可為並用於化療的雙萜 （diterpene），可由紫杉樹的樹皮中被分離出來，它能治療子宮癌和乳癌。然 而紅豆杉醇（taxol）的產量極低，為了收集紅豆杉醇（Taxol）而去收集紫杉 樹樹皮，使得紫杉樹面臨絕種的命運。全世界正企圖找出可當紅豆杉醇（Taxol） 來源的植物種類，以便來進行半合成。紫杉醇(Paclitaxel)，一種半合成化合物， 美國食品及藥物管理局（FDA）已測試得知紫杉醇(Paclitaxel, 圖1-1)與紅豆杉 醇（Taxol）具有生物相等性（Bioequivalent）。喜樹鹼（Camptothecin, 圖1-2） 已被當作DNA拓樸異構酶I的抑制劑。（拓樸異構酶的作用是將超螺旋DNA纏
繞和鬆開以便組成染色體，假如染色體無法鬆開，則DNA轉錄不能進行，使 得蛋白質合成受到阻擾。） H N O O O OH O O O OH O O O O H O O N N O O OH 圖 1-1 paclitaxel 圖 1-2 camptothecin 因此，天然物成分的分離包含以下幾個優點： 1. 在實驗室的觀點中，可以合成或相同方式將之再生；在治療觀點中，能 夠掌握精確劑量用於治療及試驗。 2. 特定成份或成分的分類可促使分析測試之發展。 3. 經結構測定之具有生物活性的成分，可用來作為合成物質產物之原料。 藉由官能基結構修飾可使其生物活性更好。 根據1981年至2002年之間的統計1,14-16，有1031種藥物被開發，而這些藥物 來源主要分類，可分為生物來源（B）、天然物來源（N）、衍生物來源（ND）、 修飾現有藥物來源（S）、全合成來源（S*）、疫苗（V）。當中以天然物為基礎， 最後成為藥物的共佔28％（天然物來源5％、天然物衍生物來源23％），然而若 將對抗疾病藥物的範圍縮減為抗癌藥物，可發現當中以天然物為基礎，最後成 為藥物的共佔40％（天然物來源14％、天然物衍生物來源26％），以統計數據 觀察，從天然物尋找抗癌藥物是極具潛力的。（圖1-3）
B：Biological（生物）；由有機體/細胞或經由生物技術從宿主得到 的蛋白質作為用藥來源
N：Natural product（天然物）；由植物提煉出化合物作為用藥來源
ND：Derived from a natural product（天然物之衍生物）；以天然物為
原料，經由結構修飾官能基做為用藥來源
S：Totally synthetic drug（合成藥物）；以現有之藥物，經由結構之 修飾作為用藥 S*：經全合成而得，但其中藥效基團來自於天然物 V：Vaccine（疫苗） （a） B：Biological（生物）；由有機體/細胞或經由生物技術從宿主得到 的蛋白質作為用藥來源 N：Natural product（天然物）；由植物提煉出化合物作為用藥來源
ND：Derived from a natural product（天然物之衍生物）；以天然物為
原料，經由結構修飾官能基做為用藥來源
S：Totally synthetic drug（合成藥物）；以現有之藥物，經由結構之 修飾作為用藥 S*：經全合成而得，但其中藥效基團來自於天然物 V：Vaccine（疫苗） 圖1-3 1981-2002 年新藥開發統計（a）新藥開發來源分類統計（b）抗癌藥 物開發來源分類統計1 （b） 生長在地球上的植物大約有500,000種。目前估計每單一種類的植物中， 至少有5,000個以上不同成分，所以該用什麼策略去探索需要的成份呢？依中
草藥醫學使用不同植物來進行治療來看，具有生物活性的成分會來自於不同的 來源。傳統民俗藥物分離出植物中可用部份的成分來使用，但分離過程或條件 的差異會造成生物活性的改變。另外，除已知中草藥醫學所選用植物外，尚有 其它植物所含若干成分亦有生物活性，而這些有效成分在含有複雜成分的植物 中無法凸顯出其效用，需藉由各種方式將其分離並應用。 首先，選定的植物用風乾或冷凍乾燥將多餘水分除去，之後使用甲醇或乙 醇等不同溶劑加以萃取，再利用不同極性的各種溶劑作分層萃取。不同分層的 分 離 需 要 多 步 驟 及 多 維 層 析 ， 許 多 的 層 析 方 式 ， 如TLC （ Thin-Layer
Chromatography），CC（Column Chromatography）和HPLC（High-Pressure Liquid
Chromatography）等等已被廣泛應用在中草藥成分分離中。
而在結構分析方面主要分光儀來完成結構測定的過程，分光儀包含UV-Vis
（Ultraviolet-Visible Spectroscopy），IR（Infrared Spectroscopy），NMR（Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy）和MS（Mass Spectrometry）。當未知成分有 較好的結晶時，可使用單晶X射線繞射（X-ray diffraction）的方式來研究。在 相同例子中，絕對立體化學亦可使用當作測定。X射線繞射的研究能夠獲得分 子的3D形狀、鍵結長度和角度，以及分子內或分子外的互相作用等等有意義 資訊。 發展植物成分的衍生物當做化療藥物時，須由植物學者、化學家和生物學 家協力合作。然而，以地球上大量的植物來源比較，只有少部份種類已經被探 測，可是並不完全。在許多例子中，極性或水溶成分和植物萃取物之巨分子並 沒有完全被研究透徹，在日後也具有很大的研究價值。至今已有九種抗癌藥物
分離在美國臨床使用已獲得認可；這些藥物包含長春鹼(Vinblastine)、長春新 鹼(Vincristine)、溫諾平(Navelbine)、順鉑（Etoposide）、替尼泊苷（Teniposide）、 紅豆杉醇（Taxol）、泰索帝（Taxotere）、拓樸替康（Topotecan）、伊立替康 （Irinotecan）等，這些都是目前甚至日後最佳的治療方式。
1.2 細胞週期（Cell Cycle）和細胞凋亡（Apotosis）
抗癌藥物能有效的對癌細胞產生作用，通常是藥物能改變癌細胞的細胞週 期中的調控，並進一步使得癌細胞進入細胞凋亡，而達到對抗癌細胞之目的。 以下進一步介紹細胞週期(Cell Cycle)與細胞凋亡(Apotosis)的詳細機制。 1.2.1 細胞週期（Cell Cycle） 生物體依照DNA 序列的指示重複進行著生長、發育及生殖等過程。當母 細胞生長、分裂成第一代子細胞，子細胞再生長、分裂為第二代子細胞，如此 不斷地進行，這種週期則稱為細胞週期（cell cycle）。細胞生長經由細胞週期 和部份的轉錄調節，像是DNA 複製就是利用一些蛋白質去調控其他的基因，並調節細胞週期中多方面的機制，而其中 cyclin 和 cyclin-dependent kinases
