以單分子螢光共振能量轉移研究造成肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症的GGGGCC重複序列其結構間的動力學

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文 Department of Chemistry College of Science National Taiwan Normal University Master Thesis 以單分子螢光共振能量轉移研究造成肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症的 GGGGCC 重複序列其結構間的動力學 Structural Kinetics of Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Dementia Linked GGGGCC Repeats Studied by Single-Molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer. 丁建棋 Chien-Chi Ting 指導教授：李以仁博士 Advisor : I-Ren Lee, Ph.D. 中華民國 107 年 7 月 July 2018.

(2) 摘要肌萎縮性脊髓側索硬化症 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 與額顳葉癡呆症 (frontotemporal dementia, FTD) 皆為嚴重的神經退化性疾病，並且兩者在基因序列中被發現有高度的相關性。於 C9orf72 基因中的內顯子中發現含有 GGGGCC 六核苷酸重複序列擴張是家族性遺傳 ALS 與 FTD 常見的病因。在正常人的基因中，能在內顯子中發現的重複次數約在 25 次以下，但卻能在 ALS 或 FTD 的患者中發現數十至數百個重複序列。GGGGCC 序列可能以不同 G-四聯體結構的方式摺疊成二級結構，這樣的結構多元性可能導致轉錄失敗的 RNA 產物，或是產生錯誤摺疊的二肽重複蛋白。此種 G-四聯體的結構隨著重複序列次數的不同，可能產生不同的形式。d(GGGGCC)4 可形成反平行的 G-四聯體結構，然而其他重複次數亦可能產生平行的 G-四聯體結構。在本實驗中，我們利用單分子螢光共振能量轉移 (smFRET) 研究 d(GGGGCC)4 構形的動態變化。因而發現 d(GGGGCC)4 於鉀離子的環境中容易形成 G-四聯體結構，但若在無鉀離子的情況下易形成類髮夾結構，而此兩結構間的相互轉換在我們的研究中極為鮮少。為了解兩結構間的活化能，我們建立一套恆溫系統以利觀測，最終求得的活化能其數值極高，能說明兩者在室溫下鮮見相互轉換的原因，有了這些熱力學及動力學的資訊，能幫助我們建立結構間轉換反應坐標的圖像。最後，我們也嘗試研究 (GGGGCC)n 重複序列 5 次以上的結構，並發現在重複次數較多時，較容易以類髮夾結構的形式存在。. 關鍵字：肌萎縮性脊髓側索硬化症，額顳葉癡呆症，六核苷酸重複序列擴張， G-四聯體，單分子螢光共振能量轉移 i.

(3) Abstract Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) are severe neurodegenerative diseases with common genetic cause. GGGGCC hexanucleotide repeat expansions (HRE) located in the intronic region of chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) are the most common cause of familial ALD and FTD. In normal people, there are fewer than 25 intronic GGGGCC repeats, whereas patients with ALS/FTD have tens to hundreds repeats. GGGGCC repeats can fold into different conformations of G-quadruplex secondary structures. These structural polymorphism of GGGGCC repeats leads to transcription of abortive transcripts and translation of misfolded dipeptide-repeat proteins. The form of G-quadruplex varies with the fold number of GGGGCC repeats. d(GGGGCC)4 forms intramolecular antiparallel G-quadruplex structure while other times of repeats tend to have mixed or parallel G-quadruplex structure. We use single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) to study the structural dynamics of d(GGGGCC)4. We found that d(GGGGCC)4 will form G-quadruplex structure in the presence of potassium ion, but form hairpin-like structure in the absence of potassium ion. The interconversion of these two states is hardly found in our experiments. In order to find out the activation energy between these two states, we set up an environment in which the temperature is alterable. The estimated activation energy is as high as 33.4 kcal mol-1 and it’s in accordance with the result that the interconversion event is rare. With the aid of these thermodynamic and kinetic information, we can build a reaction coordinate of the two states. Finally, we also tried to study the d(GGGGCC)n sequence with n≥5, and we noticed that the d(GGGGCC)n prefer hairpin-like structure when the number of repeats increase.. Keywords：ALS，FTD，hexanucleotide repeat expansions，G-quadruplex，smFRET ii.

(4) 目錄第一章、緒論................................................................................................................ 1 1.1 肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症................................................. 1 1.1.1 肌萎縮性脊髓側索硬化症及額顳葉失智症簡介.............................. 1 1.1.2 肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症的關聯性...................... 2 1.1.3 致病機制.............................................................................................. 4 1.2 核苷酸序列的重複性及其擴張的研究......................................................... 5 1.2.1 核苷酸重複序列.................................................................................. 5 1.2.2 核苷酸重複序列的二級結構與擴張現象.......................................... 7 1.3 G-四聯體 (G-quadruplex) ............................................................................ 11 1.3.1 G-四聯體簡述 .................................................................................... 11 1.3.2 G-四聯體的特性 ................................................................................ 14 1.3.3 (GGGGCC)n 中的 G-四聯體 .............................................................. 16 1.4 研究動機....................................................................................................... 18 第二章、實驗儀器與方法.......................................................................................... 19 2.1 實驗儀器與原理........................................................................................... 19 2.1.1 單分子螢光共振能量轉移................................................................. 19 2.1.2 全內反射螢光顯微鏡......................................................................... 23 2.2 實驗器材與樣品置備................................................................................... 24 2.2.1 實驗用玻片前處理............................................................................ 24 2.2.2 DNA 的設計 ....................................................................................... 26 2.2.3 顯像緩衝溶液.................................................................................... 29 2.2.4 實驗方法與流程................................................................................ 33 2.4 數據處理與分析........................................................................................... 35 第三章、實驗結果與討論.......................................................................................... 40 iii.

(5) 3.1 實驗設計....................................................................................................... 40 3.2 (GGGGCC)4 結構鑑定 ................................................................................. 41 3.3 (GGGGCC)5 結構鑑定 ................................................................................. 45 3.4 (GGGGCC)n 類髮夾結構穩定性比較 ......................................................... 52 3.5 (GGGGCC)4 中的 G-四聯體與髮夾結構穩定性的探討 ............................ 53 3.6 以變溫實驗研究 (GGGGCC)4 的 G-四聯體與類髮夾結構間轉換之動力學.......................................................................................................................... 57 第四章、結論.............................................................................................................. 59 參考文獻...................................................................................................................... 62. iv.

