結論與未來展望

本論文中，我們成功的利用二倍頻顯微影像技術，在活體的斑馬魚上精確的 量測到斑馬魚肌小節長度，也觀察到活體斑馬魚肌小節長度隨著時間的變化而有 所改變，也利用了 statin 藥物浸泡在斑馬魚環境當中，首次發現到在橫紋肌溶 解症跟細胞壞死之前，肌小節長度變短的情形，以非染色、無破壞性的的方法得 到 statin 藥物肌小節變短的趨勢。

由實驗發現在受精後 24 小時後，頭部 (5

-

8 體節) 及尾部 (21

-

24 體節) 肌小節長度分別為 1.93 ± 0.06 及 0.99 ± 0.17 μm，說明了靠近尾巴體節是肌肉 新生成的地方。我們更進一步的量測尾巴體節肌小節長度隨著時間的變化，而在 受精後兩天，頭部跟尾部肌小節已經發育完成至約 1.87 ± 0.05 及 1.91 ± 0.07 μm。這是首次應用在斑馬魚活體實驗觀察到此情形。我們應用二倍頻成像發現 在斑馬魚飼養環境加入 lovastatin，隨浸泡濃度增加，斑馬魚肌小節長度會從 1.90 ± 0.12 μm 縮短至 1.53 ± 0.09 μm；而相同濃度時，隨浸泡時間增加，肌小 節的長度也從 1.90 ± 0.12 μm 縮短到 1.39 ± 0.05 μm。我們的結果顯示肌小節長 度縮短一部份原因來自於肌小節中的 myosin rod 受到破壞。此為現有文獻提出 之另一原因：為鈣離子濃度上升，造成肌肉收縮或是肌小節中其他蛋白質受到破 壞，進而影響肌小節縮短。我們的成果顯示二倍頻顯微影像系統無須染色跟樣品 前處理，便可對斑馬魚幼魚進行即時、活體檢測，也展現斑馬魚配合光學成像技 術應用於藥物開發先期研究以及環境毒害評估之潛力。

透過二倍頻技術分析肌小節長度的能力以及細胞層次的高解析度，未來能應 用在降血脂藥所引起的肌肉毒性副作用一種偵測工具，從肌小節的長度可以判斷 肌肉受損的程度如何，未來也能爲 statin 的治療方法與新藥的開發這兩方面帶 來幫助。

附錄

附錄一 肌肉簡介

在人體的肌肉有分為三種：

1. 心肌 – 是一種在心臟及近心大血管壁中的特殊肌肉。

2. 骨骼肌 – 也稱為橫紋肌或隨意肌，是通過肌腱固定到在骨骼上，其伸縮可以 帶動骨骼的的移動。

3. 平滑肌 – 或是非自主肌肉，見於小腸，喉嚨和血管等器官。

骨骼肌是能收縮的人體組織，由胚胎的中胚層發育而來。肌肉大部分的收縮不由 意識控制，例如心臟的收縮或是腸胃道的蠕動，這對生命的維持非常重要。自主 的收縮用來移動身體，例如眼睛的精細運動或大腿的粗運動。自主的肌肉運動纖 維分成快慢兩種，慢速收縮的纖維力量較小，快速收縮的纖維力量較大，也比較 容 易 疲 勞 。 肌 肉 細 胞 於 肌 內 膜 (endomysium) 內 排 列 成 行 並 由 肌 束 膜 (perimysium) 捆綁在一起形成肌束 (fasciculus)，這些束聚集在一起由肌外膜 (epimysium) 包覆形成肌肉。肌組織主要由具有收縮功能的肌細胞組成，肌細胞 細 長 呈 纖 維 狀 ， 故 又 稱 肌 纖 維 (muscle fiber) ， 肌 細 胞 的 細 胞 膜 ， 稱 肌 膜 (sarcolemma)，細胞質稱肌質 (sarcoplasm)，細胞內的滑面內質網，稱肌質網 (sarcoplasmic reticulum)，緊密圍繞著每一條肌原纖維。