圖 1-4 細胞週期（cell cycle） 細胞週期（cell cycle）指的是包含了 G0/G1、S、G2、M 等階段時期。 Gap 0（G0）：細胞處於休眠的狀態，也許是暫時性休眠或是永久性休眠， 需有適當的訊息才會重新進入細胞週期。 Gap 1（G1）：細胞維持正常代謝與繼續生長，在進入S（synthesis）時期之 前會檢查染色體（chromosome）DNA是否受到破壞而進行修 補（repair）工作，此時期需要花十小時到十二小時。細胞亦 可由此脫離細胞週期進入不生長的休止狀態（G0）。 Synthesis（S）：當細胞進入S時期會花六到八小時進行DNA之複製，將原本 的二十三對染色體加以複製。 Gap 2（G2）：當細胞進入G2時期需要花三至四小時，此時期細胞繼續生長 並且合成蛋白質，此外，細胞亦負責檢查染色體DNA的複製 是否完整而準備進行下一步的有絲分裂（mitosis）。 M（mitosis）：細胞會由一個母細胞變成兩個子細胞，當染色體複製完成之
後便會各自分配到子細胞內，讓子細胞內的染色體與母細胞 完全一樣，此時期約為一小時，最後子細胞便準備再進入下 一個細胞週期。 在細胞週期方面癌細胞與正常細胞最大差別在於癌細胞的細胞週期調控 脫離常軌，使其不正常的增生。調控細胞週期的因子最為廣泛研究的是p53， 而p53的調節包括DNA錯誤配對修復（mismatch repair）、鹼基的切除修復（base excision repair）或核苷酸的切除修復（nucleotide excision repair）三種系統。 在細胞週期中，每個階段之交界處都有所謂的「檢查點」（checkpoint），由 1980年美國的Leland Hartwell所提出，主要是說細胞週期有暫時停止的現象 （cell cycle arrest），並觀察細胞是否受到破壞，而進行修補（repair）或是進 行DNA的合成（synthesis），最後進行細胞有絲分裂（mitosis），當其無法修 復時，會走向細胞凋亡（apoptosis）的途徑，最後導致細胞死亡。而p53基因 的調節錯誤往往會導致細胞癌化的現象發生。 週期素（cyclins）D和E主要存在G1 期，並在G1-S 時期會被分解，像是 幾種cyclin-dependent kinases （CDKs），皆與G1期調控有關，當靜止細胞進 入細胞週期時，基因編碼（encoding）在D-type週期素上（D1，D2，和D3）， 並且誘發細胞分裂的訊息，而週期素亦會催化一些因子，如CDK4和CDK6， 進而促進G1期。 由Cyclin D1去調節holoenzymes的次單元並使其磷酸化，而視網膜母細胞 瘤蛋白(retinoblastoma protein；pRb)呈現未活化狀態而抑制細胞週期，pRb可說 是G1期的看門人，亦可說它會穿越過限制點而導致DNA的合成。當cyclin D1
過度表現時，會是導致癌症和腫瘤因子的形成和轉移的開始。故cyclin D1在 G1期的調控扮演重要角色。
關於真核細胞的G1/S期的檢查點(checkpoint)，主要是G1 期進入DNA合 成期(synthesis phase)時，由兩群細胞激素調控，包括(CDK4/6-cyclin D和 CDK2-cyclin E)，及轉錄複合物包括(Rb and E2F) 扮演在此檢查點的關鍵角 色。在G1-phase，發現Rb-HDAC的抑制複合物會與E2F-DP1轉錄因子結合並抑 制下游路徑的轉錄。藉由CDK4/6和分離的CDK2與Rb-repressor complex會使Rb 磷酸化，容許轉錄的S期基因與蛋白編碼(encoding)，成為一個G1往S期的開 關，並進行DNA複製。多數不同的刺激會影響檢查點(checkpoint)的控制，如 TGF-β，DNA 損傷，接觸抑制（contact inhibition），和生長因子消退。在INK4 家族蛋白中，包括p14、p15（INK4B）、p16（INK4A）、p18（INK4C）以及 p19（INK4D），會抑制CyclinD/CDK4與Cyclin D/CDK6而調控G1期。還包括 Kip/Cip families亦與G1期調控有關。而TGF-β會抑制Cdc25A的轉錄，並活化細
胞週期激素的磷酸化。而KIP/CIP families，包括了p21（CIP1/WAF1/SDI1）
、p27（KIP1）
以及p57（KIP2）
。在細胞週期和細胞凋亡的路徑，轉錄因子p53扮演一個重要的 角色，它是一個多頻率的腫瘤抑制基因，當細胞缺p53時會導致DNA損傷和裂 殖原（mitogenic）受到刺激而使細胞死亡。造成細胞損傷可能是由蛋白質激素， ATM（ataxia telangiectasia mutated）和ATR（ATM-related）所引起的。ATM 藉由離子放射線或其他因子辨識雙股的斷裂。ATM和ATR分別活化轉換調節 點CHK2和CHK1。CHK1藉由細胞核的互斥或降解抑制CDC25磷酸化並抑制 CDKs磷酸化。CHK2和ATM的訊息經p53誘發p21Cip1/WAF1的表現，多種前 凋亡因子（Puma, Bax, Noxa），DNA修補和氧化壓力基因和回饋調節HDM2。 p53 是 一 種 壽 命 較 短 的 蛋 白 並 藉 ATM 的 磷 酸 化 而 活 化 轉 錄 ， 而 遍 存 素
（ubiquitin）接合酶HDM2結合p53使細胞核p53互斥或破壞。另一個G1的調節 點功能為p53和Rb去調控高度活化的Ras，Myc和E2F訊息。故與細胞週期有關 的因子包括p15、p16、p21、p27、p53、CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D、cyclin E等等都在G1期扮演著重要的角色。 1.2.2 細胞凋亡（Apoptosis） 細胞凋亡是一種細胞自殺的機制，用以調控組織中的細胞數目並減少個 別細胞對於動物生存的威脅。如細胞表面的專一性受器、死亡受器（death receptors）。而死亡受器會偵測到細胞外面死亡的訊息，並進入細胞內而導致 細胞凋亡的機制。 細胞凋亡又稱為細胞計畫性死亡，在真核細胞的生長與細胞分化中排除大 量與不需要的細胞的方式，為一種細胞自我毀滅的過程。在多細胞的生物體 中，細胞凋亡為一種調控與維持細胞數目非常重要的程序。而生物體的恆定亦 需要細胞凋亡與細胞增生的之間平衡來控制。倘若細胞凋亡程序被抑制或是其 中調控的基因遭受損害，則會造成細胞無法走向程式性凋亡，而導致細胞循錯 誤訊息而繁衍下去，造成細胞不斷增生與細胞癌化。 細胞凋亡與細胞壞死（necrosis）的不同在於細胞凋亡的死亡是經由分裂 成DNA片段、細胞膜皺縮、染色質濃縮凝集形成凋亡小體（apoptotic bodies）， 由單核球或巨噬細胞（macrophage）吞噬處理掉。細胞凋亡是有計畫性的死亡， 細胞凋亡只牽涉到本身的細胞，對於其他周圍的細胞並不涉及在內，而且不發 生發炎現象。而細胞壞死意即是壞死，而其死亡方式會造成細胞發炎、細胞破