(6) 圖目錄圖一、家族性遺傳 ALS 與 FTD 的族譜研究。 ................................................. 3 圖二、擴張的(GGGGCC)n 序列造成致病的可能途徑。 ................................... 5 圖三、重複序列可能形成 DNA 二級結構。 ...................................................... 8 圖四、DNA 解旋酶及聚合酶進行複製的過程。. ........................................... 9. 圖五、DNA 聚合酶複製時行進方向與岡崎片段的產生。 ............................... 9 圖六、DNA 複製過程中遇到 TNR 時可能造成擴張的原因。 ....................... 10 圖七、DNA 於修複時發生環的導入而造成序列擴張的三種可能機制。 ..... 11 圖八、Gallert 提出的單磷酸鳥苷凝膠中鹼基對的排列而成的 G-平面四方結構結構。 .............................................................................................................. 12 圖九、G-平面四方結構以及 G-四聯體。 ......................................................... 13 圖十、d(GGGGTTTTGGGG)形成的 G-四聯體與結構中的鉀、鈉離子相對位置示意圖。 .......................................................................................................... 14 圖十一、G-四聯體 DNA 數量、行進方向、形成的序列以及穩定此結構的金屬離子對照表。 .................................................................................................. 15 圖十二、G-四聯體中環的種類。 ...................................................................... 15 圖十三、鹼基與五碳糖間 syn 與 anti 位向關係。 ........................................... 16 圖十四、環境中含有鈉、鉀離子時 d[AGGG(TTAGGG)3] 序列的構形變換。 ...................................................................................................................... 16 圖十五、d(G4C2)、d(G4)、d(G4C2)2、d(G4C2)3、d(G4C2)4 和 d(G4C2)5 序列於圓二色光譜下的測量結果。 ...................................................................... 17 圖十六、(GGGGCC)4 形成的 G-四聯體結構。................................................ 18 圖十七、整體實驗與單分子實驗數據的比較。 .............................................. 19 圖十八、螢光共振能量轉移原理。 .................................................................. 21 圖十九、供體與受體螢光分子之螢光共振能量轉移效率與分子間距離關係 v.

(7) 圖。 ...................................................................................................................... 22 圖二十、供體螢光分子(Cy3)與受體螢光分子(Cy5)的放射波長、激發波長示意圖。 .................................................................................................................. 22 圖二十一、全反射示意圖。 .............................................................................. 23 圖二十二、全內反射螢光顯微鏡原理以及架設。 .......................................... 24 圖二十三、玻片修飾後的化學結構。 .............................................................. 25 圖二十四、載玻片與蓋玻片的組裝。 .............................................................. 26 圖二十五、Cy5 與 NH2C6 形成的交聯反應。 .................................................. 27 圖二十六、Cy5 結構及與核苷酸連接的位置示意圖。 ................................... 27 圖二十七、核酸序列以及標誌物的設計。 ...................................................... 27 圖二十八、螢光原理以及各能量轉移過程的時間尺度。 .............................. 30 圖二十九、Trolox 在含氧的環境下照光氧化為 Trolox quinone。 ................. 30 圖三十、各除氧系統和氧氣反應並生成酸的比例。 ...................................... 31 圖三十一、各除氧系統條件下 pH 值對時間的改變。 ................................... 32 圖三十二、完成束縛於玻面表面的 DNA 樣品示意圖。 ................................ 33 圖三十三、DNA 樣品在全內反射式顯微鏡的觀察圖像。 ............................. 34 圖三十四、螢光分子的篩選以及供體逸漏校正。 .......................................... 37 圖三十五、以直方圖 (histogram) 繪製所有分子的 EFRET 值相對數量統計圖。 ...................................................................................................................... 37 圖三十六、長時間下觀測 EFRET 隨時間變化的關係圖。 ................................ 38 圖三十七、長時間軌跡圖中，供體或受體表現不佳而需被移除的分子。 .. 38 圖三十八、經 HaMMy 擬合程式計算長時間軌跡圖 EFRET 值隨時間變化的關係。 ...................................................................................................................... 39 圖三十九、(GGGGCC)n 可能產生的 G-四聯體與類髮夾結構構形。 ........... 40 圖四十、(GGGGCC)4 於無鉀離子下行黏合反應偵測所得的 EFRET 圖。 ...... 42. vi.

(8) 圖四十一、(GGGGCC)4 序列可能產生的類髮夾結構。 ................................ 42 圖四十二、(GGGGCC)4 於 10~150 mM 鉀離子環境中行黏合反應而成的 EFRET。 ................................................................................................................. 43 圖四十三、在鉀離子濃度 150 mM 的中行黏合反應的 (GGGGCC)4 序列中加入 10 nM 的 PDS 而觀察其序列的 EFRET 隨時間改變的情形。 ................. 45 圖四十四、(GGGGCC)5 於無鉀離子的情況下形黏合反應，並再依序注入 10~150 mM 的鉀離子偵測而得的 EFRET 圖。 .................................................. 46 圖四十五、(GGGGCC)5 序列可能產生的類髮夾結構。 ................................ 46 圖四十六、(GGGGCC)5 於 10~150 mM 鉀離子環境中行黏合反應而成的 EFRET。 ................................................................................................................. 47 圖四十七、BCL-2 基因中一段 Pu39 序列的結構示意圖。 ............................ 48 圖四十八、(GGGGCC)4 與 (GGGGCC)5 可能形成的 G-四聯體結構。 ....... 49 圖四十九、(GGGGCC)5 與(GGGGCC)4 的 EFRET 峰值位置比較，以及 G52A 和 G53A 的 EFRET 分布。 .................................................................................... 50 圖五十、以 G52A 和 G53A 的峰值擬合。 ....................................................... 51 圖五十一、G52A 與 G53A 可能形成的類髮夾結構。 .................................... 51 圖五十二、(GGGGCC)n 序列重複次數為 4-8 次的 EFRET 值比較。 ............... 52 圖五十三、隨重複次數增長，序列形成 EFRET 值較高的類髮夾結構與自身結構中所有可能產生構形的百分比比較。 .......................................................... 53 圖五十四、(GGGGCC)4 於無鉀離子中類髮夾結構的長時間軌跡圖。 ......... 54 圖五十五、(GGGGCC)4 於 150 mM 鉀離子中類髮夾結構的長時間軌跡圖。 .............................................................................................................................. 55 圖五十六、(GGGGCC)4 於 150 mM 鉀離子中 G-四聯體的長時間軌跡圖。 55 圖五十七、(GGGGCC)4 沖入無鉀離子的溶液觀測所得的直方圖。 ........... 56 圖五十八、(GGGGCC)4 沖入 150 mM 鉀離子溶液觀測所得的直方圖。 ... 56. vii.

(9) 圖五十九、攝氏 29、31、33、35 度下紀錄 G-四聯體所剩的比例隨時間變化的關係圖。 .......................................................................................................... 58 圖六十、由測得的速率常數作得的阿瑞尼式圖 (Arrhenius plot)。............... 59 圖六十一、重複次數較多時，(GGGGCC)n 序列的 EFRET 值比較。 .............. 61 圖六十二、(GGGGCC)4 的結構間的反應坐標圖。 ........................................ 61. viii.

(10) 表目錄表一、核苷酸重複序列疾病比較表。........................................................................ 7 表二、G-四聯體在圓二色光譜測量中的特徵峰。 ................................................. 17 表三、本研究所使用的所有 DNA 序列 ................................................................... 28 表四、顯像緩衝溶液的最終濃度。.......................................................................... 32 表五、抗生物素蛋白以及 DNA 樣品的最終濃度。 ............................................... 33 表六、(GGGGCC)4 的 G-四聯體與類髮夾結構間轉換的平衡常數與自由能。 ... 44. ix.