myofibril

Sarcolemma

Transverse tubular

Sarcoplasmic reticulum

mitochondrion myofibril

Sarcolemma

Transverse tubular

Sarcoplasmic reticulum

mitochondrion

幾個甚至數百個扁橢圓形的細胞核，位於肌膜下方，肌質中含有與肌纖維長軸平 行的肌原纖維 (myofibril)，其間有大量的線粒體及少量脂肪，每條肌原纖維由 1500 條粗絲 (thick filament) 和 3000 條細絲 (thin filament) 組成，兩種肌絲有 規律地相間平行排列，這兩者皆是大分子的蛋白質，負責肌肉的收縮。

粗絲 (thick filament) 長約 1.5 μm，直徑約 15 nm，位於肌節中段的 A 帶 內，固定於 M 線。細絲 (thin filament) 長約 1 μm，直徑約 5 nm,其一端固定在 Z 線，另一段插於粗絲之間，止於 H 帶外側。每條肌原纖維上都有明暗相間的 帶，明帶 (light band)，又稱 I 帶，其中央有一條較深染的細線，稱 Z 線。暗帶 (dark band)，又稱 A 帶，其中央有一窄帶，稱 H 帶。H 帶的中央還有一條線, 稱 M 線。相鄰的兩條 Z 線之間的一段肌原纖維，就稱為肌小節 (sarcomere)，

一個完整的肌小節由 1/2 明帶+ 1 個暗帶 + 1/2 明帶組成。為肌原纖維的基本 結構和功能單位。

Z disk

myosin

H band

A band actin

I band

M-line Titin

Z disk

myosin

H band

A band actin

I band

M-line Titin

肌動蛋白絲 (actin filament) 由肌動蛋白 (actin)，原肌球蛋白 (tropomyosin) 和 肌鈣蛋白 (troponin) 組成。actin 分子單體呈球形，並有與 myosin head 結合 的位點，許多 actin 單體相互連接，形成兩條有極性的互相纏繞的螺旋鏈，

tropomyosin 呈條索狀。由兩條多肽鏈絞合而成，並嵌於 actin 分子螺旋鏈溝的 側壁上，並覆蓋著 myosin head 結合的點。Troponin 由 3 個亞單位 (troponin I、

troponin T、troponin C) 組成,其中 troponin C 能與鈣離子結合，而讓 actin filament

Ca ⁺²

Myosin binding site

Actin filament Troponin

Ca ⁺²

Myosin binding site

Actin filament Troponin

肌球蛋白絲 (myosin filament) 由 myosin 分子組成，myosin 分子形如豆 芽，頭部形似兩個豆瓣，桿部細長如豆莖，兩者之間的連接部分可以屈動。Myosin 的桿部均朝向粗肌絲的中央排列，頭部朝向兩端排列。Myosin 的頭部向外伸出，

稱橫橋 (cross bridge)，橫橋是一種 ATP (adenosine triphosphate) 酶，能結合和分 解 ATP，產生能量，並由此發生自身的向 M 線方向的扭動。而肌肉收縮過程 是由 myosin 結合 ATP，引起頭部與 actin filament 分離；ATP 水解，引起頭部 與 actin 變成弱結合；Pi 釋放，頭部與 actin 變成強結合，頭部向 M 線方向彎 曲，引起 actin filament 向 M 線移動，ADP 釋放新的 ATP 結合上去，頭部與 actin filament 分離，一直重複循環。

ADP

Phosphate

ATP

ADP

Phosphate

ATP

附錄二 二倍頻原理簡介

自從雷射在 1960 年被發明後，藉由雷射的高強度發現了非線性光學的現 象。在 1961 年 Franken 首先發現，利用紅寶石雷射照射在石英晶體上產生倍 頻光。