裂，釋出發炎因子並且涉及周圍細胞，有壞死現象的出現。 而細胞凋亡與凋亡蛋白酵素（caspase）有很重要的關係，caspase-specific inhibitors會抑制促進細胞凋亡的刺激因子，故得知凋亡蛋白酵素在細胞凋亡當 中也是扮演著很重要的角色。在細胞凋亡啟動的時候，凋亡蛋白酵素會活化細 胞凋亡路徑，亦是所謂的瀑布式的效應，故利用本身的酵素活性去切割下游的 凋亡蛋白酵素並活化凋亡蛋白酵素。而細胞凋亡的現象，會產生DNA片段的 斷裂，故從電泳圖可以看到DNA ladder的產生。而凋亡蛋白酵素有兩個種類， 其中一類包括起始的凋亡蛋白酵素，有凋亡蛋白酵素-2，-8，-9，-10，另一類 則為有作用的凋亡蛋白酵素，有凋亡蛋白酵素-3，-6，-7，當凋亡蛋白酵素活 化時，有作用的凋亡蛋白酵素會將細胞中蛋白質裂解掉，最後導致細胞的死亡。 經由粒線體路徑誘發的細胞凋亡，其會釋出細胞色素c（cytochrome c）， 是一種電子傳遞鏈的關鍵蛋白，經由粒線體的細胞凋亡信號，會活化Apaf-1， 進而活化凋亡蛋白酵素-9，而Smac/DIABLO會自粒線體釋出，並抑制IAP蛋 白，使凋亡蛋白酵素-9作用而促進細胞凋亡，而Bcl-2家族蛋白會調節細胞凋亡 並形成複合物而進入粒線體的膜裡面，而後釋出Cytochrome c和其他蛋白。而 凋亡蛋白酵素 的瀑布式反應經此路徑直接活化TNF家族受器而導致細胞凋 亡 ， 但 不 活 化 Bid 、 Bcl-2 家 族 ， 這 稱 為 粒 線 體 誘 發 之 細 胞 凋 亡 （mitochondria-mediated apoptosis）。Bax為另一群Bcl-2家族，藉由此路徑活 化而增加，而後釋出細胞色素c和其他蛋白。而Bcl-2、Bcl-xl會防止孔道形成 並阻斷細胞凋亡。細胞凋亡刺激因子（apoptosis inducing factor）是另一個粒 線體因子，會釋出細胞質液誘發細胞凋亡，細胞凋亡刺激因子在分化期間為一 重要角色但不需依賴凋亡蛋白酵素的幫助。
(1) 細胞凋亡之外在路徑
外在路徑由死亡受器與細胞膜上的表面受器結合放出計畫性死亡訊號後 開啟。當開啟細胞凋亡的大門之後會活化凋亡蛋白酵素，產生瀑布式（cascade） 反應，而此路徑的速率很快，如CD95（Fas）、TNFR1、TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）皆是外在路徑，在免疫系統和造骨作用中，TNF可 調控多種機制，在先天性與適應性免疫反應中，扮演著一重要角色。這些蛋白 包括TNFα、lymphotoxin-α或-β、Fas ligand (FasL)、CD27L、CD30L、CD40L、 TALL-1..等等。TNFα在體外和體內的肝細胞增殖扮演著一個重要的角色，並 且在幾種肝細胞損傷的模型中會產生作用並調控細胞死亡。 (2)細胞凋亡之內在路徑 內在路徑由粒線體路徑誘發的細胞凋亡，主要是由caspase蛋白和Bcl-2家 族蛋白的參與。Caspase的全名為Cystein aspartase，為Cystein活化態殘基的蛋 白酶。Bcl-2 family包括了Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-Xs、Bad、Bag、Bak、Bid。具 有促進以及抵抗細胞凋亡的功能。 1.2.3 細胞凋亡的研究方法 辨別細胞是否進行細胞凋亡，目前有幾種指標可以參考。首先就細胞型態 而 言 ， 由 於 細 胞 凋 亡 活 化 了 許 多 內 生 性 的 蛋 白 質 分 解 酶 （endogenous proteases），導致細胞骨架的破壞（cytoskeletal disruption）、細胞萎縮（cell shrinkage）、細胞膜上會有泡狀物（membrance blebbing）的產生，並且有染 色質濃縮（chromatin condensation）的現象。
另 外 就 細 胞 核 的 變 化 而 言 ， 由 於 活 化 了 細 胞 之 核 酸 內 切 酶
（endonuclease），造成此酵素吸附到DNA 的核間區域（internucleosomal spacer
DNA regions），使核內DNA 斷裂成片段，此結果可藉由洋菜凝膠電泳（agarose
gel electrophoresis）觀察到 DNA 呈梯狀的排列。以往的研究視 DNA 梯狀排列 為細胞凋亡的正字標記，DNA 斷裂過程可能分為二期，第一期是把基因體以 domain cleavage 的方式切成 200-300 及 30-50 kb 的斷片，此期的核酸內切酶稱
為 domain nuclease ； 第 二 期 則 由 fragmentation nuclease ， 切 位 在 核 小 體
（nucleosome）之間的連接處，而形成 180-200 bp 的 DNA 梯狀排列規則斷片。 流式細胞儀（flow cytometry）的應用是另一項較新的技術，其配有15微瓦 的氬離子電射，發射出488 nm波長的藍光，細胞樣本附著能被488 nm藍光雷射 激發的螢光染料後，會發散出或綠、或橙紅、或深紅色的螢光，而被儀器所分 析。常用來定量DNA的染劑為碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），能嵌入雙鏈 DNA及RNA的鹼基對中，由於碘化丙啶不能進入細胞膜，因此進行DNA分析 時，需先在細胞膜上打孔，再除去細胞中的RNA，此法常用來做DNA細胞週 期分析。 正常人體的DNA是雙套的（2N），由於凋亡細胞DNA斷裂成小片斷，因 此會比正常G0/G1期細胞有較低的染色密度（stainability），經PI染色後，可將 凋亡細胞顯現出來，而在直方圖中形成sub G1 peak。同樣以凋亡細胞的DNA 受核酸內切酶裂解現象，運用細胞內TdT（terminal deoxynucleotidyl transferase） 的反應，將DNA斷裂切口的3'-端用螢光標記過的特殊核酸BrdU來補充，這便 是所謂的TUNEL（TdT-mediated dUTP-dogoxigenin nick end labeling）分析法。
另外在活細胞的細胞膜只有內側含有磷脂醯絲胺酸（phosphatidylserine）， 對淍亡細胞而言，細胞膜尚未受到破壞，但會有磷脂醯絲胺酸移位到膜外側面 的現象，膜聯蛋白V（Annexin V）是一種能與磷脂醯絲胺酸結合的蛋白質， 經FITC染劑可標示移位細胞膜外的磷脂醯絲胺酸，再合併以PI對細胞膜破損的 壞死細胞進行染色，如此可區別活細胞、凋亡細胞及壞死細胞三種細胞族群， 可做為凋亡的早期變化之分析。
1.3 台灣粗榧（Cephalotaxus wilsoniana Hayata.）
1.3.1 三尖杉屬（Cephalotaxus） 台灣粗榧屬三尖杉屬之ㄧ種，而三尖杉屬為常綠喬木或灌木。葉線狀披針 形，對生或近對生，下表面中脈兩側各有一白色氣孔帶。雌雄異株或同株；雄 球花六至十一個聚生成頭狀，腋生；雌球花成頭狀，大孢子葉對生，頂端之數 片各腋生二個胚珠。種子由肉質假種皮包圍。台灣有一屬，在台灣為地域性植 物。17 1.3.2 三尖杉屬（Cephalotaxus）先前之研究 Compounds Species
cephalotaxine (1) 18,19-22 C. wilsoniana Hayata.