(11) 致謝在師大化學所的這三年，不僅在化學知識的學習上更進一步，亦在實驗中獲取了更多設計、實作以及結果分析探討等能力，也因而培養了對自己任何有興趣的事物上深入研究的熱情。在大學時期其實已對單分子這個領域略知一二，但在進入李以仁老師實驗室之後，發現自己雖然對一些實驗上的各個細節其實並不熟悉，經由老師與學長姐的教導，我漸漸能更深入地理解實驗器材的架設原理與實驗中每個步驟的意義。老師總是親自與我們討論實驗結果，並總是給予許多有建設性的意見，使我在實驗遇到瓶頸時能夠更快地解決，並當再次遇到類似的問題時，能將從老師學習到的思考脈絡加以應用。在每週的實驗室會議中，經由大家共同探討文獻，除了讓我從中學習到更多的新知之外，也能從中得到跟自己實驗相關的一些靈感，老師也會針對報告的內容、方法給予提點，提醒我們如何將實驗數據及閱讀資料整理成一個具有故事性的內容，提供給聆聽者。除了對老師的感謝之外，在實驗上也非常感謝實驗室中相遇個每一個夥伴，在這三年，除了在學習上的相互勉勵之外，在生活中也提供我許多迎向明天的動力。也非常感謝與我們每個月互相討論實驗內容的溫進德老師、李弘文老師及范秀芳老師，在廣大的實驗研究領域當中，更多夥伴間想法的相互激盪，常能點出我們對實驗的解釋其中的盲點，提供多元面向的看法。最後我想感謝我的家人，在我每個人生的階段都給予我最大的支持與陪伴，一直期待著能與家人分享在師大完成碩士學位的這份喜悅，如今終能完成學位，也期許自己在未來人生的路途中，能以在師大的所見所學，面對未來更多的挑戰。. x.

(12) 第一章、緒論. 1.1 肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症. 1.1.1 肌萎縮性脊髓側索硬化症及額顳葉失智症簡介肌萎縮性脊髓側索硬化症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 在英語系的國家中通常被稱為盧·賈里格症 (Lou Gehrig’s disease)，而在台灣俗稱漸凍人，為一種罕見疾病，每年確診的罹患機率約為十萬分之二，一般發病的年齡介於 5070 歲之間，患者在確診為漸凍人之後的平均壽命約為三年。此疾病會造成上、下運動神經元同時且逐漸地退化，在臨床的表現上，患者可能在發病初期在肢體上或是口咽部感到肌肉無力，肢體上的病患，可能會產生手部不協調、較容易跌倒、無法久站等情形，而在口咽部無力的患者，可能會產生口齒不清、說話含糊帶有鼻音等徵兆。而在發病的最終，患者都會經歷肌肉萎縮、無法行走、喪失語言能力、吞嚥以及呼吸困難，而須仰賴機器才得以延續生命。由於是運動神經元退化造成的疾病，漸凍人患者若無伴隨其他病變的產生，並不會產生感覺神經元或是智能的退化，換句話說，病患會在感覺、意識清晰的狀態之下經歷各部位、器官的肌肉萎縮[1][2]。額顳葉失智症 (Frontotemporal Dementia, FTD) 為一種因大腦的額葉及顳葉的退化而造成的失智症。此種失智症和一般熟知的阿茲海默症 (Alzheimer's Disease, AD) 皆為早發型失智症 (Early Onset Dementia, EOD)，意即發生年齡低於 65 歲，其明顯不同之處為，額顳葉失智症初期的症狀並非記憶力的衰退。額葉主要掌管的功能和做事動機、判斷力、專注力、衝動的控制力...等相關，若是額顳葉失智症從額葉開始受損，患者會明顯地變得在行為、人格上產生異狀，舉凡對任何事物缺乏動力、對社會規範的視而不見、個性變得暴躁易怒、同理心下. 1.

(13) 降等，也因此種行為改變並非常見失智病徵，常被認為是患者蓄意的行為而延誤就醫。而顳葉主要掌管的功能為語言能力，若是從顳葉開始退化的患者，初期的症狀會產生語言的障礙，時常無法正確地說出某個日常詞彙或在句中混雜許多語法錯誤，而另一類可能是能夠流利地以言語表達，卻難以理解他人話語[3][4]。. 1.1.2 肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症的關聯性在上節中簡述了肌萎縮性脊髓側索硬化症以及額顳葉癡呆症兩種不同疾病所產生的病徵，兩種疾病雖在臨床上表現出的病徵相去甚遠，但卻在部份的病患中意外地發現可能有相同的成因。2011 年，Renton 和 DeJesus-Hernandez 同時發表了對 C9orf72 (chromosome 9 open reading frame 72) 這段基因的發現，在家族性的肌萎縮性脊髓側索硬化症中，當對病患的家族做基因定序的結果，都同時在 C9orf72 基因的第一段內顯子 (intron) 中發現了 (GGGGCC)n 中有嚴重的六核苷酸重複序列擴張 (Hexanucleotide Repeat Expansion, HRE) 的現象，並且不分地域皆然，然而此現象，亦存在於家族性的額顳葉癡呆症患者中[5][6]。在正常人的基因序列中，這段 (GGGGCC)n 的重複次數大約 25 次以下，而帶有前突變 (premutation) 基因的人，重複次數大於 30 次，雖然本身並無病徵，卻可能繁衍出患有疾病的後代，在病人當中發現許多重複次數從 70 以上甚至到數百個重複都有可能。在探討病人的重複序列長度以及病徵的研究中指出，患者的發病年齡 (onset age) 可能與重複序列的次數相關，重複次數越多，患者可能發病的年齡越早[7]。但也有研究指出可能不全然與基因的重複次數相關，而也與其表徵遺傳學的差異性 (epigenetic difference) 相關[8]。除同時在肌萎縮性脊髓側索硬化症以及額顳葉癡呆症中同時發現擴張的 (GGGGCC)n 重複序列之外，在 Renton 團隊的研究當中，針對五個家族性的 ALS、 FTD 或 ALS-FTD 的患者研究，圖一中的五個家族中僅患有 ALS、僅患有 FTD 以及 ALS-FTD 可能在家族中產生共伴現象，亦即於家族中同時包含此三類型的 2.

(14) 患者。結合其基因、臨床上兩疾病的關聯，更多的研究即置重點於了解此 DNA 序列的擴張機制之外，另一方面，也有許多就 (GGGGCC)n 重複序列如何造成 RNA、蛋白質表現異常進而影響到患者身體機能作研究。. 圖一、藍色所示病患為 ALS 患者，橘色為 FTD 患者，而綠色為 ALS-FTD 患者。黑色的小箭頭所指向的為首先被證實之罹患者 (proband) ，而正常的等位基因 (wild-type allele) 以黑色的 wt 表示，重複序列過長的等位基因 (mutant allele) 以橘色的 mt 表示，性別基於保護個人隱私僅以斜線呈現。摘自參考資料[5]。. 3.