光學的極化現像起因於光產生的電場與材料進行偶極-偶極交互作用。當一 個電場通過一個線性介質藉由電場產生的極化向量 (polarization) 可以寫成

P = ε

0

χE (1) 其中 ε 是指介質之線性磁化率，而 χ 是真空中的介電常數。當電場強度夠大時，

其非線性效應可將 χ 展開成

χ = χ

1

+ χ

2

Ε + χ

3

Ε

²

+... (2) 將 (2) 代入 (1) 可得

P = ε

0

χ

1

Ε + ε

0

χ

2

Ε

²

+ ε

0

χ

3

Ε

³

+ … (3) 其 χ

2

、χ

3

為二階跟三階非線性光學磁化率。

第一項為線性部分，其極化向量正比於電場強度，傳統光學的現象如：反射 (reflection)、折射 (refraction)，從第二項開始為非線性部分，其高階項的係數之 數量級太小，χ

2

約為 5 X 10

^-8

esu.、χ

3

約為 3 X 10

^-15

esu.，所以非線性的現象要 顯現出來必須在強大的電場強度中才可以使得高階非線性部分顯現出來。在產生 二階非線性效應必須在樣品缺乏反轉對稱 (i) 下才能產生如：二倍頻，帕克爾效 應 (Pockels effect)、光參數放大 (optical parametric amplification)。

而三階非線性效應為：三倍頻

³³

(third harmonic generation)，同調反史托克拉曼

26

(four wave mixing) 等。

二倍頻光學影像維和頻訊號的一種例子，在產生二倍頻訊號時，訊號波長為 入射光源的一半。當入射的兩個光子與晶體的相位匹配，會將原本的兩個光子能 量以一個光子的型態放出，使電子回到基態，因此產生一個兩倍光子頻率的放射 光。

從式子 (3) 可以說明到要產生二倍頻樣品必須要缺乏反轉對稱，因為 P 跟 E 都是向量所以當樣品具有中心對稱時式子就會變成

P = χ

2

E

²

變成 –P = χ

2

(–E) (–E)

當式子要成立時只有 χ

2

這個項次 = 0，代表的是當樣品有中心對稱時，就不會 有二倍頻的訊號產生。

二倍頻原理可由非線性二次項 P = ε

0

χ

2

Ε

²

來解釋，假設頻率為 ω 雷射光入 射到非線性晶體，其電場為

E(t) = Ecosωt 代入（3）式中

P

2

(t) = ε

0

χ

2

E

²

cos

²

ωt = 1/2 ε

0

χ

2

E

²

(1+cos2ωt) P

2

(t) =1/2 ε

0

χ

2

E

²

+ 1/2 ε

0

χ

2

E

²

cos2ωt 由上述的 1/2 ε

0

χ

2

E

²

cos2ωt 項代表有二倍頻的項次。

χ

2

為二階非線性磁化率，大小取決於每個分子的特性，式子如下

χ

2

= N

S

(β)

N

S

為分子的密度，β 為分子的極化率，當有中心對稱的時候，β 就會 = 0，而使 得二倍頻沒有訊號。

二倍頻的強度，其式子如下

I (2ω) 正比於 (χ

2

P/τ)

