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–1 降血脂藥物「史達汀 (statin)」造成肌肉傷害之副作用
由於現代人飲食過度，高脂肪食物的攝取量增加，運動量減少，血液中的脂 肪無法消耗而堆積於血液中，導致高血脂病症出現。高血脂正是引起心血管疾病 包括：心臟病、高血壓、中風、心肌梗塞…等的最大因素之一。降血脂藥物例如
「史達汀 (statin)」的使用，早已普遍應用在心血管疾病的預防上。statin 降低膽 固醇之作用機制為透過抑制 HMG-CoA 還原酶的作用降低肝臟中固醇 (包括膽 固醇) 的生成 (圖 1 – 1)。HMG-CoA 還原酶負責將 HMG-CoA 轉換成一種固醇 (包括膽固醇) 的前驅物質- mevalonate。因此 statin 可抑制肝臟中膽固醇之合 成，進而刺激肝細胞表面的低密度脂蛋白受體數目增加，促進低密度脂蛋白的擷 取及分解代謝並抑制低密度脂蛋白在肝臟的合成，最終達到減少血液中低密度脂 蛋白粒子的總數，降低高血脂的症狀。
降血脂藥物為目前全球使用最大量的處方籤藥物，由於高血脂人口持續增 加，且病人需要長期服物藥物，預期未來降血脂藥物之用量會持續的升高。降血 脂藥物的副作用中以肌肉毒性是最值得關注的副作用。降血脂藥物造成的肌肉病 變包含肌肉痠痛、肌肉浮腫，甚至是致命的肌肉橫紋肌溶解症。肌肉疼痛典型呈 現近側對稱性肌肉虛弱和疼痛，可能會有肌肉柔軟和功能上損傷，例如：難以將 手臂高舉過頭、從位置上站起，或爬樓梯等；不對稱的不舒服甚及橫紋肌溶解症 則較小發生。降血脂藥物中以 statin 造成肌肉毒性發生機率最高。肌肉症狀的 出現通常是在使用 statins 治療開始後的數星期到數個月發生，但也可能在治療 的任何期間發生。
有科學家利用染色結合光學或是電子顯微鏡的技術，觀察肌肉組織病變。1995 年 Adams
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利用 Hematoxylin-Eosin 針對肌肉浮腫的病人切片組織進行染色，發現 到 muscle fiber 的大小改變，血管周圍有發炎的現象，有大量的巨噬細胞分布在2
解症的病人切片組織進行染色，發現骨骼肌有大量的空泡的現象跟巨噬細胞的聚 集。也有科學家開始探討 statin 造成肌肉毒性的機制。1990 Manoukian
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提到一 位病人在使用 statin 藥物後引發橫紋肌溶解症，造成病人的肌肉無力，且血液 中的 creatine kinase 跟 myoglobin 的濃度均有上升。作者利用光學跟電子顯微 鏡，發現到在骨骼肌上有空泡的產生跟肌肉細胞被破壞的情況。1995 年 Lopez4
利用細胞內微米電極量測到橫紋肌溶解症發生時，鈣離子濃度有上升的趨勢。作 者使用了 dentrolene 藥物抑制鈣離子從肌質網流出，使鈣離子濃度從 1.27 μM 下降到 0.22 μM 後，也加速病人的回復。因此作者推斷橫紋肌溶解症與鈣離子 濃度的上升有關。2002 年 Hodel5
提出肌肉受到破壞的可能機制。作者提到當肌 肉纖維的原生質膜的完整性遭到破壞，可導致過多的鈣離子進入肌肉纖維，造成 過度收縮並破壞蛋白質合成和粒線體新陳代謝，進而導致肌肉細胞的死亡。2006 年 Velho6
量測從老鼠肝臟分離出來粒線體之膜電位。作者發現到在 statin 的藥 物下，粒線體的膜電位有改變的情形，老鼠骨骼肌粒線體也有相同的情形發生。作者同時發現隨 statin 的濃度上升粒腺體會有膨脹的現象。作者認為 statin 改 變鈣離子的濃度及粒線體膜的通透性，進而可能導致細胞損傷或死亡。同年 Dirks
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提出 statin 會導致粒線體穿透度改變使細胞凋亡。作者認為 statin 抑制 mevalonate 的 生 成 ， 讓 isoprenoid 耗 盡 ， 使 得 geranylgeranylation 或 farnesylation 蛋白質減少造上鈣離子濃度上升，活化 calpain，導致粒腺體中的 cytochrome c 流出，使細胞啟動凋亡機制。在 2007 年 Marcoff8