(15) 1.1.3 致病機制目前了解到可能造成致病的機制有三，首先是 C9orf72 蛋白質功能喪失，這種可能性最先被提出的原因，是發現在患者的纖維細胞中 C9orf72 基因轉錄出的 mRNA 以及相應的 C9orf72 蛋白質大量減少。再來的可能為 RNA 團簇 (RNA foci) 的生成，如圖二所示，RNA 轉錄的過程當中需要 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 在 DNA 上行進，當過量的 DNA 重複序列形成特殊的構形，或是過程中可能形成 DNA‧RNA 複合體，都可能阻礙 RNA 聚合酶前進，而進一步造成 RNA 聚合酶停滯 (pausing) 甚至轉錄失敗 (abortion) ，圖中轉錄失敗所剩下的 RNA (abortive transcript)，可能形成 RNA 髮夾結構 (hairpin structure) 或是 RNA G-四聯體 (RNA G-quadruplex) 的結構，並不斷被送至核仁 (nucleolus) 中堆積，並和核仁中的蛋白質形成聚集並影響其功能[9]。最後可能的機制為二胜肽蛋白質的聚合 (dipeptide-repeat proteins aggregation) ，照理說 (GGGGCC)n 位於 C9orf72 中的非轉錄區 (non-coding region) 應是無法轉譯出相應的蛋白質，但研究卻發現了二胜肽蛋白質的轉譯，如圖二的右下方所示，(GA)n、(GP)n、(GR)n 這三種類型的二胜肽蛋白質皆能在患者的細胞中被發現。目前的解釋為，由於過長的 (GGGGCC)n 重複序列存在於基因序列中，造成重複導致的非 ATG 發起的轉譯現象 (Repeat Associated Non-ATG-initiated translation, RAN translation) 的發生，因而造成 (GA)n、(GP)n、(GR)n 在患者細胞內異常堆積[10]。. 4.

(16) 圖二、擴張的(GGGGCC)n 序列造成致病的可能途徑。摘錄自參考資料[9]。 1.2 核苷酸序列的重複性及其擴張的研究. 1.2.1 核苷酸重複序列眼科醫生弗萊舍 (Bruno Fleischer) 於 1918 年時發現，患有白內障 (Cataract) 的病人，也在其族譜中發現了有一定數量的後代患有類似遺傳性的強直性肌肉失養症第一型 (Myotonic Dystrophy type 1, MD1)，但在白內障病人身上卻並未發現任何肌肉相關的疾病特徵，這讓弗萊舍開始針對這些僅患有白內障而無其他病徵的病人進行研究，他認為，在親代的基因中，含有一些雖無造成自身臨床上的疾病，卻會造成子代發病的基因序列。在 1940 年代，醫學界開始對早現遺傳 (Anticipation) 開始有些初步的了解，患有強直性肌肉失養症第一型的病人，在其家族內除了發現相同的病例之外，也發現病人的子代中，發病年齡漸漸地年輕化、甚至有病情會更加嚴重的現象，而在之後的 40 到 50 年間，這種病徵的成因仍然無法合理地解釋[11]。直到 1990 年代，在染色體易脆症 (Fragile X Syndrome, FXS) 中一段極不穩定的 DNA 被發現，這段序列為 CGG 的核苷酸重複序列[12][13][14][15]，位於性染色體的中 X 染色體上的 FMR1 基因，其中的 5'端的非轉譯區 (5’untranslated 5.

(17) region) 中，此 CGG 的序列在一般的正常人當中含有大約 4~55 次的重複，然而在患有染色體易脆症的病人中，重複的長度可以長達 200 次以上，而造成人體中的 FMRP 蛋白質無法被順利的轉譯出，因而造成疾病，且在子代患者的基因中，重複序列的次數比親代患者來得長，造成子代的發病年齡更早，病情更為嚴重。染色體易脆症的成因被發現後的一兩年間，亦於強直性肌肉失養症第一型的患者當中發現了不尋常的重複序列，其中，第一型的強直性肌肉失養症患者在第 19 對染色體上被發現了 CTG 的重複序列[16][17]，和染色體易脆症相同，也在子代患者的基因中發現了重複次數較親代患者長的情形。染色體易脆症以及強直性肌肉失養症這類型的疾病被統稱為的三核苷酸重複序列擴張疾病 (Trinucleotide repeat disorder)，此類型疾病成因的發現，使得人類對早現遺傳疾病有更深入的了解。其後，除上述的因 CTG 造成的強直性肌肉失養症以及染色體易脆症的 CGG 重複序列所造成的三核苷酸重複序列擴張疾病之外，其它的三核苷酸重複序列擴張疾病也在其他疾病中陸續地被發現，例如 CAG 重複序列所造成的亨丁頓跳舞症 (Huntington disease) 以及脊隨小腦萎縮症 (Spinocerebellar Ataxia, SCA) 第 1、2、 3、8、12 型。如表一所示，即使同樣為 CAG 重複序列造成的疾病，重複序列所在的位置，可能會出現不同的種類的病徵。大致而言，重複序列的位置若是大量於編碼區 (coding region) 出現，可能會造成最終轉錄出的蛋白質功能被改變、或不完整，若出現的位置於非編碼區 (non-coding region)，可能會抑制其後段基因的表達，進而阻礙蛋白質的生成。除三核苷酸重複序列擴張疾病之外，因 CCTG 四核苷酸重複序列所造成的強直性肌肉失養症第二型 (Myotonic Dystrophy type 2, MD2)、因 ATTCT 五核苷酸重複序列脊隨小腦萎縮症第十型 (Spinocerebellar Ataxia type 10, SCA10) 以及因 GGGGCC 六核苷酸重複序列造成的肌萎縮性脊髓側索硬化症以及額顳葉癡呆症也陸續地被發現。這些不同數目的核苷酸重複序列疾病亦同樣具有前述早現遺傳的特徵，表一中整理了在正常人與病患基因序列中重複數量的比較表。 6.

(18) 表一、核苷酸重複序列疾病比較表。摘錄自參考資料[18]。. 1.2.2 核苷酸重複序列的二級結構與擴張現象自從發現了造成前述的各類疾病都和基因中含有大量的重複序列相關之後，針對核苷酸重複序列的研究隨後紛湧而至。其中，研究指出重複序列的擴張和 DNA 二級結構的中間體有關，因 DNA 二級結構的中間體在 DNA 進行複製 (replication)、重組 (recombination)、修復 (repair) 等時形成，造成的不穩定性，進而造成重複序列的擴張，因此此處先針對特定重複序列可能形成的二級結構作探討。其中，可能形成的二級結構依重複序列的種類不同而分成幾種類別，如圖三所示，(CNG)n 序列 (N 可能為 A、T、C、G 任一鹼基) 易形成類髮夾結構 (hairpin-like structure)，(CGG)n 序列易形成 G-四聯體結構 (G-quadruplex structure)。 (CTG)n‧(CAG)n 的雙股 DNA 中也被發現可能產生在不同的兩個位置產生類髮夾結構，雖然熱力學上較穩定的狀態應為 (CTG)n‧(CAG)n 的雙股結構，但若在動力學下一旦形成了兩個類髮夾結構，就不易解開再重新形成雙股結構。在 H-DNA 和 stick-DNA 中的 (GAA)n‧(TTC)n 的重複序列被發現了分子內的三股螺旋結構。而造成脊隨小腦萎縮症第十型的 (ATTCT)n‧(AGAAT)n 重複序列中被發現了有 7.