²

τ (4) 從式子 (4) 可以看到非先性光學二次項的大小取決於 β 的大小，進而影響到二 倍頻效率的大小，β 的式子如下

2 ge ge ge

3 2 2 2 2

ge ge

= 3

2 - -4

e ω f μ

β ω ω ω ω

Δ

⎡ ⎤ ⎡ ⎤

⎣ ⎦ ⎣ ⎦

h

式子中的定義：e 為電子電荷，ω

ge

為基態跟激發態的電子能階差，f

ge

為振動子 強度（又為吸收光譜的積分），△μ

ge

為基態到激發態所改變的偶極距。

才能有效率地產生訊號，因此，二倍頻顯微技術具有三維顯像的能力，另外要產 生二倍頻訊號樣品必須要有非中心對稱的結構，所以化學專一性高。

附錄三 專有名詞中英對照表

中文 英文

肌球蛋白 Myosin

肌動蛋白 Actin

粗絲 Thick filament, myosin filament 細絲 Thin filament, actin filament

肌鈣蛋白 Troponin C

肌小節 Sarcomere

肌原纖維 Myofibril

肌管 Myotube

原肌球蛋白 Tropomyosin

膠原蛋白 Collagen

肌纖維 Myofiber

肌質網 Sarcoplasmic reticulum

肌外膜 Epimysium

肌束膜 Perimysium

肌內膜 Endomysium

附錄四 實驗相關儀器列表

no. 名稱 說明 製造商

1 皮秒雷射 Laser (Nd:Vanadate solid state picosec laser, 1064 nm, 7 ps)

High Q Laser, Austria 2 倒立式顯微

鏡

Optical inverted microscope (ECLIPSE

Ti) Nikon, Japan 3 鎖相放大器 Lock-in amplifier (SR850) Stanford Reaserch

Systems, USA 4 光電倍增管 Photomultiplier Tube (H7422-40, 300 ~

720 nm, voltage output) Hamamatsu, Japan 5 三軸移動平

台

Piezo stage (P-563.3CD, scan range: 300 X 300 X 300 μm)

Physik Instrumente,

Germany 6 光學遮斷器 Chopper (SR540, chopping frequency:

400 Hz ~ 3.7 kHz)

Stanford Reaserch Systems, USA 7 紅外光觀測

儀 IR-viewer (85100A Find-R-Scope) FJW optical system, USA

8 訊號擷取卡 Data acquisition board (PCI-6221, max output rate: 250 kS/s)

National Instruments, USA

9 Analog camera

Charge coupled device (WAT-902H,

monochrome, super high sensitivity) Watec, USA

附錄五 實驗相關藥品及養魚設備列表

no. 名稱 說明 供應商

1 麻醉劑 Tricaine, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt

Sigma Aldrich

2 降血脂藥 Lovastatin Sigma

Aldrich 3 去色素水 PTU, Phenylthiourea Sigma

Aldrich

4 魚缸器材 魚缸、加熱棒、外掛 鄰近水族館

5 斑馬魚 AB strain 品種 邰港科技

附錄六 2009 交通大學碩士班論文獎張貼海報

國立交通大學 國立交通大學 廖奕翰實驗室 廖奕翰實驗室

In vivo

Imaging of Larval Zebrafish with Second-Harmonic Generation Microscopy

Abstract Abstract

Shih-Hao Huang (黃士豪) and Ian Liau (廖奕翰)*

Department of Applied Chemistry and Institute of Molecular Science, National Chiao Tung University, Hsinchu, Taiwan

Background 實驗室自行開發之「多模式多光子顯微影像系統 (multimodality, multiphoton microscopy)」對斑馬魚進行即時、高解析、非侵入式之活體光學成像研究。我們 成功應用二倍頻成像 (second-harmonic generation imaging) 精確量測出斑馬魚胚胎發育初期肌小節 (sarcomere) 長度隨發育時間之變化。我們的結果顯示在受精 後 24 小時，斑馬魚胚胎之頭部及尾部肌小節長度分別為 1.9 及 1.0 μm；而在受精後 48 小時，其頭部及尾部之肌小節已經完成發育，長度均為 1.9 μm。此

Myofibrillogenesisof skeletal muscleof skeletal muscle

20 40 60 80 250 300

0.8 1.2 1.6 2.0

Sarcormere length / μm

Time / h

Representative SHG images and sarcomere length of zebrafish measured at different hours after fertilization. (head: the 5^th

~ 8^thsomite; tail: the 21^th– 24^thsomite)

Summary Summary

Toxicity of

Toxicity of statinstatinto the to the myofibrillogenesismyofibrillogenesisof skeletal muscles of skeletal muscles

Muscle toxicity of

Muscle toxicity of statinstatin: dependence of concentration and duration of treatment: dependence of concentration and duration of treatment

Mean length: 1.87 μm

0 2 4 6 8

Intensity / a.u.