C. harringtonia C.hainanensis Li C. fortunei Hook f.
isocephalotaxine (2) 22-27 C. wilsoniana Hayata. C. harringtonia
C. hainanensis Li C. fortunei Hook
C. drupacea Sieb & Zucc and C. nana Nakai
epi-cephalotaxine (3) 28 C. fortunei Hook f.
cephalotaxinone (4) 29,28 C. harringtonia
C.hainanensis Li
isocephalotaxinone (5) 28
C. fortunei Hook f.
demethylcephalotaxine (6) 30 C. fortunei Hook f.
demethylcephalotaxinone (7) 28,30 C. fortunei Hook f.
acetylcephalotaxine (8) 23,31 C. wilsoniana Hayata.
C. hainanensis Li
C. fortunei Hook f.
cephalotaxinamide (9) 32 C. hainanensis Li
4-hydroxycephalotaxine (10) 33 C. fortunei Hook f.
11-hydroxycephalotaxine (11) 34 C. fortunei Hook f.
harringtonine (12) 24,25,29 C. harringtonia
C. fortunei Hook f. C. harringtonia
2-epi-harringtonine (14) C. fortunei Hook f.
homoharringtonine (15)25,29,35 C. fortunei Hook f.
C. harringtonia
neoharringtonine (16)25,29,35 C. fortunei Hook f.
C. harringtonia
2-epi-neoharringtonine (17) C. fortunei Hook f.
anhydroharringtonine (18)25,29,35 C. harringtonia
C. fortunei Hook f.
2-epi-anhydroharringtonine(19)25,29,35 C. fortunei Hook f.
C. harringtonia
deoxyharringtonine (20)25,29,35 C. harringtonia
epi-deoxyharringtonine (21) C. fortunei Hook f.
deoxyharringtonic acid (22)36 C.hainanensis Li
isoharringtoninic acid (23) C.hainanensis Li
drupacine (24)37 C. fortunei Hook f.
3-epi-wilsonine (26)23
C. fortunei Hook f.
C. wilsoniana Hayata. C. fortunei Hook f. C. harringtonia
C. drupacea Sieb & Zucc and C. nana Nakai
fortuneine (27) C. fortunei Hook f.
cephalofortuneine (28)33 C. fortunei Hook f.
2-epi-cephalofortuneine (29) C. fortunei Hook f.
Schlhammericine (30)35 C. wilsoniana Hayata.
C. harringtonia
3-epi-schelhammericine (31)38 C. fortunei Hook f.
3-epi-methylschelhammericine B(32) C. wilsoniana Hayata.
C. fortunei Hook f.
2-epi-cephalofortuneine (33) C. fortunei Hook f.
hainanolide (34)39 C. fortunei Hook f.
C. hainanensis Li
hainanolidol (35)40 C. fortunei Hook f.
C. hainanensis Li
C. wilsoniana Hayata.
sequoiaflavone (37)22 C. drupacea Sieb & Zucc and C. nana Nakai
ginkgetin (38)22 C. drupacea Sieb & Zucc and C. nana Nakai
sciadopitysin (39)22 C. drupacea Sieb & Zucc and C. nana Nakai
表1-1 三尖杉屬先前之研究 O O N R " R O R ' (1) Cephalotaxine (R=H, R’=H, R”=OCH3)
(8) Acetylcephalotaxine (R=COCH3, R’=H, R”=OCH3)
(11) 11-Hydroxycephalotaxine (R=OH, R’=OH, R”= OCH3)
(12) Harringtonine (R=C10H17O6, R’=H) (R=-COCCH2C(CH3)2, R’=H) HO OH CH2COOOCH3 (13) Isoharringtonine (R=C10H17O5, R’=H) (R=-COCCH2CH2C(CH3)2, R’=H) HO C-COOCH3 OH H
(14) epi-harringtonine (R=C10H17O5, R’=H) (R=-COC-CH2COOCH3, R’=H) OH CH2CH2C(CH3)2 OH (15) Homoharringtonine (R= C10H19O5, R’=H) (R=-COCCH2CH2CH2C(CH3)2 CH2COOCH3 OH OH (16) Neoharringtonine (R=-COCCH2Ph, R’=H) OH CH2COOCH3 (17) epi-Neoharringtonine (R=-COCCH2COOCH3, R’=H) OH CH2Ph
(18) Anhydroharringtonine (R= O , R’=H) CO- CH2CH2CH(CH3)2 (20) Neoxyharringtonine R=-COCCH2CH2C(CH3)2, R’=H OH H CH2COOCH3 (21) epi-deoxyharringtonine (R=-COCCH2COOCH3, R’=H) OH CH2CH2CH(CH3)2 (22) Deoxyharringtonine acid (R=-CH3C(CH2)2CCOO) H OH CH3 CH2 COOH
(23) Isoharringtonine acid (R=-CH3C(CH2)2CCOO) H OH CH2OH COOH O O N O O H (10) 4-hydroxycephalotaxine O O N O O O N OH O H (4) Cehalotaxinone (6) Demethylcephalotaxinone
O O N O RO O O N O H O (2) Isocephalotaxinone (R=CH3) (9) Cephalotaxinamide (7) Demethylcephalotaxinone (R=H) N R1O R2O CH3O NH CH3O CH3O R O
Homoerythrina alkaloids (25) Wilsonine (R=OMe, R’=H)
(31) 3-epi-schelhammericine (R1+R2=-CH2-) (26) 3-epi-wilsonine (R=H, R’=OMe)
(32) 3-epi-schelhammericine B (R1=R2=CH3) O O O N O H OMe (24) Drupacine
N OH CH3O CH3O O O O O (27) Fortuneine (34) Hainanolide O O O OH (35) Hainanolidol O O O H OH O OH O OMe CH3O OMe (36) Kayaflavone
