第二章、 實驗儀器與方法
2.1 實驗儀器與原理
2.1.1 單分子螢光共振能量轉移
單分子實驗 (single-molecule experiment) 透過對單一分子的研究而了解分 子微觀下的特性，和整體實驗 (ensemble experiment) 的不同之處，在於整體實驗 觀察所有分子共同表現出的現象，而得到平均的資訊。單分子實驗能觀察每個分 子在特定時間下的狀態，進而得到分子動力學、動態學的資訊。以圖十七為例，
Ra與Rb為核醣體，Ra與tRNA 進行交互作用而產生構形改變而最終形成 Rb，就 單 分 子 螢 光 共 振 能 量 轉 移 (single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer, smFRET) 的數據而言可以看出某一個分子 Ra在轉變成Rb的過程當中，
經過了 R‧tRNA1、R‧tRNA2、R‧tRNA3三種中間態 (圖十七 c)，並可以藉由 觀察大量分子並將數據統計而得到在每個時間下Ra、Rb、R‧tRNA1、R‧tRNA2、 R‧tRNA3的消長情形 (圖十七 d)，就整體實驗而言，最左側的圖示了整體的 EFRET
值變化與時間的關係圖 (圖十七 b)，就這張圖而言，我們很難以了解到 Ra到Rb
經過了三個中間態，並且無法藉由每個分子構形在時間下的變化得到動力學、動 態學的資訊。
圖十七、整體實驗與單分子實驗數據的比較。摘錄自參考資料[37]。
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目前單分子實驗的種類大約分成兩種類型，第一種為以螢光為基礎的方法 (fluorescence-based)，此種方法在欲研究的分子上標記螢光分子，藉由偵測螢光 了解分子內部的行為或位置等資訊，其中常用的顯微鏡有共軛焦螢光顯微鏡 (confocal fluorescence microscopy) 或是全內反射式螢光顯微鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope, TIRFM)。而另一種常見的為以力為基礎的方 法 (force based)，藉由在研究的分子上黏上微米尺度的小球，藉由對小球施力而 操控分子，可以了解生物分子中與力或能量相關的資訊，常見的如光鉗 (optical tweezers)、磁鉗 (magnetic tweezers)、原子力顯微鏡 (Atomic Force Microscopy, AFM) 等。
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以最廣泛運用的 Cy3-Cy5 染料分子對為例，由此式可作出如圖十九所示的 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 − 距離的關係圖，此方法靈敏的範圍介於約 3-8 nm 之間。
螢光共振能量轉移效率是利用螢光分子間的偶極-偶極交互作用 (dipole-dipole interaction)，公式中與螢光分子之間距離成六次方反比主要是受到此影響。
由於偶極為向量，能量若是要能順利的傳遞，供體、受體螢光分子的偶極矩向量 夾角不能垂直。
再者，能量能順利傳遞還需供體螢光分子的放射波長 (emission wavelength) 區域與受體螢光分子的激發波長 (excitation wavelength) 有部分重疊 (圖二十)，
才可能發生能量轉移。
圖十八、螢光共振能量轉移原理。摘錄自參考資料[38]。
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圖十九、供體與受體螢光分子之螢光共振能量轉移效率與分子間距離關係圖。
摘錄自參考資料[39]。
圖二十、供體螢光分子 (Cy3) 與受體螢光分子 (Cy5) 的放射波長、激發波長示 意圖。摘錄自參考資料[38]。
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2.1.2 全內反射螢光顯微鏡
全 內 反 射 螢 光 顯 微 鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope, TIRFM) 為本研究主要使用的研究儀器。光因在不同介質中行進速度不同，造成 光從一介質進入另一種介質時產生偏折的現象，當光線由速度較慢 (折射率較大、
光密) 介質進入速度較快 (折射率較小、光疏) 介質時，光線會偏離法線如圖二 十一左側所示，其折射率與角度的關係可以司乃爾定律 (Snell’s law) 表示 n1 sin θ1 = n2 sin θ2，當入射角θ > 臨界角θC時就會產生如圖右側全反射的現象，
亦即折射現象的消失。
圖二十一、全反射示意圖。摘錄自參考資料[40]。
但當入射角θ > 臨界角θC時並非所有能量傳遞都會消失，如圖二十二(a) 所 示，全反射發生的光疏介質處會產生一個漸逝波 (evanescent wave)，而此漸逝波 的強度隨進入的深度越深強度成指數衰退，用以激發供體螢光分子的能量就從此 漸逝波而來，而漸逝波可穿越光疏介質的平均深度約為100nm 深。
全內反射螢光顯微鏡的架設如圖二十二(b) 所示，激發光源的使用配合供體 (Cy3) 與受體 (Cy5)，分別為波長 532 nm (綠光) 與 638 nm (紅光) 的雷射光源，
光源由漸逝場傳遞給螢光分子，經物鏡 (objective) 收集，並以濾鏡 (filter) 過濾。
圖中的狹縫、透鏡組、雙色鏡與反射鏡等元件稱為雙視 (dual view) 光學元件組，
用 途 為 將 供 體 及 受 體 放 出 的 光 分 開 ， 並 能 進 入 電 子 放 大 式 電 荷 耦 合 元 件 (Electron Multiplied Charged Coupled Device，EMCCD) 中同時觀察[39]。
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圖二十二、全內反射螢光顯微鏡原理以及架設。摘錄自參考資料[39]