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–1 雷射極化方向對二倍頻顯微影像影響
在生物組織中有幾個特定結構的蛋白質可以產生二倍頻訊號，例如：
collagen、myosin filament、microtubules …，這些分子的排列方向跟雷射極化方 向的角度會影響二倍頻的訊號大小跟有無。由於老鼠尾巴富含豐富的膠原蛋白，
可以產生二倍頻訊號，因此，我們利用老鼠尾巴所做成的組織切片當作雷射極化 方向的樣品。
我們將雷射光的極化方向調整成直線偏極光及圓形偏極光進行二倍頻影像 掃描 (scan size: 150 X 150 μm；step size: 0.5 μm；laser power: 40 mW)。從影像 上可以看到直線偏極光呈現較暗的部分圓形偏極光有訊號產生，可以說明到選用 圓形偏極光比直線偏極光可以對樣品獲取更完整的資訊 (圖 3 – 1 a)。往後斑馬 魚二倍頻的實驗都是選用圓形偏極光來激發樣品，以免在分析肌小節長度時產生 人為上的誤差。
我們也進行二倍頻訊號的放射光譜量測 (laser power: 25 mW；average: 5；
exposure time: 1 second)，在往前的方向量測放射光譜，可以看到在波長 532 nm 的位置發現一根狹長的峰，這根峰即對應到二倍頻放射光譜訊號 (圖 3– 1 b)。
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–2 雷射功率對二倍頻影像的影響
為了分析斑馬魚肌肉組織的肌小節長度，每一次進行二倍頻影像掃瞄必須選 用相同的條件，如使用的雷射、掃圖時的範圍大小、掃圖時每個 pixel 停留的時 間...等，排除實驗參數不同而造成的人為誤差。
首先，關於雷射功率的選擇，基本上以不破壞斑馬魚樣品及所產生的訊號的 訊雜比良好為準。雖然，高雷射功率會提供較好的訊雜比，但是我們必須探討雷 射功率是否會造成斑馬魚樣品有所破壞。
首先，將斑馬魚麻醉並置於光學顯微鏡上，雷射功率調整為 45 mW，進行 連續 3 張同一地方的二倍頻影像掃瞄 (scan size: 100 μm x 100 μm；step size: 0.5 μm)。從影像上發現到斑馬魚二倍頻影像上並沒有因為雷射功率的連續掃描而造 成任何肌肉形貌明顯的改變，且進行同一地方同一位置的肌小節長度分析，肌小 節長度也沒有受到雷射功率影響而長度改變 (圖 3– 2)。此外，從亮視野的觀察 下，使用 45 mW 的雷射功率停留在肌肉組織中同一位置 5 秒，肌肉組織的形 貌上並沒有造成任何明顯改變。由以上的實驗可知雷射功率調整為 45 mW 並不 會對斑馬魚肌肉組織造成影響，之後實驗上使用的雷射功率最高為 45 mW。
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–3 斑馬魚影像
將斑馬魚樣品放在顯微鏡上，選擇物鏡 (CFI Plan Apo 20X, N.A. = 0.75, W.D.