1.3.3 台灣粗榧（Cephalotaxus wilsoniana Hayata）之簡介
台灣粗榧（圖1-4）為常綠中喬木，高達10公尺，樹皮光滑，枝條下垂， 小枝對生；頂芽常3枚並列。葉互生，扭生成兩列狀，線形扁平，略呈鐮刀狀
彎曲，先端銳形，基部鈍形，邊緣略為內捲。葉表面深綠色具光澤。背面具顯 著灰白色氣孔帶2條。中肋表裏均凸起，雌雄異株。3月開花，雄毬花4～12個 成頭狀花序著生於葉腋，雌花芽與新芽並生於小枝之頂端。授粉後於翌10～11 月成熟。種子呈橢圓形，成熟時呈暗紫色，種子核果狀近於無柄。特產於本省 海拔650～2,700公尺之山區，少量單株散生於針闊葉樹林及針葉樹林中，部分 聚生成小族群。在觀霧、東埔山、沙里仙溪、溪頭、翠峰、鞍馬山及北大武山 等地區見。本種為狹隘固有之孑遺植物，近年來因棲地破壞、盜伐、藥用和園 藝栽培等用途遭濫採之故，數量銳減，經列為稀有植物，極待保護。17 圖1-5 台灣粗榧
1.4 台灣粗榧之研究文獻回顧
1.4.1 Taiwanhomoflavone-A 西元2000年臺灣國立中國醫藥研究所郭曜豪教授從臺灣粗榧之莖部的乙醇萃取物中，分別用生物活性試驗分層中的各個成分，最後分離得到了一個新 的C-Methylated雙黃酮類化合物，Taiwanhomoflavone-A41（圖1-5）。其化合物 結構皆由光譜分析鑑定之。化合物之細胞毒殺試驗顯示對鼻咽癌細胞（KB）， 結腸癌細胞（COLO-205），肝癌細胞 （Hepa-3B）與子宮頸癌細胞（HeLa） 具抑制作用，經三天生物活性測試，其ED50數據分別為3.4、1.0、2.0與2.5 μg/ml。 O O CH3O OH O OH O O H OH OMe C H3 圖1-6 Taiwanhomoflavone-A結構 1.4.2 Taiwanhomoflavone-B 西元2000年臺灣國立中國醫藥研究所郭曜豪教授從臺灣粗榧之嫩枝的乙 醇萃取物中，分別用生物活性試驗分層中的各個成分，最後分離得到了一個新 的C-Methylated雙黃酮類化合物，Taiwanhomoflavone-B42（圖1-6）。其化合物 結構皆由光譜分析鑑定之。化合物之細胞毒殺試驗顯示對鼻咽癌細胞（KB）， 肝癌細胞 （Hepa-3B）具抑制作用，經三天生物活性測試，其ED50數據分別為 3.8和3.5 μg/ml。
O O H OH O C H3 O O OH OH CH3O O Taiwanhomoflavone-B 圖1-7 Taiwanhomoflavone-B結構 1.4.3 C-3-epi-wilsonione 西元2004年台灣高雄醫學大學王立文教授從台灣粗榧之葉子的氯仿萃取 物，分別用生物活性試驗分層中分離得到了一個新的homoerythrina alkaloid高 刺桐生物鹼，C-3-epi-wilsonione43（圖1-7）。其化合物結構皆由光譜分析鑑定 之。化合物之細胞毒殺試驗顯示對高加索人肝癌細胞（Hep-G2），乳腺癌細 胞（MCF-7），女性黑人肝癌細胞（Hep-3B），大腸癌細胞（HT-29）具抑制 作用，經六天生物活性測試，其IC50數據分別為52.0、42.0、52.0和24.0 μg/ml。 N O O CH3O CH3O CH3O H C-3-epi-wilsonion 圖1-8 C-3-epi-wilsonion 結構
1.5 研究動機與目的
台灣為一海島型國家，其中山脈佔了一半以上，最高之海拔超過三千公尺 以上，從低海拔至高海拔，包含廣大的生態系，亦含各種不同種類且豐富的植 物，這些植物是值得研究的題材。在民間傳統藥物療法已有數千年歷史，其用 藥來源皆來自物種豐富的植物，眾多的民間傳統藥物療法一直具有神奇的療 效，卻缺乏科學證據及研究，使多數人認為迷信或不值得信服，所以三、四十 年前，許多人都認為研究中草藥沒有前途，不如往主流的西醫、西藥發展，如 今在華人世界，已投入多年研究在中草藥的領域上，如台灣國立中國醫藥研究 所從一九九三年至一九九八年所發表的學術性論文就達287 篇，近五年間所發 表的論文更高達三百多篇，其中更有三分之二的論文被刊載於國際知名的學術 期刊上。 台灣粗榧係三尖杉科( Cephalotaxaceae )在台灣是屬於裸子植物，也是台灣 地區的特有種。依據文獻記載廣泛分布於中央山脈中至高海拔森林內，大多呈 單株散生，數量不多。在經濟利用上，據研究本屬植物之近緣植物其枝葉有抗 惡性腫瘤、治癌症之效，而深受植物學家的重視。中國大陸已進行天然藥物的 成分分析及藥理研究，從同屬植物的三尖杉( C. fortunei Hook. f. )分離出抗白血 病藥物三尖杉酯鹼及高三尖杉酸鹼，並正式將之收載入藥典之中(邱明華等 1997)。邱永年和張光雄(1992)亦指出台灣粗榧的生物鹼，對於慢性白血病及淋 巴瘤有明顯之療效。從開發國內藥用植物資源而言，對台灣特產且唯一的三尖 杉科植物台灣粗榧進行資源調查及研究，自是深具意義的。又本植物因生育地 減少、園藝栽培及藥用目的被濫採引起生存危機，而被列為稀有之森林植物。屬三尖杉科的台灣粗榧，為台灣特有種之植物，但在研究上極為缺乏，目 前只三篇論文被發表（如1.3台灣粗榧之研究文獻回顧所述），其中有五種成分
被 分 離 出 來 ， 分 別 為 Taiwanhomoflavone-A 、 Taiwanhomoflavone-B 、
Taiwanhomoflavone-C 、 C-epi-wilsonione 和 desmethylcephalotaxinone ， 當 中 Taiwanhomoflavone-A 、 Taiwanhomoflavone-B 及 C-epi-wilsonione 具 有 生 物 活 性，對細胞有抑制作用。 回顧台灣粗榧先前之研究，其成分之分離從乙醇或氯仿萃取開始，但同一 種植物所包含之成分不下千種，而具生物活性之成分更可能分佈於各個有機層 和不同極性溶液中，此等未知成分之探索，值得現今和未來所努力的目標，所 以本論文使用甲醇作為成分之分離萃取之開始，之後搭配不同極性的再分層， 並以液相層析系統作更進一步的分離，最後以癌細胞毒殺試驗作生物活性上的 鑑定，以期得到先前研究中所未探索到之化合物。
二、材料與方法
2.1 實驗材料
(1) 培養基和試劑
a. Fetal bovine serum (FBS) b. Dulbecco’s MEM (DMEM)
c. Resewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Medium
d. [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) e. Dimethyl sulfoxide (DMSO)
f. Phosphate-buffer saline (PBS) (2) 台灣粗榧樹葉之來源 此次實驗中台灣粗榧樹葉的採集，時間是在民國九十三年一月，地點是 在台灣南投縣集集鎮溪頭，採集葉子之溼重為4.6 公斤，並感謝由農委會特有 生物研究保育中心植物組李權裕先生辛苦採集。 (3) 癌細胞種類與來源
a. HeLa : Human cervical epitheloid carcinoma 來源：購自新竹食品工業研究所。
培養液：含有10% fetal bovine serum（FBS）的DMEM。
b. BEAS-2B：Human bronchial epithelial cell line 來源：購自新竹食品工業研究所。
培養液：含有10% fetal bovine serum（FBS）的RPMI 1640。
培養環境：含5% CO2，95% air，37℃ 之細胞培養箱中。
c. AGS：Human gastric carcinoma epithelial cell line 來源：購自新竹食品工業研究所。
培養液：含有10% fetal bovine serum（FBS）的RPMI 1640。
培養環境：含5% CO2，95% air，37℃ 之細胞培養箱中。
d. COLO-205：Human colon carcinoma 來源：購自新竹食品工業研究所。
培養液：含有10% fetal bovine serum（FBS）的RPMI 1640。
培養環境：含5% CO2，95% air，37℃ 之細胞培養箱中。
2.2 實驗儀器
A. 高效能液相層析儀 (High Performance Liquid Chromatography HPLC)： a. Agilent 1100 Series Quaternary pump
b. Agilent 1100 Series Diode Array and Multiple Wavelength