Distance / μm

Control

0 2 4 6 8

100 150 200

Intensity / a.u.

Distance / μm Mean length: 1.50 μm

Statin (50 μM)

normal 0.05 0.5 50

1.4 1.6 1.8 2.0

Sarcomere length / μm

Concentration of statin /

μ

M

***

***

***

Zebrafish (3 dpf) was treated with statin of varied concentration and the measurement was made 12 h after the treatment.

(number of zebrafish: 3; the 5^th~ 8^thsomite; number of images analyzed: 21; *** P< 0.001).

1.4 1.6 1.8

50 μM 0.5 μM

Sarcomere length / μm

0.05 μM

*

***

***

Mean length: 1.40 μm Mean length: 1.50 μm

0 2 4 6

120 160 200

Intensity / a.u.

Distance / μm

Statin (50 μM, 12 h) Statin (50 μM, 120 h)

0 2 4 6

80 120 160

Intensity / a.u.

Distance / μm

• SHG microscopy has been demonstrated to visualize the sarcomere structure of living zebrafish without employing any stains.

• The myofibrillogenesisof the skeletal muscles has been followed.

• The treatment of statin caused a significant decrease of the sarcomere length. The reduction of the sarcomerewas attributed to the damage of myosin rods in sarcomere.

• Zebrafish has been widely used in the research of developmental biology and toxicology.

• The small-size and transparency of larval zebrafish makes it particularly suitable to be imaged with optical microscopy.

• Second-harmonic generation (SHG) microscopy allows label-free, non-invasive imaging of structure proteins in muscles.

• Satin has been found to cause muscle disorder and its mechanism remains elusive.

(A) Photomicrograph of zebrafish and an SHG image (8 dpf) showing the characteristic striated pattern of skeletal muscle.

(Excitation: 1064 nm; objective: 60X water objective; image size: 150 X 200 μm) (B) Schematic of sarcomere and a low-resolution SHG image of sarcomere. The SHG signal was attributed to the myosin rod (heavy chains) of the sarcomere.

Origin of SHG signal: heavy chains (myosin) of muscle fibers Origin of SHG signal: heavy chains (myosin) of muscle fibers Sample preparation

Sample preparation

Glass slide Grease Coverslip

Tricane

Toxicity of Toxicity of statinstatin

Statin The embryos of zebrafish (20 ~ 24 hpf) were immersed in embryonic water with varied concentration of statin (0.05 ~ 50 μM).

Apparatus

Dark length /μm

Control

***

Z disk ActinMyosin

Titin

Determination of fundamental elements of sarcomere from SHG imag Determination of fundamental elements of sarcomere from SHG imageses

0 2 4 6 8

80 120 160

Intensity / a.u.

Distance / μm Sarcomere

Intensity / a.u.

Distance / μm Sarcomere

Sarcomere length / μm

Single band NS

(A) A high-resolution SHG image (scan size: 50 X 50 μm) of muscle exhibiting both singlet and doublet structures of sarcomere.

(B) Cross-section views of single and double bands of sarcomere.

Fundamental elements (sarcomere length, FWHM of the singe band, bare length, dark length) of sarcomere determined from the cross-section of SHG images. (C) Schematic and a high-resolution SHG image showing fundamental elements of sarcomere. (D) Mean length of sarcomere determined from many single band and double bands of SHG images. The result shows that the determination of the sarcomere length from the single band and the double band yields to the same result. The statistics was calculated

Fundamental elements (sarcomere length, FWHM of the singe band, bare length, dark length) of sarcomere determined from the cross-section of SHG images. (C) Schematic and a high-resolution SHG image showing fundamental elements of sarcomere. (D) Mean length of sarcomere determined from many single band and double bands of SHG images. The result shows that the determination of the sarcomere length from the single band and the double band yields to the same result. The statistics was calculated

在文檔中 二倍頻成像及斑馬魚模型應用於「史達汀 (statin)」降血脂藥物造成骨骼肌傷害之研究 (頁 64-0)