(19) 較強的解旋力，無法形成穩定的 Watson-Crick 鹼基配對，而形成解旋結構 (unwinding structure)[19]。. 圖三、重複序列可能形成. DNA 二級結構。摘錄自參考資料[19]。. 因核苷酸序列的擴張現象被發現在未分裂的細胞中或是分裂的細胞中都有發生，這其中隱含的意義為在染色體複製或染色體修復、重組時，序列擴張的現象都可能發生。此處探討研究 DNA 在複製、修復、重組中可能發生擴張的機制。 DNA 序列擴張的時候必須經過兩個步驟，首先為成環 (loop formation)，再者為環的導入 (loop incorporation)[20]。由前所述，DNA 在複製、修復、重組都可能有擴張的現象，此處以 DNA 複製的過程作為代表，解釋目前的研究針對成環機制的理解。如圖四所示，當 DNA 在進行複製的過程當中，需要藉助圖中標示為藍色三角形的解旋酶 (Helicase) 將雙股 DNA 解旋形成複製叉 (replication fork)，再由 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 進行複製，DNA 聚合酶在複製時，必須符合在親代 DNA (parental DNA) 上從 3’端至 5’端的方向性進行。由於必須符合方向性，在親代 DNA 上的複製方向就有其限制性，如圖五所示，在上端的一股中只有一條較長的紅色箭頭，表示在此側的 DNA 聚合酶的行進方向和解旋方向是一致的，稱為領先股 8.

(20) (leading strand)，而最後下端有兩條較短的紅色箭頭，此股 DNA 聚合酶的行進方向和解旋方向相反，稱為延遲股 (lagging strand)，由於延遲股所生成的 DNA 為較多的片段，生成一系列的 DNA 小片段被稱為岡崎片段 (Okazaki fragments)。. 圖四、DNA 解旋酶及聚合酶進行複製的過程。摘錄自參考資料[21]。. 圖五、DNA 聚合酶複製時行進方向與岡崎片段的產生。摘錄自參考資料[22]。而在複製的過程中如何成環的研究中認為，當 DNA 聚合酶在領先股上遇到 TNR 位點 (Trinucleotide Repeat site) 時，會形成聚合酶停滯 (polymerase stalling)，如圖六中 Aa 的灰點，而延遲股端的 DNA 聚合酶能如綠色線條中順利複製。在 Ab 圖中，為了讓複製能繼續進行，複製叉會先倒退形成四股交接 (four-way junction)，此結構也被稱為雞腳結構 (chicken foot structure)，並且在此時因領先股的 DNA 聚合酶仍然無法前進，在嘗試前進的過程當中一但延遲股端複製出的新的一股 DNA 形成較大的二級結構，此複製中的 DNA 便會發出求救訊息，並 9.

(21) 引發跨損傷聚合酶 (Translesion Polymerase, TLP) 的生成，在 Ac 圖中，此 TLP 生成之後會利用延遲股端複製出新的一股 DNA 進行複製，並跨越 TNR 位點，而在跨越之後 DNA 聚合酶就會重啟作用，繼續進行 DNA 複製。而在此過程當中，雖現今仍無法解釋為何 TLP 到底進行了何種機制而跨越 TNR 位點，但延遲股端因為這種跨越的現象，而在複製的過程中擴張了一段成環的序列。. 圖六、DNA 複製過程中遇到 TNR 時可能造成擴張的原因。摘錄自參考資料[22]。而序列擴張的第二步驟為環的導入，如圖七所示，最上端說明在錯配修復 (Mismatch Repair, MMR) 的機制之下，應能正確地將因成環作用形成紅色的環修復成右上側無變異的雙股 DNA，然而若是因環狀結構過於穩定而造成修復失敗，就可能造成環的導入。目前解釋環的導入有三種可能的模型，第一種為在進行分裂的細胞 (dividing cell) 當中，若是 DNA 直接進入下一個循環的複製，這種條件下若是正常進行而無形成其他新環的結果，會有兩條雙股 DNA 的生成，其中. 10.

(22) 一條為正常長度的 DNA，而另一條則為多了一段擴張序列的 DNA。而第二、三種模型都是在未分裂的細胞 (non-dividing cell) 中，和 DNA 修復蛋白 MSH2MSH3 (MutS homologue2-MutS homologue3) 正常修復機制 (canonical mismatch repair)相關，圖中央的具有活性的 MSH2-MSH3 會和環形成作用力，接著引來正常修復機制所需的蛋白，將成環對側的雙股切開而形成單股缺口 (single strand break)，並引來聚合酶進行填補合成 (gap-filling synthesis)。而最後一種模型雖然也有 MSH2-MSH3 的參與，但這些研究主張此處的 MSH2-MSH3 應是不具有活性，而是引發非正常修復機制 (non-canonical mismatch repair) 而造成環的導入 [20]。. 圖七、DNA 於修復時發生環的導入而造成序列擴張的三種可能機制。摘錄自參考資料[22]。 1.3 G-四聯體 (G-quadruplex). 1.3.1 G-四聯體簡述 G-四聯體為單股 DNA 中，鹼基富含鳥嘌呤的序列 (Guanine-rich sequence) 11.

(23) 可能會在特殊的環境之下，折疊成的一種 DNA 二級結構。在 DNA 雙股螺旋結構尚未被解出之前，Bang 於 1910 年發現高濃度 (25.0 mg/ml) 的單磷酸鳥苷 (5’Guanylic acid) 在 pH=5 時能形成非常黏稠的液體，並在降溫之後形成透明的凝膠狀，當時雖然無法解出單磷酸鳥苷形成了什麼構形，但他認為單磷酸鳥苷應該並非以單體的形式存在[23]。1962 年，被 Gallert 的團隊同樣對此凝膠狀物進行研究，他們量測凝膠的旋光性，並使凝膠乾燥，以 X 光繞射的方式解出單磷酸鳥苷可以四聚體的方式形成螺旋結構 (helix structure)[24]，這種平面結構後來被稱為 G-平面四方結構 (G-quatet)。. 圖八、Gallert 提出的單磷酸鳥苷凝膠中鹼基對的排列而成的 G-平面四方結構結構。摘錄自參考資料[24]。 1972 年，Miles 發現單磷酸鳥苷在 pH=7~8，並且含有鈉離子的條件下，G平面四方結構也可能形成[25]，並且他與 Becker 合作發現這個結構在核磁共振光譜的時間尺度下，氫鍵的變化速度不快，他們也測試了鹼金族其他的陽離子，發現鈉、鉀、銣離子存在的情況之下有 G-平面四方結構生成，而鋰或銫離子中沒有特殊的結構的產生[26][27][28]。而在 1990 年代，研究的興趣漸漸轉向 G-平面四方結構在生物體內的影響，在單股 DNA 中形成的 G-平面四方結構如圖九所示，由兩個以上的 G-平面四方結構堆疊而成，此結構稱為 G-四聯體 (Gquadruplex)，其中，線的箭頭代表了 DNA 5’端至 3’端的方向性。在 DNA 形成 G四聯體的結構時，其內部鹼基的氫鍵並非在雙股螺旋中所知的 Watson-Crick 鹼基 12.