c. Column: Inertsil ODS-3 (7μm, 20 mm×250 mm)與Inertsil 7 ODS-3 (7 μm, 7.6 mm×250 mm)。
B 核磁共振儀 (NMR , Nuclei Magnetic Resonance)：600 MHz NMR C 電子撞擊式質譜儀 (EI-MS，Electron Impact-Mass Spectrophotometer)
2.3 分離方法簡述
將粗榧之葉子取下洗淨，得溼重4.6 公斤，每 300 克溼重之葉子以 1 公升 甲醇浸泡絞碎攪拌 24 小時後過濾，所得之甲醇層萃取液以減壓濃縮及冷凍乾 燥得甲醇萃取物。將甲醇萃取物置於水中攪拌 24 小時，可得水層萃取液及不 溶水層之甲醇萃取物，將水層萃取液冷凍乾燥得水層萃取物。將水層萃取物以 正丁醇充分攪拌溶解 24 小時，可得正丁醇層萃取液及不溶正丁醇層之水層萃 取物，將正丁醇層萃取液減壓濃縮得正丁醇層萃取物。甲醇萃取（15.5 公升） 甲醇萃取物（乾重416.32 公克） 一次水萃取（15.5 公升） 水層萃取物（乾重256.19 公克） 不溶水層之甲醇萃取物 不溶正丁醇層之水層萃取物 低溫冷凍乾燥 台灣粗榧樹葉（溼重4.6 公斤） 低溫冷凍乾燥 低溫冷凍乾燥 正丁醇萃取物（乾重31.72 公克） HPLC & MTT assay MTT assay MTT assay 圖2-1 粗榧葉有機層萃取流程圖 正丁醇萃取（15.5 公升） 接下來以HPLC 進一步做分離的動作，以期得到準確的分離效果，並在 每一層的各個部份，以MTT assay 確定生物活性，再進一步細分混合物。
正丁醇萃取物（乾重31.72 公克）
Fraction I Fraction II Fraction III
Fraction III Fraction II
Fraction I Fraction IV
Fraction I Fraction II Fraction III Fraction IV Fraction V
Fraction I Fraction II Fraction III Fraction IV Fraction V Fraction VI
圖 2-2 粗榧葉 HPLC 分析流程圖
Compound （17 mg）
2.4 癌細胞毒殺活性檢測（MTT assay）
(1) 癌細活性測試原理
本實驗利用colorimetric MTT assay2 之方法來評估檢品之細胞生物活性作
用。其原理為：活細胞的粒線體（mitochondria）含有各種的脫氫酶酵素 （dehydrogenase），以脫氫酶酵素活性的測量來反映細胞的生長狀況，利用 MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetra zolium bromide] 加入後使
活 細 胞 破 裂 ， 釋 出 粒 線 體 內 之 脫 氫 酶 酵 素 ， 造 成 切 斷 MTT 之 重 氮 環 (tetrazolium ring)。此時，顏色會由原有的淡黃色液體轉為暗藍色的甲臢 （formazan）結晶，而死細胞中的粒線體不具活化的脫氫酶酵素，無法反應產 生甲臢結晶，仍維持淡黃色。MTT 在加入經數天培養的細胞培養液中與細胞 中的脫氫酶作用四小時後，可產生與脫氫酶酵素活性總量成比例的甲臢結晶沉 澱，將培養液倒除，以DMSO 溶解甲臢結晶，利用酵素免疫分析儀 （ELISA reader） 讀取波長570 nm 之吸光值（optical density：O.D.）。將所得實驗組 數據除以控制組，以同一樣品在不同濃度下所得之百分比與濃度的對數值作線 性迴歸分析，推算在百分比為 50% 時的濃度值，作為樣品對癌細胞之生物活
性指標，此即ED50 （Effective dose 50%）。
N S N N N N N N S N N N NH2 MTT Fomazan deHase
(2) 實驗流程 將細胞置入培養液中 72 小時 將細胞均勻置入96-well 中 內含starvation medium 200 μL / well 24 小時 細胞附著於盤底 移除starvation medium 加入full medium 180μL / well 加入 樣品 20 μL / well 受測細胞 Full medium 受測樣品 68 小時 以ELISA reader 偵 測前四小時，加入 MTT 試劑呈色 加入MTT 試劑 後四個小時， 將培養液移 除，於每一孔 中加入DMSO 以波長570 nm 偵測 圖2-3 MTT assay2流程圖
(3) 樣品濃度： 秤取約2.0 mg 樣品以100 % DMSO 溶解成 5 mg/mL，再以DMSO 作序列 稀釋成5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 mg/mL ，使用Full medium 稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125μg/mL（此時在Full medium 含1％ DMSO）。 (4)實驗方法： 當癌細胞長至培養瓶單層長滿時，以2 ml的trypsin於37 ℃恆溫箱中作用 2~3分鐘，分離出癌細胞，經染色劑[trypan blue solution (0.4 %)]染色並至於顯
微鏡下計數細胞數目，將細胞濃度配置成3 × 103 cells/well 置入96 孔培養盤
(culture plate)中(此時細胞液為180 µl/well)，經過4~5小時後加入不同濃度的樣 品。經72小時的培養後，加入MTT 20 µl (1 mg/mL)，於5 %二氧化碳，37 ℃恆 溫培養箱中培養四個小時，去除所有液體，再加入200 mL 的DMSO，溶解 formazan 結晶於震盪機振10分鐘。以酵素免疫分析儀(ELISA reader)於波長570
nm下，測定其光學活性(O.D.)，並利用O.D.值計算ED50值。
(5) 細胞毒性評估
Crude extract：ED50 ≤ 20 μg/mL，則視為有效。
Pure compound：ED50 ≤ 4 μg/mL，則視為有效。
以上是根據NCI (National Cancer Institute)之準則
ED50(50 % inhibition concentration)代表藥物能抑制50 %癌細胞生長的
2.5 天然物分離實驗流程
實驗之初，有香杉、油杉、粗榧三種植物，將三種植物之樹葉及嫩枝部份 取下洗淨，分別絞碎，用甲醇浸泡萃取 24 小時後，再經過濾和減壓濃縮，取 得香杉、油杉、粗榧三種植物之甲醇萃取物，對HeLa cell 進行四重複的 MTT assay。 於香杉，油杉和粗榧之樹葉及嫩枝等六種固狀萃取物中，各取 50mg 溶於1mL DMEM 中，做超音波震盪後，經 0.2μm membrane 過濾，作為 MTT assay 之藥劑。HeLa 在內有 full medium（90% DMEM，10% FBS，1% PS）培養盤
中培養72 小時。之後將 HeLa cell 分裝兩離心管並離心，其中一管分裝在培養
基中繼續培養(含 90% DMEM，10% FBS，1% PS)，另一管分裝在內含 starvation medium（0.04% FBS，99.6% DMEM）之 96 孔培養盤中，培養 12 小時使 HeLa
附著於96 孔培養盤底部。抽去 96 孔培養盤中的 starvation medium，加入 180μl 培養液( 90% DMEM，10% FBS，1% PS)於每個盤孔中，加入已製備好之藥劑 20μl / well，培養 72h 後做 MTT assay（前 4~8h 加入 MTT），測吸光值。 在香杉、油杉和粗榧之葉樹及嫩枝中，以粗榧樹葉對HeLa cell 之生長具 有較強的抑制作用，換言之，粗榧樹葉在甲醇層中含有對HeLa cell 抑制生長 之成分，又因甲醇萃取物必須事先溶於full medium 中後過濾，更可進一步推 測粗榧樹葉之甲醇萃取物在水層中含有對HeLa cell 抑制生長的成分，故可將 甲醇萃取物溶於一次水中攪拌 24 小時後過濾，可得水層萃取液和不溶水層之 甲醇萃取物，取得之水層萃取液置－80℃冷凍後，進行冷凍乾燥，得水層萃取 物。
將水層萃取物溶於正丁醇中後過濾，可得正丁醇層萃取液和不溶於正丁醇 層之水層萃取物，取得之正丁醇層萃取液減壓濃縮，得正丁醇層萃取物。將正
丁醇層萃取物和不溶於正丁醇層之水層萃取物對 HeLa cell 做四重複 MTT
assay。
將正丁醇層萃取物（A drug）和不溶正丁醇層之水層萃取物（B drug）分
別溶於 DMEM 中，做超音波震盪後，經 0.2 μm 孔徑的濾膜過濾，系列稀釋