= 1.00 mm, Nikon, Japan)，利用接圖技術將斑馬幼魚完整呈現。圖上所示，最左 邊為眼睛，往右邊為內耳石，在左下邊為卵黃的部分，而中間貫穿斑馬魚全身為 脊索，心臟的位置介於卵黃跟眼睛的地方。從圖上可以發現，受精卵後三天的斑 馬魚，體色還是呈現透明狀態，並沒有多餘的黑色素產生而影響到實驗的進行 (圖 3– 3)。
接著，對受精後 8 天的活體斑馬魚背部骨骼肌進行二倍頻影像掃瞄 (scan size: 150 μm x 150 μm；step size: 0.3 μm；anterior to the left；dorsal up)，得到二 倍頻影像 (圖 3– 3)。
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–4 肌小節細微結構分析: Single band 跟 Double band
由上述的實驗，我們確定雷射功率並不會對斑馬魚造成形貌上的破壞。我 們對受精後 72 小時頭部體節 (5
-
8 體節) 進行高解析度二倍頻影像掃瞄 (scan size: 50 x 50 μm；step size: 0.2 μm)，影像中發現到有兩種不同的影像分為：雙峰 (double band) 與單一峰 (single band) 的影像 (圖 3 – 4 a)。首先，必須確定 single band 與 double band 並不會造成分析肌小節長度時的人為誤差。利用先前 分析肌小節長度的方法，分別對這兩個 band 進行肌小節長度分析，量測到 single band 肌小節長度約 1.86 ± 0.12 μm，但在分析 double band 的長度，發現 到 double band 的強度對於距離做圖中，二倍頻中間的訊號會減小，量測到 double band 肌小節長度約 1.86 ± 0.15 μm。在統計分析上 single band 跟 double band 長度並沒有顯著差異 (p = 0.93, n = 12)，說明到無論從 single band 或是 double band 決定肌小節長度，其長度分析上並不會產生人為誤差 (圖 3– 4b)。二倍頻中間的訊號會降低這個現象在 2006 年 Plotnikov
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曾在二倍頻影像 強度對距離分析中發現此情形，作者提出可能原因為肌小節中 M-
line 為中心對 稱分子，並不會產生二倍頻訊號，造成中間的訊號變小。2008 年 Prent71
作者 將 Drosophila melanogaster larva 一端固定在玻片上，拉扯另一端造成肌小節長 度拉長，發現到當肌小節被拉長時，強度對距離作圖會從 double band 變成 single band。作者認為二倍頻中間的訊號會減小，來自於肌肉收縮時，中間的區 域產生破壞性的干涉，造成中間訊號強度降低。2009 年 Recher40
提出可能原因 可能為肌小節中間的蛋白質在老化或新生的狀況下產生水解的情形，造成中間的 訊號變低。作者發現到二倍頻影像有 single band 與 double band 的差異並進行 肌小節長度分析，觀察到這兩個 band 的肌小節長度並沒有差異。這與我們量測 的結果相符。到目前為止，二倍頻為什麼會出現 single band 跟 double band 的影像並不 清楚，但是，我們可以確定的是此現象並不會造成分析肌小節長度的人為誤差。
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–5 肌小節長度隨著生長時間之變化
由上述的實驗可知，我們可以利用二倍頻影像量測肌小節長度，也從高解析 的二倍頻影像量測到 single band 跟 double band 長度上沒有顯著的差異。我們 將二倍頻技術更進一步的應用在觀察活體斑馬魚的肌小節長度隨著生長時間之 變化。
我們分別對受精後 24 小時、36 小時、72 小時斑馬魚頭部體節 (5
-
8 體節) 跟尾巴體節 (21-
24 體節) 進行二倍頻影像的掃描 (scan size: 50 x 50 μm；step size: 0.2 μm)，發現到受精後 24 小時，頭部體節的部分已經有亮暗條紋的影像 出現，然而尾巴的二倍頻訊號非常的微弱，且沒有明顯亮暗條紋影像出現 (圖 3– 5)。根據先前分析肌小節長度的方法，分別對 3 隻斑馬魚在不同時期所掃瞄到 的二倍頻影像進行統計分析。發現到受精後 24 小時，頭部體節肌小節長度約 1.93 ± 0.06 μm (n = 21)，尾巴體節肌小節長度約 0.99 ± 0.17 μm (n = 21)。由分析 結果說明到斑馬魚肌肉的生長方向是從尾巴開始生成，其尾巴的肌小節長度較 短。我們更進一步的量測尾巴體節的肌小節長度隨著時間的變化，受精後 30 小 時尾巴的肌小節長度約 1.66 ± 0.08 μm (n = 21)，受精後 36 小時尾巴體節肌小 節長度約 1.93 ± 0.09 μm (n = 21)。頭部體節從受精後 24 小時開始，肌小節長 度並沒有太大的改變，說明到頭部體節肌小節長度在受精後 24 小時內生長完 成。我們也分析受精後 12 天肌小節長度，頭部體節肌小節長度約 1.86 ± 0.12 μm (n = 21) 及尾部體節肌小節長度約 1.93 ± 0.12 μm (n = 21) 和受精後 36 小 時相比肌小節的長度差異不大，說明到斑馬魚在受精後 36 小時頭部體節跟尾部 體節的肌小節已生長成熟。這是第一次利用二倍頻影像在活體斑馬魚量測到肌小 節長度隨著生長時間之改變 (圖 3– 6)。
