實驗設計

由於 Zhou 的團隊已研究 (GGGGCC)4 形成的 G-四聯體結構，並了解其在 鉀離子中產生的結構為chair-type 的反平行結構。其詳細條件為將 0.1 mM 的單 股 (GGGGCC)4 加熱至95^oC 15 分鐘，之後在含有 70 mM 的氯化鉀以及 20 mM 的磷酸鉀的緩衝溶液中 (pH=7) 長時間降溫之後做圓二色光譜或核磁共振的測 量[36]。為了瞭解 (GGGGCC)n可能的構形，以了解此序列在染色體中擴張時，

可能產生的DNA 二級結構，我們試著從已被解出的 (GGGGCC)4 著手研究，先 建立 (GGGGCC)4 於smFRET 下形成的 G-四聯體結構可測得的 EFRET值，此外，

我們也在研究時發現了，此序列在不形成 G-四聯體結構時可能摺疊形成類髮夾 結構 (hairpin-like structure)，因此我們經由更換溶液的離子濃度、離子種類、G-四股結構的配體、溫度等，觀察 G-四聯體隨環境變化而造成的結構改變及其熱 力學、動力學、動態學的關聯性。

圖三十九、實驗為了解 (GGGGCC)n 可能產生的 G-四聯體與類髮夾結構構形，

並了解構形間的熱力學、動力學、動態學等關聯性。

41

3.2 (GGGGCC)4 結構鑑定

為了解此 (GGGGCC)4 反平行的 G-四聯體結構在 smFRET 測量中可得的 EFRET 值為何，本實驗中使用的 (GGGGCC)4 序列如 2.2.2 節表三所示。我們將 (GGGGCC)4 置於含有各濃度鉀離子的環境中進行黏合反應，並在之後於室溫下 改變鉀離子的濃度觀察構形可能產生的改變。首先，我們在無鉀離子的環境中進 行黏合反應，之後漸漸地加入10-150 mM 的鉀離子觀察序列的構形變化，我們 可以從圖四十觀察到，從低鹽至高鹽時EFRET值的變化約介於0.74 與 0.78 之間，

加入較高濃度的鹽，雖然峰值稍微向右偏移，但若是以漂移的方式向右移動，不 似有明顯的結構改變，而較可能為陽離子造成DNA 骨架上磷酸根的負電被中和 而造成構形更為緊密造成的結果[50]，因此我們不認為此處得到的 EFRET表示了 G-四聯體的結構。由於先前在黃子芸的實驗中，(TGGAA)3中頭對頭的類髮夾結 構之下其 EFRET值為 0.84[41]，與此實驗的峰值接近，我們猜想這可能代表了類 髮夾結構的產生，圖四十一為經由IDT (Integrated DNA Technologies) 網站所提 供的OligoAnalyzer 3.1 計算而得，此兩種可能的類髮夾結構，雖然非頭對頭的形 式，但若是僅差距一或兩個核苷酸，其EFRET值為較0.84 稍低的 0.78 而言的話，

有其存在的可能性。

42

[K⁺]/mM (GGGGCC)₄ annealed in [K⁺] = 0 mM

0

10

Frequency

30

50

100

150

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

E

圖四十、(GGGGCC)4於無鉀離子的情況下行黏合反應，並再依序注入10-150 mM 的鉀離子偵測所得的EFRET圖

圖四十一、(GGGGCC)4 序列可能產生的類髮夾結構。摘自參考資料[51]。

43

44 (G-quadruplex stabilizer)，能找到 G-四聯體並與之結合，當試圖以施力將 G-四聯體 結構解開時，有PDS 的結合的情況，比起無 PDS 結合時需要更大的力量才能將

45

(GGGGCC)₄ with PDS 20min (GGGGCC)₄ with PDS 1min (GGGGCC)₄

Freq ue nc y

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

(GGGGCC)₄ annealed at [K⁺] = 150 mM

E

圖四十三、在鉀離子濃度 150 mM 的中行黏合反應的 (GGGGCC)4 序列中加入 10 nM 的 PDS 而觀察其序列的 EFRET隨時間改變的情形。

3.3 (GGGGCC)5 結構鑑定

在3.2 中辨認出了產生的 (GGGGCC)4 序列的結構後，接著試圖探討較複雜 的 (GGGGCC)5 序列，我們所使用 (GGGGCC)5 的序列詳列於表三中，同樣地在 無鉀離子的環境中進行黏合反應，再漸漸地加入10-150 mM 的鉀離子，如圖四 十四所示，鉀鹽的濃度由低至高時EFRET的峰值的變化約介於0.76 與 0.8 之間，