(24) 配對，而是如圖九左側的四個鳥嘌呤 (Guanine) 之間產生氫鍵，稱為 Hoogsteen 鹼基配對。. 圖九、G-平面四方結構以及 G-四聯體。摘錄自參考資料[29]。如前段所述，單磷酸鳥苷在部分鹼金族的陽離子當中有 G-平面四方結構的產生，其中，鈉與鉀離子為生物體中常見的鹼金族陽離子，許多研究也指出鈉與鉀離子能夠穩定並幫助特定的 G-四聯體產生，G-四聯體中間有離子通道 (ion channel)，陽離子在通道中的作用為分散鹼基中的電子密度。此外陽離子也可能在 G-四聯體的環上分散 DNA 骨架 (backbone) 上的負電荷，因此陽離子的存在對於穩定 G-四聯體的生成扮演重要的角色。其中鈉與鉀離子在離子通道間的位置也和離子大小有關，鈉離子的半徑約為 0.95Å，而鉀離子半徑約為 1.33Å，圖十中顯示在 d(GGGGTTTTGGGG) 形成的 G-四聯體中，鈉、鉀離子分別位在平間上與平面-平面之間中間以穩定 G-四聯體結構[30]。. 13.

(25) 圖十、d(GGGGTTTTGGGG)形成的 G-四聯體與鉀、鈉離子相對位置示意圖，紅球為鉀離子，綠球為鈉離子。摘錄自參考資料[30]。. 1.3.2 G-四聯體的特性目前被發現能穩定存在的 G-四聯體的種類有很多，因此本節針對一些已知結構的 G-四聯體探討其分類的方法。首先，如圖十一的第一列所示，G-四聯體可因 DNA 數量被分類為單體 (monomer)、二聚體 (dimer) 以及四聚體 (tetramer)，再來，如第二列所示，可依 DNA 行進的方向性分為平行 (parallel)、反平行 (antiparallel) 或混和型 (mixed)，進入 G-四聯體結構的 DNA 方向性皆為由下至上者稱為平行結構，而依上、下、上、下順序進入 G-四聯體結構者稱為反平行結構，皆非平行、反平行者稱為混合型。在 G-四聯體結構中 G-平面四方結構以外的 DNA 被稱為環 (loop)，如圖十二中 a 圖的環的類型為螺旋形 (propeller)，b 圖為側面型 (lateral) 而 c 圖為對角型 (diagonal)。環的長短，會影響 G-四聯體的穩定性以及容易形成 G-四聯體的種類。在一般文獻當中，G-四聯體中鹼基與五碳糖的立體位向通常也會在文獻中標明，如圖十三，鹼基中的 N4 與五碳糖的 C1’鍵結稱為糖苷鍵 (glycosidic bond)，其鍵角 χ 算法為計算 O4-C1’與 N4-C8 的夾角，可依照鍵角將位向分為 syn 與 anti。通常在文獻中已被解出的 G-四聯體會依顏色區分每個平面上的鹼基，和其本身骨架上五碳糖的夾角關係。 14.

(26) 在前一節提到陽離子可能進入 G-四聯體中的離子通道中，並穩定其構形，有些研究也針對相同 DNA 序列的而可能產生不同的 G-四聯體構形探討成因。以圖十四的研究為例，d[AGGG(TTAGGG)3]的序列中，在鈉離子的條件之下會如圖的最右側形成一種混合型的結構，若將環境加入為鉀離子的條件之下，其 G-四聯體構形則可能在兩個混合型之間轉換，而研究也指出，此序列在鈉離子的條件之下加入為鉀離子，G-四聯體構形快速地轉換成含有鉀離子的兩個混合型，也代表了此二結構的穩定性都較含有鈉離子的單一混合型來得穩定[35]。. 圖十一、G-四聯體 DNA 數量、行進方向、形成的序列以及穩定此結構的金屬離子對照表。摘錄自參考資料[31]。. 圖十二、G-四聯體中環的種類。摘錄自參考資料[32]。. 15.

(27) 圖十三、鹼基與五碳糖間 syn 與 anti 位向關係。摘錄自參考資料[33][34]。. 圖十四、環境中含有鈉、鉀離子時 d[AGGG(TTAGGG)3] 序列的構形變換。摘錄自參考資料[35]。. 1.3.3 (GGGGCC)n 中的 G-四聯體在 1.2 節中，探討重複序列的可能發生的擴張的機制，和序列可能形成二級結構緊密相關，因此為了探討 (GGGGCC)n 在 C9orf72 基因中可能擴張的機制，就必須了解 (GGGGCC)n 可能形成的 DNA 二級結構，Zhou 的團隊研究 d(G4C2)、 d(G4)、d(G4C2)2、d(G4C2)3、d(G4C2)4 和 d(G4C2)5 於鉀離子溶液中作圓二色光譜 (Circular dichorism) 的測量，圓二色光譜是利用左旋光的和右旋光的吸收度的不同，為一種常用於測定具有旋光性物質的工具。而 G-四聯體中特徵的吸收峰如表二所示，若 G-四聯體為平行結構，會在 240nm 與 265nm 分別有負與正的. 16.

(28) 特徵峰，若為反平行結構，則會在 265nm 與 290nm 分別有負與正的特徵峰。而在此研究中發現除 d(G4C2)4 之外，其他序列都容易形成非單體的結構，並且構形以平行以及混合型為主，但 d(G4C2)4 是較明顯的單體之外結構圓二色光譜的測量結果為反平行結構 (圖十五)，因而利用核磁共振對 d(G4C2)4 的 G-四聯體進行研究，如圖十六所示，d(G4C2)4 容易形成由四層 G-四方平面結構堆疊而成且為 chair-type 的反平行結構 (圖十六) [36]。. 表二、G-四聯體在圓二色光譜測量中的特徵峰。. 圖十五、d(G4C2)、d(G4)、d(G4C2)2、d(G4C2)3、d(G4C2)4 和 d(G4C2)5 序列於圓二色光譜下的測量結果。摘錄自參考資料[36]。. 17.

(29) 圖十六、(GGGGCC)4 形成的 G-四聯體結構。摘錄自參考資料[36]。. 1.4 研究動機肌萎縮性脊髓側索硬化症與額顳葉癡呆症的共伴現象與(GGGGCC)n 序列的擴張是近期研究對兩個疾病較新的認識，與其它類型的因重複序列擴張而造成的疾病相同的是，對於其擴張機制仍然未知。在研究其擴張機制時，DNA 序列在複製、修復、重組的過程當中產生了何種較穩定的中間體，其二級結構有足夠的穩定性並可以影響到複製酶、修復蛋白或是重組酶的作用。其二級結構在不同鹽類、溫度的環境中，存在何種可能的，及其結構之間的變異性，我們期待藉由單分子螢光共振能量轉移 (single-molecule Fluorescence Resonace Enerygy Transfer, smFRET) 的技術，觀察 (GGGGCC)4 由已知的結構，再向不同次數的重複序列發展，研究並分析以得到其二級結構相關的熱力學、動力學或動態學的資訊。. 18.