配製成20、10、5.0、2.5、1.25 mg/ml 之濃度，做為測 MTT assay 之藥劑。HeLa
在內有full medium（90% DMEM, 10% FBS, 1% PS）之培養皿中培養 72 小時。
將HeLa cell 分裝兩離心管並離心，兩管分裝在兩個培養盤中，皆含 starvation
medium（0.04% FBS，99.6% DMEM），培養 12 小時使 HeLa 附著於培養盤底 部。抽去培養盤中的 starvation medium，加入 180 μl 培養液( 90% DMEM， 10% FBS，1% PS)於培養盤每個孔中，加入已製備好之 20 μl 藥劑，培養 72 小時後做 MTT assay（前 4~8 小時加入 MTT），測吸光值。
經實驗測試，正丁醇萃取物對HeLa cell 之生長具有較強的抑制作用，在
此 ，接著以 HPLC 分離正丁醇層中的成分。
在 HPLC 的分析條件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流動相，此兩種
溶劑皆含有0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第
零分鐘至第七分鐘以 80% 二次蒸餾水和 20% 乙腈混合，第七分鐘至第十二
分鐘由 80% 二次蒸餾水和 20%乙腈呈線性改變為 60% 二次蒸餾水和 40%
乙腈，第十二分鐘至第十七分鐘維持在 60% 二次蒸餾水和 40% 乙腈，，第 十七分鐘至第二十二分鐘由 60% 二次蒸餾水和 40% 乙腈呈線性改變為 0%
二次蒸餾水和 100% 乙腈，第二十二分鐘至第二十五分鐘維持在 0% 二次蒸 餾水和 100% 乙腈，第二十五分鐘至第二十八分鐘由 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈呈線性改變為 100% 二次蒸餾水和 0% 乙腈。（圖 2-4） 圖2-4 第一層 HPLC 移動相比例示意圖 第一層 HPLC 分析圖共分為三個時間區域收集（第零分鐘至第八分三十 秒為第一個時間區域；第八分三十秒至第十三分鐘為第二個時間區域；第十三 分鐘至第二十八分鐘為第三個時間區域），再將此三個時間區域所收集之樣品 做MTT assay。第二個時間區域和第三個時間區域較具生物活性，決定由第二 個時間區域之樣品作進一步的 HPLC 分析。在 HPLC 的分析條件中，以二次 蒸 餾 水 和 乙 腈 搭 配 做 為 流 動 相 ， 此 兩 種 溶 劑 皆 含 有 0.1% 三 氟 乙 酸
（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第零分鐘至第十五分鐘以 58% 二次蒸餾水和 42% 乙腈混合，第十五分鐘至第二十分鐘由 58% 二次蒸 餾水和 42% 乙腈呈線性改變為 0% 二次蒸餾水和 100%乙腈，第二十分鐘至 第二十五分鐘維持在 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈，，第二十五分鐘至第二 十八分鐘由 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈呈線性改變為 100% 二次蒸餾水
圖2-5 第二層 HPLC 移動相比例示意圖 第二層 HPLC 分析圖共分為四個時間區域收集（第三分鐘至第五分三十 秒為第一個時間區域；第五分三十秒至第十五分鐘為第二個時間區域；第十五 分鐘至第二十分鐘為第三個時間區域；第二十分鐘至第二十八分鐘為第五個時 間區域），再將此四個時間區域所收集之樣品做MTT assay。 實驗結果得知以第二個時間區域和第三個時間區域之樣品具生物活性， 決定以第二個時間區域作進一步 HPLC 分析，將之細分。在 HPLC 的分析條 件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流動相，此兩種溶劑皆含有 0.1%三氟乙
酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第零分鐘至第二十六分鐘 以 62% 二次蒸餾水和 38% 乙腈混合。 第三層HPLC 分析圖共分為五個區域收集（第三分鐘至第五分三十秒為第 一個時間區域；第五分三十秒至第十一分三十秒為第二個時間區域；第十一分 三十秒至第十四分鐘為第三個時間區域；第十四分鐘至第二十二分鐘為第四個 時間區域；第二十二分鐘至第二十四分鐘為第五個時間區域），再將此五個時 間區域所收集之樣品做MTT assay。經實驗結果顯示，第二個時間區域和第三 個時間區域兩者具有生物活性，決定用HPLC 對第二個時間區域所收集之樣品
作分析，將之細分。在HPLC 的分析條件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流
動相，此兩種溶劑皆含有0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相
搭配方式為第零分鐘至第二十六分鐘以 62% 二次蒸餾水和 38% 乙腈混合。 第四層HPLC 分析圖共分為六個區域收集（第四分鐘至第八分鐘為第一個 時間區域；第八分鐘至第十二分三十秒為第二個時間區域；第十二分三十秒至 第十五分鐘為第三個時間區域；第十五分鐘至第十七分鐘為第四個時間區域； 第十七分鐘至第二十二分鐘為第五個時間區域；第十五分鐘至第二十六分鐘為 第六個時間區域），再將此六個時間區域所收集之樣品做 MTT assay。經實驗 結果顯示，第五個時間區域和第六個時間區域之樣品具有較強生物活性。決定 以生物活性最強之第六個時間區域以 HPLC 作進一步的分析。在 HPLC 的分 析條件中，以二次蒸餾水和乙腈搭配做為流動相，此兩種溶劑皆含有 0.1%三
氟乙酸（trifluoroacetic acid ；TFA），流動相搭配方式為第零分鐘至第三十二 分鐘以 80% 二次蒸餾水和 20% 乙腈混合，第三十二分鐘至五十二分鐘由 80% 二次蒸餾水和 20% 乙腈呈線性改變為 0% 二次蒸餾水和 100% 乙
腈，第五十二分鐘至第五十七分鐘維持在 0% 二次蒸餾水和 100% 乙腈。（圖
2-6）
第五層HPLC 分析圖共分為兩部份收集（第四十八分三十秒至第四十九分
鐘為單一峰收為一部分，其餘收為另一部分），再將此兩部份做 MTT assay。
經實驗顯示，單一的部份有較高的生物活性，另一部份則無，到此，單一生物 活性成分已被分離出來。
三、結果與討論
3.1 有機層分析
3.1.1 植物之篩選 0 20 40 60 80 100 120 香 杉 葉 香 杉 枝 油 杉 葉 油 杉 枝 粗 榧 葉 粗 榧 枝 50m g/m l m ethanol extract T h e ra te o f H eL a' s sur vi ve (% ) 0 20 40 60 80 100 120 香 杉 葉 香 杉 枝 油 杉 葉 油 杉 枝 粗 榧 葉 粗 榧 枝 50m g/m l m ethanol extract T h e ra te o f H eL a' s sur vi ve (% ) 圖3-1 香杉、油杉和粗榧之樹葉及嫩枝的 MTT assay 比較 由香杉、油杉和粗榧三種植物的樹葉和嫩枝以甲醇萃取所得之萃取物對 HeLa cell 作一初步的生物活性篩選，根據圖 3-1 結果得知，生物活性由強至弱 依序為粗榧葉、粗榧枝、油杉葉、油杉枝、香杉葉、香杉枝。 3.1.2 有機層之分析 將粗榧葉甲醇萃取物先經水層之萃取，再將水層萃取物以正丁醇做萃取並以MTT assay 確認生物活性。 圖 3-2-1 不溶於正丁醇萃取物之 MTT assay 0 50 100 150 0.13 0.25 0.5 1 2
mg/ml (insoluble butanol extract)
T he r at e o f H eL a' s sur vi ve (% ) 圖3-2-2 溶於正丁醇萃取物之 MTT assay 0 20 40 60 80 100 120 0.13 0.25 0.5 1 2 mg/ml(butanol extract) T he ra te o f H eL a' s su rv iv e (% ) 經圖3-2-1、圖 3-2-2 及表 3-1 之觀察，以溶於正丁醇萃取物生物活性較強， 所以以正丁醇萃取物來作進一步的分析測試。
3.2 HPLC 分析