此處與 (GGGGCC)4 圖四十的結果類似，鉀鹽濃度較高時漸漸向右飄移，此現象 應與 (GGGGCC)4 漂移的原因類似，且由IDT (Integrated DNA Technologies) 網 站所提供的OligoAnalyzer 3.1 計算可能產生的類髮夾結構，如圖四十五所示，產 生的類髮夾結構，尾段露出一個核苷酸。

46

150 100 50 30 10 (GGGGCC)₅ annealed in [K⁺] = 0 mM

0 [K⁺]/mM

Frequency

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

E_FRET

圖四十四、(GGGGCC)5於無鉀離子的情況下形黏合反應，並再依序注入 10-150 mM 的鉀離子偵測而得的 EFRET圖。

圖四十五、(GGGGCC)5 序列可能產生的類髮夾結構。摘自參考資料[51]。

47 AGGGGCGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGGAGCGGGGCTG – 3’，由 5’端至 3’端，以紅字標示三個連續 G 以上的序列共有六段，分別以羅馬數字稱為 I-VI 段，除了在先前的研究中發現I-II-III-IV、II-III-IV-V、III-IV-V-VI 的 G-四聯體形 成之外，在此研究中亦發現了可能有不連續的I-II-IV-V 四段連續 G 所產生的

48

圖四十七、BCL-2 基因中的一段 Pu39 序列，可以由第 I-II-IV-V 四段不連續的 G 序列形成G-四聯體，其產生的結構為平行結構，且三段環的核苷酸比為 1:13:1。

摘錄自參考資料[52]。

由於Pu39 的例子，讓我們想到 (GGGGCC)5 有和 (GGGGCC)4 相同的EFRET

峰值的可能原因為在 (GGGGCC)5 的五段G 序列中，可能有不連續的 G 序列形 成G-四聯體，如圖四十八所示，若是 5’ – GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC – 3’的第 I-II-IV-V 段形成 G-四聯體時，DNA 結構會如圖(b) 所 示，而若是第 I-III-IV-V 段形成 G-四聯體時，結構如圖 (c) 所示，因此若 (GGGGCC)5 形 成 了 此 兩 種 結 構 ， 在 我 們 的 DNA 的 設 計 中 ， 僅 能 偵 測 到 (GGGGCC)5 尾端供體螢光染料與雙股螺旋上的受體之間的距離，因此我們推測 在這兩種結構下可能觀測到的EFRET值與 (GGGGCC)4形成的G-四聯體結構被偵 測到的EFRET值非常接近。

49

圖四十八、(a) (GGGGCC)4 與 (b)(c)(GGGGCC)5 可能形成的G-四聯體結構，而 這些結構可能造成的EFRET值非常接近。

為了證明圖四十八中(b) 與(c) 的結構可能生成 G-四聯體的結構，我們將 (GGGGCC)5 序列的兩個位置作突變，形成兩種序列，我們分別稱為 G52A 5’–

GGG GCC GAG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC – 3’，以及 G53A 5’– GGG GCC GGG GCC GAG GCC GGG GCC GGG GCC – 3’，也就是將其在第二或第三 段的連續 G 序列中第二個核苷酸的鹼基從 G 改成 A (Adenine)，選擇 A 的原因有 二，首先是 A 序列無法在 G-四方平面結構中與其他的 G 形成 Hoogsteen 鹼基配 對，再者，就鹼基結構上而言 G 與 A 同為嘌呤，結構較相近，可能較不會影響 序列除了 Hoogsteen 鹼基配對以外的表現。因此我們期待 G52A 由於第二段的 G 序列無法參與 G-四聯體的形成，而形成如圖四十八(c) 的結構，相同的，G53A 由於第三段的G 序列無法參與 G-四聯體的形成，而形成如圖四十八(b) 的結構。