提到 statin 會 抑制 farnesyl pyrophosphate，為合成 coenzyme Q10 的中間產物。由於 coenzyme Q10 參與粒線體電子傳遞及對抗自由基造成之氧化壓力9
。因此，作者推測 statin 會影響粒線體的功能。在 2009 年 Littarru10
服用 statin 會降低 muscle coenzyme Q10 的濃度，進而降低粒線體的電子傳遞鏈之效率，而導致骨骼肌中粒線體的 數目減少導致肌肉毒性。由上面的文獻回顧可知，statin 造成肌肉毒性的機制仍未完全釐清。由於
討 statin 肌肉毒性的機制有所困難。此外，過去檢測肌肉病變的方法主要是量 測血液中的creatine kinase、myoglobin 跟 troponin 的濃度。這些方法比較沒有 專一性，這可能是造成到現在為止，statin 造成肌肉毒性不明確的原因之一。
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–2 斑馬魚動物模型
斑馬魚 (Zebrafish, Danio rerio) 產於東印度，為廣溫性魚類，與金魚、鯉魚 一樣屬於鯉科。成熟斑馬魚體長只有 3 至 4 公分，最長約 5 公分，體紋與真 正的斑馬相似，有藍白相間的條紋。斑馬魚的性別區分：母魚體型通常較大、腹 部較鼓脹，體色偏藍 (圖 1 – 2 a)，公魚體型較小、腹部較平坦，體色呈現淡黃 色 (圖 1 – 2 b)。在適當的環境下，斑馬魚在攝氏 24 度以上極易產卵，同時產 卵無季節性，可利用人為調控光週期使雌魚產卵。由於斑馬魚卵易於取得且操作 方便，因此常做為胚胎實驗的對象。
斑馬魚為脊椎動物，相較於常見的動物模型：果蠅、線蟲，更貼近於人類，
為近年用來研究脊椎動物胚胎發育的重要動物模型
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。應用斑馬魚做為動物模型 的優點包括：可利用光週期誘發產卵 (產卵的數量可以高達數百顆)、體外受精、胚胎透明、胚胎發育期短 (2 至 3 天)、器官形成過程易於觀察、可利用物理及 化學方法產生變種斑馬魚、也可用分子生物學方法改變特定基因的表現及產生基 因轉殖魚等。
在 1995 年 Kimmel
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提出斑馬魚發育時間及形貌代表性階段 (從受精後 0.2 小時開始到受精後 3 天) 的示意圖 (圖 1 – 3)。文章提及幾個代表性階段發 育的時間分別為：受精後 10 小時第一個體節開始生成，受精後 19 小時眼睛水 晶體長出，24 小時心臟開始跳動、開始有黑色素堆積在視網膜，36 小時已經可 以游動…等。目前文獻上提到斑馬魚肌小節長度量測的方法分別利用光學影像及染色技 術進行量測。在 2008 年 Dou
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利用光學影像量測到受精卵後 5 至 7 天的肌 小節長度約 2.15 μm。同年 Chen14
利用免疫染色技術對 α-actinin 染色，量測 到受精後 2、3 天的肌小節長度為 1.8 μm 左右。2008 年 Sanger15
利用了免疫 染色技術觀察斑馬魚肌肉組織的發生學，發現到斑馬魚在 24 小時，靠近頭部的 肌小節已經發育成熟，長度約 1.5 μm，但尾巴肌小節還在生長當中，長度約1.0 μm。
近幾年來科學家開始利用斑馬魚進行環境毒害的研究，在環境中添加化學物 質浸泡處理斑馬魚胚胎，觀察器官發育及存活率的變化。1991 年 Dave
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在斑 馬魚環境中添加入銅、鉛、鎳金屬，發現到斑馬魚孵化時間受到環境金屬的影響 而 拉 長 及 存 活 率 下 降 的 情 形 。1997 年 Henry17