在 2008 年 Sanger
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利用了免疫染色方法觀察斑馬魚肌肉的發生學，發現 到受精後 24 小時，靠近頭部的肌肉發育較快，其肌小節的長度為 1.5 μm，尾巴肌肉還在生長當中，其肌小節的長度為 1.0 μm。文獻結果與實驗結果相同，
但是文獻提及頭部體節的肌小節長度與結果相比有較短的情形，推測的原因為利 用染色的方法需將樣品固定，使得形貌受到改變，產生人為上的誤差。2008 年 Dou
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利用光學影像的方法去量測出受精後 5 至 7 天的肌小節長度約 2.15 μm，肌小節長度與結果相比有較長的情形，推測原因可能為利用光學影像方法 量測肌小節長度，其對比太小進而造成量測上的誤差。根據以上的分析結果，利用二倍頻影像量測到肌小節長度跟文獻上所提到的 長度差異不大。此外，二倍頻影像是非侵入性的研究技術，且利用二倍頻影像可 以省去文獻上繁複的技術並提供斑馬魚活體的肌肉生長過程即時觀察的工具。
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–6 statin 對肌肉形貌之影響
根據上述的實驗結果，我們可以成功利用二倍頻影像量測肌小節長度隨著生 長時間的變化。我們將二倍頻技術更進一步應用在 statin 引起肌肉毒性副作用 進行探討。
目前 statin 有很多種類如：lovastatin、atorvastatin、fluvastatin、pravastatin、
rosuvaststin、simvastatin、cerivaststin…，在實驗中我們選用 lovastatin 添加在斑 馬魚環境中。
我們將含有 statin 的溶液置換到斑馬魚環境中，探討受到 statin 藥物影響 肌肉形貌上的改變。我們對受精 84 小時與受精後 3 天浸泡 statin 12 小時斑馬 魚進行二倍頻影像掃瞄 (scan size: 200 x 100 μm；step size: 0.5 μm)。發現到正常 斑馬魚二倍頻形貌，斑馬魚肌肉排列方式相當整齊 (圖 3 – 7 a)，在環境中 statin 的影響下二倍頻影像肌肉形貌與正常相比有改變的情形，班馬魚肌肉形貌排列方 式扭曲、空洞產生，說明到 statin 會引起肌肉毒性副作用造成肌肉形貌上的改 變 (圖 3– 7 b)。
目前，利用斑馬魚動物模型探討 statin 引起肌肉毒性只有 2 篇文獻。2007 年 Hanai
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將 statin 種類中的 lovastatin 添加在斑馬魚環境中，利用染色的技 術對 anti-
myosin heavy chain antibody (F-
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利用染 色的技術發現到斑馬魚在 statin 環境中肌肉形貌上有所改變，作者進一步量測 到斑馬魚肌纖維的直徑會隨著 statin 濃度上升而有變短的情形發生。上述的實驗說明到利用二倍頻影像技術應用在活體斑馬魚上進行 statin 造 成肌肉毒性副作用探討是可行的。由於目前的文獻都只提及到肌肉形貌受到 statin 的影響有所改變，並沒有更進一步探討肌肉細微結構的改變，因此我們利
用上述提及的肌小節分析方法，進一步量測肌小節的長度會不會受到 statin 的 影響而有所改變。
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–7 Statin 濃度之影響
根據上述的實驗，我們可以在活體斑馬魚觀察到 statin 引起的肌肉毒性副 作用。加上我們先前實驗說明到可以利用二倍頻影像量測活體斑馬魚肌小節的長 度。我們將此技術應用在斑馬魚受到 statin 影響肌小節長度之探討。
首先，將受精後 3 天的斑馬魚環境置換成含有不同濃度的 statin 藥物的曝
首先，將受精後 3 天的斑馬魚環境置換成含有不同濃度的 statin 藥物的曝