在測量中，我們發現了G52A 與 G53A 的結構如圖四十九所示，此兩條序列中，

形成的 G-四聯體結構都在約 0.5 附近有個峰值，但明顯地處於 G-四聯體狀態的 分子都下降許多，且無法形成 G-四聯體的部分改而形成 EFRET ~ 0.8 的類髮夾結 構，我們將 G52A 與 G53A 的 EFRET 以不同比例加成，試圖以最佳化模擬 (GGGGCC)5 的構形，結果如圖五十所示，而EFRET 於0.3-0.35 的峰值並未於 G52A

50

或G53A 中出現，也代表了此偏低的 EFRET值並非G52A 或 G53A 造成的結構。

而類髮夾結構部分，由於G52A 在原本 (GGGGCC)5形成G-C 的 Watson-Crick 鹼 基配對形成處被修改成A，因而形成與 (GGGGCC)5不同的結構，尾端露出兩個 核苷酸，而得到稍低的EFRET值，而G53A 的類髮夾結構則是與 (GGGGCC)5 類 似，得到的EFRET值相同 (圖五十一)。

(GGGGCC)₄

G53A G52A

(GGGGCC)₅

Freq ue nc y

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

E

圖四十九、(GGGGCC)5 與(GGGGCC)4 的 EFRET 峰值位置比較，以及 G52A 和 G53A 的 EFRET分布。

51

0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70

Frequency

E

(GGGGCC)₅ G52A G53A mixed

圖五十、以G52A 和 G53A 的峰值擬合

圖五十一、G52A 與 G53A 可能形成的類髮夾結構。摘自參考資料[51]。

52

53

圖五十三、隨重複次數增長，序列形成EFRET值較高的類髮夾結構與自身結構中 所有可能產生構形的百分比比較。

3.5 (GGGGCC)4 中的G-四聯體與髮夾結構穩定性的探討

由於在 (GGGGCC)4 在鉀離子的環境下的EFRET 峰值僅有兩個，分析較為容 易，我們觀察兩種結構長時間的軌跡圖，以及在改變鉀離子環境下可能產生的動 態變化。首先，我們觀察於無鉀離子中行黏合反應的 (GGGGCC)4長時間軌跡圖，

在無鉀離子的環境下，形成的類髮夾結構並不穩定，如圖五十四所示，其 EFRET

值雖然長時間在0.8 的位置，但經常性地被解開又再黏合回去，代表了此結構並 不穩定，這也解釋了圖四十中此直方圖的峰值特別寬的現象。而若是觀察於 150 mM 鉀離子中行黏合反應的 (GGGGCC)4長時間軌跡圖，雖然在此情況下類髮夾 結構並非主要的構形，但我們還是可以藉由觀察長時間軌跡圖了解在此情況下結 構的穩定度，我們可以發現其類髮夾結構在150 mM 鉀離子的環境之下變得較穩 定，被解開的頻率非常的小 (圖五十五)，而在此條件下主要的 G-四聯體結構，

54

觀察其長時間軌跡圖能發現，其在約EFRET = 0.52 形成更穩定的結構，幾乎很難 觀察到被解開的情形 (圖五十六)。接著，我們同樣地將於 150 mM 鉀離子行黏 合反應的 (GGGGCC)4 沖入無鉀離子的溶液，並經過長時間的等待，在兩小時後，

我們發現G-四聯體結構漸漸減少，甚至在十小時後與類髮夾結構的比例約為 1:1 (圖五十七)。接著，我們相反地將在無鉀離子行黏合反應的 (GGGGCC)4 沖入150 mM 鉀離子的溶液並同樣地長時間觀察，結果發現無論是兩小時或是十小時，

EFRET的峰值都未有太大的改變 (圖五十八)。

I(A.U.)

Donor Accpetor

0 5 10 15 20

0.4 0.6 0.8 1.0

E

Time (s)

E_FRET (GGGGCC)₄ annealed in [K⁺] = 0 mM

圖五十四、(GGGGCC)4於無鉀離子中類髮夾結構的長時間軌跡圖。

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