在 斑 馬 魚 環 境 上 添 加 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) 從顯微鏡上觀察到斑馬魚的形貌受 到 TCDD 影響有破壞情形。也有科學家利用斑馬魚進行化學毒害的研究。2006 年 Parng18
在斑馬魚環境中加入酒精，利用免疫染色技術觀察到眼睛的神經及運 動神經均會受到酒精影響有破壞情形。2008 年 McGrath19
在斑馬魚環境中加入 pentylenetetrazole (PTZ)，一種會引起抽搐的溶液，觀察到隨著藥物的添加斑馬 魚的移動能力增加。作者也在環境中加入酒精，觀察到運動神經受到酒精影響有 破壞情形。2008 年 Chen20
在斑馬魚環境中添加咖啡因，觀察到受到咖啡因的 影響形貌上受到破壞。此外，也有科學家將斑馬魚應用在探討奈米粒子毒性。2007 年 Griffitt
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將 銅奈米粒子添加到斑馬魚的環境當中，觀察到當銅奈米粒子加入時，造成存活率 的下降及魚腮受到影響，作者從組織切片中發現到 somite 會受到奈米粒子的影 響有扭曲萎縮現像。2008 年 Zhu22
在斑馬魚環境當中分別添加入 3 種不同的 奈米粒子：zinc oxide, titanium dioxide, alumina，作者觀察到奈米粒子加入時，斑 馬魚的存活率會受到奈米粒子的影響而下降。作者從存活率提出zinc oxide 的毒 性最高可能性。也有科學家將斑馬魚用於 statin 副作用的探討。2007 Hanai
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將 statin 應 用在斑馬魚身上，利用染色技術對 anti-myosin heavy chain antibody (F-
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利用染色技術觀察到肌肉形貌受到 statin 的影影響有變短的情形。
從上面的文獻回顧可知，斑馬魚可用來從事藥物研究或環境毒害研究，例 如：藥物毒性、藥理及毒物基因學等研究，進一步做為人類疾病研究的動物模式。
1 – 3 二倍頻顯微成像技術
文獻上斑馬魚的觀察主要是利用染色及電子顯微鏡技術進行觀察，不僅不能
在活體上進行實驗，也有可能在製作樣品時造成人為誤差。在此我們利用自行架 設的二倍頻顯微技術對斑馬魚進行活體成像。二倍頻顯微技術為非線性光學的應用之一。其它非線性光學顯微技術包括
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，例如：同調反史托克拉曼散射26
、二倍頻27
或三倍頻28
、雙光子激發螢光28
… 等。2008 年 Xie29
開發出 Stimulated Raman Scattering (SRS) 顯微技術並搭配高 頻鎖像放大器提高靈敏度，與同調反史托克拉曼散射相比其背景訊號較低，可以 提供較佳的訊雜比。此外，也有科學家以提高光學解析度做為研究的方向，例如：STED
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(Stimulated emission depletion microscopy)、HR-SIM31
(High resolution structured illumination microscopy)…等技術。多光子顯微技術具有許多優點
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：使用近紅外光當作激發光源，相較於其 他較高光子能量的短波長光源，減少激發光源對組織的破壞。其較長波長的激發 光源也會減少非均勻組織中的散射，提高對樣品的穿透度。由於多光子顯微技術 為多光子誘發非線性光學現象，只有在聚焦焦點處才有足夠激發強度去產生非線 性光學，因此可做為光學斷層掃描得到空間解析度的三維影像。樣品製備相較於 免疫染色的繁複步驟簡單且快速，也減低了在製作樣品十人為因素的影響。由於 多光子顯微技術的訊號都來自於分子本身的訊號，因此不需對樣品外加螢光染多光子顯微技術具有許多優點