3.2.1 第一層 HPLC 分析 M inutes 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 mA U 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 mA U 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 min 0 --- 7 --- 12 --- 17 --- 22 --- 25 --- 28 ddH2O (0.1% TFA) 80% 80% 60% 60% 0% 0% 100% CH3CN (0.1% TFA) 20% 20% 40% 40% 100% 100% 0% 管柱：ODS-3 4.6*250nm 注入的樣品量：750uL 流速：10mL/min 偵測波長：225nmFraction I Fraction II Fraction III
圖3-3 正丁醇萃取物之 HPLC 分析
第一層 HPLC 分析圖中，將收集三個時間區域的樣品以 MTT assay 分析對 HeLa cell 來確認其生物活性。
0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 7 .8 1 1 5 .6 3 1 .3 6 2 .5 1 2 5 2 5 0 5 0 0 μ g /m l（ fra c tio n I) T he r at e of H eL a' s sur vi ve (% ) 圖3-4-1 由圖 3-3 中 HPLC 分析收得第一個時間區域樣品之 MTT assay 0 5 0 1 0 0 1 5 0 7 .8 1 1 5 .6 3 1 .3 6 2 .5 1 2 5 2 5 0 5 0 0 μ g /m l（ fractio n II） T he ra te o f H eL a' s su rv iv e (% ) 圖3-4-2 由圖 3-3 中 HPLC 分析收得第二個時間區域樣品之 MTT assay 0 5 0 1 0 0 1 5 0 7 .8 1 1 5 .6 3 1 .3 6 2 .5 1 2 5 2 5 0 5 0 0 μ g /m l（ fra c tio n III）
T he ra te o f H eL a' s su rv iv e (% ) 圖3-4-3 由圖 3-3 中 HPLC 分析收得第三個時間區域樣品之 MTT assay
由圖 3-4-1、圖 3-4-2、圖 3-4-3 及表 3-2 來比較，以第二個時間區域和第 三個時間區域的樣品生物活性較強，在配合圖3-3 的觀察，第二個時間區域所 含成分較為複雜，推測當中所含單一成分的生物活性應較強，故在此以第一層 HPLC 分析中的第二個時間區域作為研究方向，將之繼續細分。 3.2.2 第二層 HPLC 分析 min 0 5 10 15 20 25 mAU 0 500 1000 1500 2000
DAD1 A, Sig=225,8 Ref=off (0902\BUTFR2T1.D)
min 0 ---> 15 ---> 20 ---> 25 ---> 28 CH3CN (0.1% TFA) 42% 42% 100% 100% 0% ddH2O (0.1% TFA) 58% 58% 0% 0% 100% 管柱：ODS-3 20*250nm 注入的樣品量：750uL 流速：10mL/min 偵測波長：225nm 流速：10mL/min 偵測波長：225nm Fraction I Fraction II Fraction III Fraction IV 圖 3-5 正丁醇萃取物之第二層 HPLC 分析
第二層HPLC 分析圖中，將收集四個時間區域的樣品以 MTT assay 分析對 HeLa cell 來確認其生物活性。 圖3-6-1 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得第一個時間區域樣 品之MTT assay 0 50 100 150 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 μ g/m l（ fraction I） T he r at e o f H eL a' s sur vi ve (% ) 圖3-6-2 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得第二個時間區域樣 品之MTT assay 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 3 .1 3 6 .2 5 1 2 .5 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0
μ g /m l（ fra c tio n II）
T he ra te o f H eL a' s su rv iv e (% )
圖3-6-3 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得第三個時間區域樣 品之MTT assay 0 50 1 0 0 1 5 0 3 .1 3 6 .2 5 1 2 .5 2 5 5 0 1 0 0 20 0 μ g/m l（ fractio n III） Th e ra te o f H eLa 's s ur v iv e (% ) 圖3-6-4 由圖 3-5 中正丁醇第二層 HPLC 分析收得第四個時間區域樣 品之MTT assay 0 50 100 150 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 μ g/m l（ fraction II） T he r at e o f H eL a' s sur vi ve (% ) 在圖3-6-1~3-6-4 中，以第二個時間區域和第三個時間區域樣品具生物活 性，但以HPLC 分析圖中來觀察判斷，第二個時間區域樣品中含有較多的混合
物，當中可能含有較毒的單一成分，故在此判斷，以第二個時間區域樣品作 HPLC 分析，將之細分。 3.2.3 第三層 HPLC 分析 min 0 5 10 15 20 25 mAU 0 500 1000 1500
DAD1 A, Sig=225,4 Ref=off (060315\BF2II007.D)
min 0 ---> 26 CH3CN (0.1% TFA) 38% 38% ddH2O (0.1% TFA) 62% 62% 管柱：ODS-3 20*250nm 注入量：500uL 流速：10mL/min 偵測波長：225nm Fraction I Fraction
II Fraction III Fraction IV Fraction V
圖 3-7 正丁醇萃取物之第三層 HPLC 分析
第三層HPLC 分析圖中，將收集五個區域的樣品以 MTT assay 分析對 HeLa
圖3-8-1 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得第一個時間區域樣 品之MTT assay 0 50 100 150 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 μg/ml（fraction I） T he r at e o f H eL a' s sur vi ve (% ) 圖3-8-2 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得第二個時間區域樣 品之MTT assay 0 20 40 60 80 100 120 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 μg/ml（fraction II） T h e ra te o f H eL a' s s ur v iv e (% )
圖3-8-3 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得第三個時間區域樣 品之MTT assay 0 20 40 60 80 100 120 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 μ g/ml（ fraction III） T h e ra te o f H eL a' s s ur v iv e (% ) 圖3-8-4 由圖 3-7 中正丁醇第三層 HPLC 分析收得第四個時間區域樣 品之MTT assay 0 50 1 00 1 50 0 .7 8 1.5 6 3 .13 6.2 5 12 .5 25 5 0 μ g/m l（ fraction IV ） T he ra te o f H eL a' s su rv iv e (% )