(30) 第二章、實驗儀器與方法. 2.1 實驗儀器與原理. 2.1.1 單分子螢光共振能量轉移單分子實驗 (single-molecule experiment) 透過對單一分子的研究而了解分子微觀下的特性，和整體實驗 (ensemble experiment) 的不同之處，在於整體實驗觀察所有分子共同表現出的現象，而得到平均的資訊。單分子實驗能觀察每個分子在特定時間下的狀態，進而得到分子動力學、動態學的資訊。以圖十七為例， Ra 與 Rb 為核醣體，Ra 與 tRNA 進行交互作用而產生構形改變而最終形成 Rb，就單分子螢光共振能量轉移 (single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer, smFRET) 的數據而言可以看出某一個分子 Ra 在轉變成 Rb 的過程當中，經過了 R‧tRNA1、R‧tRNA2、R‧tRNA3 三種中間態 (圖十七 c)，並可以藉由觀察大量分子並將數據統計而得到在每個時間下 Ra、Rb、R‧tRNA1、R‧tRNA2、 R‧tRNA3 的消長情形 (圖十七 d)，就整體實驗而言，最左側的圖示了整體的 EFRET 值變化與時間的關係圖 (圖十七 b)，就這張圖而言，我們很難以了解到 Ra 到 Rb 經過了三個中間態，並且無法藉由每個分子構形在時間下的變化得到動力學、動態學的資訊。. 圖十七、整體實驗與單分子實驗數據的比較。摘錄自參考資料[37]。. 19.

(31) 目前單分子實驗的種類大約分成兩種類型，第一種為以螢光為基礎的方法 (fluorescence-based)，此種方法在欲研究的分子上標記螢光分子，藉由偵測螢光了解分子內部的行為或位置等資訊，其中常用的顯微鏡有共軛焦螢光顯微鏡 (confocal fluorescence microscopy) 或是全內反射式螢光顯微鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope, TIRFM)。而另一種常見的為以力為基礎的方法 (force based)，藉由在研究的分子上黏上微米尺度的小球，藉由對小球施力而操控分子，可以了解生物分子中與力或能量相關的資訊，常見的如光鉗 (optical tweezers)、磁鉗 (magnetic tweezers)、原子力顯微鏡 (Atomic Force Microscopy, AFM) 等。本實驗使用單分子螢光共振能量轉移，是以螢光為基礎的技術，將欲研究的分子在兩個位置上標記供體 (donor) 以及受體 (acceptor) 兩種類型的螢光分子，藉由兩者間能量的傳遞效率，測量空間中兩點的直線距離，藉此了解分子因形成不同構形，而產生在某兩點間距離的變化，可謂一把奈米等級的尺。螢光的原理及能量轉換的時間尺度如圖十八所示，以雷射激發供體螢光分子，使其電子從基態 (S0) 躍遷至激發態 (S1 或 S2) (綠色直線)，經振動緩解 (vibrational relaxation) 以及內轉換 (internal conversion) 回到 S1 的最低振動態後 (黃色曲線)，此電子可能部分回到基態而放出螢光 (紅色直線)，也有部分的能量經由螢光共振能量轉移的方式轉移給受體螢光分子，當供體螢光分子與受體螢光分子的距離較小時，傳遞效率較高，反之則較低，而螢光共振能量轉移效率的定義和與距離的關係如下式所示 : 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 = 𝐼. 𝐼𝐴 𝐴 +𝐼𝐷. =. 1 1+(. 𝑅 6 ) 𝑅0. (式 1). 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 ：螢光共振能量轉移效率。 𝐼𝐴 、𝐼𝐷 ：受體、供體螢光分子放出的螢光強度。 R：受體、供體染料分子間距離。 𝑅0 ：Förster distance。螢光共振能量轉移效率為 50%時兩螢光分子的距離。. 20.

(32) 以最廣泛運用的 Cy3-Cy5 染料分子對為例，由此式可作出如圖十九所示的 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 − 距離的關係圖，此方法靈敏的範圍介於約 3-8 nm 之間。螢光共振能量轉移效率是利用螢光分子間的偶極-偶極交互作用 (dipoledipole interaction)，公式中與螢光分子之間距離成六次方反比主要是受到此影響。由於偶極為向量，能量若是要能順利的傳遞，供體、受體螢光分子的偶極矩向量夾角不能垂直。再者，能量能順利傳遞還需供體螢光分子的放射波長 (emission wavelength) 區域與受體螢光分子的激發波長 (excitation wavelength) 有部分重疊 (圖二十)，才可能發生能量轉移。. 圖十八、螢光共振能量轉移原理。摘錄自參考資料[38]。. 21.

(33) 圖十九、供體與受體螢光分子之螢光共振能量轉移效率與分子間距離關係圖。摘錄自參考資料[39]。. 圖二十、供體螢光分子 (Cy3) 與受體螢光分子 (Cy5) 的放射波長、激發波長示意圖。摘錄自參考資料[38]。. 22.

(34) 2.1.2 全內反射螢光顯微鏡全內反射螢光顯微鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope, TIRFM) 為本研究主要使用的研究儀器。光因在不同介質中行進速度不同，造成光從一介質進入另一種介質時產生偏折的現象，當光線由速度較慢 (折射率較大、光密) 介質進入速度較快 (折射率較小、光疏) 介質時，光線會偏離法線如圖二十一左側所示，其折射率與角度的關係可以司乃爾定律 (Snell’s law) 表示 n1 sin θ1 = n2 sin θ2，當入射角θ > 臨界角θC 時就會產生如圖右側全反射的現象，亦即折射現象的消失。. 圖二十一、全反射示意圖。摘錄自參考資料[40]。但當入射角θ > 臨界角θC 時並非所有能量傳遞都會消失，如圖二十二(a) 所示，全反射發生的光疏介質處會產生一個漸逝波 (evanescent wave)，而此漸逝波的強度隨進入的深度越深強度成指數衰退，用以激發供體螢光分子的能量就從此漸逝波而來，而漸逝波可穿越光疏介質的平均深度約為 100nm 深。全內反射螢光顯微鏡的架設如圖二十二(b) 所示，激發光源的使用配合供體 (Cy3) 與受體 (Cy5)，分別為波長 532 nm (綠光) 與 638 nm (紅光) 的雷射光源，光源由漸逝場傳遞給螢光分子，經物鏡 (objective) 收集，並以濾鏡 (filter) 過濾。圖中的狹縫、透鏡組、雙色鏡與反射鏡等元件稱為雙視 (dual view) 光學元件組，用途為將供體及受體放出的光分開，並能進入電子放大式電荷耦合元件 (Electron Multiplied Charged Coupled Device，EMCCD) 中同時觀察[39]。. 23.

(35) 圖二十二、全內反射螢光顯微鏡原理以及架設。摘錄自參考資料[39]. 2.2 實驗器材與樣品置備. 2.2.1 實驗用玻片前處理 (一) 載玻片、蓋玻片的清理載玻片 (25mm*76mm)，於各兩面打四個小洞，作為樣品注入口。將玻片表面以甲醇清洗擦拭，再以使用濃硫酸和雙氧水體積比 3:1 的混和溶液浸泡，以清水沖洗乾淨，浸泡熱水之後，以高溫火焰將表面有機物質移除，再以電漿清洗機清洗五分鐘，放置於裝有丙酮溶液的染色壺中。乾淨的蓋玻片 (24mm*40mm) 亦存放於丙酮溶液染色壺中。將兩個染色壺以超音波震盪 30 分鐘，取出載玻片及蓋玻片以超純水沖淨，再將其置於裝有 3M 氫氧化鉀的溶液當中再將兩個染色壺以超音波震盪 30 分鐘再取出載玻片及蓋玻片以超純水沖淨，以氮氣沖乾。 (二) 玻片表面的修飾將上一步驟中洗淨的載玻片及蓋玻片置於含有甲醇、醋酸、氨基矽烷 24.

(36) (aminosilane) 混合溶液的染色壺中進行反應 10 分鐘，以超音波震盪一分鐘之後再繼續靜置 10 分鐘，取出以甲醇沖淨。配製聚乙二醇 (mPEG-SVA, 分子量 5000)，生物素-聚乙二醇 (Biotin-PEGSVA) 以大於 40 : 1 的比例混合後，溶於 100mM 碳酸氫鈉溶液中，混合均勻後使用冷凍離心機 (10000rpm, 25◦C, 2min) 沉降懸浮物，此處生物素-聚乙二醇的用於結合中性抗生物素蛋白 (NeutrAvidin)，再利用中性抗生物素蛋白接上欲研究的 DNA 序列，在此處，接在玻片表面上的聚乙二醇與生物素-聚乙二醇的比例極大，以確保在玻片上的生物素-聚乙二醇距離夠遠，能觀察到的 DNA 為單分子的現象。將溶液加在載玻片上中心實驗區域，蓋上蓋玻片時避免氣泡產生，至於容器中 4 小時等待完成修飾，容器中含水以確保載玻片及蓋玻片中溶液不會揮發至乾燥，修飾完成的玻片的化學結構如圖二十三所示，完成後用超純水沖洗乾淨直到疏水性出現，再用氮氣吹乾後放置-20oC 冰箱保存。. 圖二十三、玻片修飾後的化學結構。摘錄自參考資料[41]。. (三) 組裝實驗樣品槽將載玻片的修飾面依圖二十四(b)所示黏上雙面膠將通道隔出，蓋玻片的修飾面朝下覆蓋，並將兩側以環氧樹脂 (epoxy) 封緊，完成後形成四個可注入實驗樣品的通道。. 25.

(37) 圖二十四、載玻片與蓋玻片的組裝。摘錄自參考資料[41]。. 2.2.2 DNA 的設計本節將就如何設計實驗所使用的 DNA 將分成主要研究序列以及形成雙股螺旋 DNA 的「把手」序列而分成兩個部分討論，最後在第三部分討論此兩段序列的黏合反應 (annealing reaction)，實驗所使用的 DNA 序列皆於表三中列舉， DNA 的示意圖如圖二十五所示。 (一) 主要研究序列，以 (GGGGCC)n 命名此一系列以 (GGGGCC)n 命名的序列為單股 DNA，實際的序列於表三中列舉，為前端 18 個核苷酸序列加本研究主要的 (GGGGCC)n 序列而組成，在圖中以上端較長的 DNA 表示。 (二) 雙股螺旋 DNA 作為「把手」如圖中左側以階梯表示的雙股 DNA，是由主要研究序列的前端 18 個核苷酸序列加上 Poly-Cy5，此剛好皆符合 Watson-Crick 鹼基配對而形成互補的兩條單股序列所組成的雙股 DNA，此雙股螺旋不影響主要序列結構的形成。Poly-Cy5 的 3’端有生物素-聚乙二醇的標記，在與欲研究的主序列黏合之後可將序列固定至玻片表面上的 NeutrAvidin 上，此外，18 個核苷酸的雙股序列亦可幫助在研究主序列時不會因距離表面太近而影響分子結構形成的阻礙。 (三) 染料的標記本實驗使用的供體為 Cyanine3 (Cy3)，受體為 Cyanine5 (Cy5)。如圖二十六所示。供體的標記位置在主序列的 3’端最後一個核苷酸的位置上，首先將最尾端的核苷酸上修飾上六個碳的氨基 (NH2C6)，再與 Cy3 NHS ester 行交聯反應 (cross-linking reaction)，將 Cy3 標記於 3’端的最後一個序列上，利用含有六個碳. 26.

(38) 的氨基的好處是，Cy3 的分子不會直接接在 DNA 的磷酸根上，而能以距離約 2nm 遠的長度接在 DNA 的尾端，不會影響到主要序列的構形，此外，在六個單鍵的碳連接之下，Cy3 可旋轉，偶極矩不會被鎖定在特定角度，與 Cy5 相對的位相能夠隨機分布。受體 Cy5 染料標記於 Poly-Cy5 的 5’端序列第七以及第八個核苷酸骨架上的磷酸根上，如圖二十七所示，接點有兩個，使得 Cy5 無法自由旋轉。. 圖二十五、核酸序列以及標誌物的設計。修改自參考資料[44]。. 圖二十六、Cy5 與 NH2C6 形成的交聯反應。修改自參考資料[42]。. 圖二十七、Cy5 結構及與核苷酸連接的位置示意圖。摘錄自參考資料[43]。 (四) 黏合反應. 27.

(39) 黏合反應的目的為將標記完成的主要序列與 Poly-Cy5 中互補的 18 個序列形成 Watson-Crick 鹼基配對，使用的配方為 3μL 濃度約為 1μL 100μM 的主序列 DNA、1μL 100μM Poly-Cy5 DNA 與 16μL 的 1M Tris 及所需的氯化鉀，以溫度梯度熱循環反應儀 (Thermal cycler) 加熱至 95℃維持 6 分鐘，再以-1℃/min 的速率降至 22℃，使兩互補序列黏合，最終黏合的濃度為 5μL 的 DNA，過量的未反應主序列 DNA 由於無生物素的標記，無法與表面結合，在沖進緩衝溶液時會被移除。. 序列名稱. 寡核苷酸主序列與修飾氨基(5’→3’). (GGGGCC)3. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. (GGGGCC)4. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. (GGGGCC)5. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. G52A. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GAG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. G53A. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GAG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. (GGGGCC)6. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. (GGGGCC)7. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. (GGGGCC)8. TGG CGA CGG CAG CGA GGC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC GGG GCC /NH2C6/. PolyCy5. GCC TCG C/iCy5/TG CCG TCG CCA - biotin 表三、本研究所使用的所有 DNA 序列. 28.

(40) 2.2.3 顯像緩衝溶液在 2.1.1 節中探討了螢光共振能量轉移的原理，但在實際的測量狀況中，螢光常會發生閃爍 (blinking) 或是光漂白 (photobleaching) 的現象，影響螢光的正常釋放，影響實驗的正常進行。圖二十八為螢光以及發生光漂白以及閃爍的原理，電子在被激發至單重態激發態的過程約經歷 10-15 秒，內轉換或振動緩解時間尺度介於 10-14-10-11 秒間，回到基態而發出螢光費時 10-9-10-7 秒，依此時間尺度而言，整個螢光的過程能在 10-9-10-7 秒間完成，而重複地循環這個過程發出足夠量的光子，但電子在經歷內轉換或振動緩解之後可能會產生激發態電子自旋反轉，從單重態轉換成三重態，此現象稱為系統間跨越 (intersystem crossing)，雖然這個路徑發生的數量較少，但若發生電子就會必須經由放出磷光 (phosphorescence) 由於放出磷光的過程為三重態的激發態回到單重態的基態，為禁止躍遷 (forbidden transition)，以至於這個過程非常的緩慢，約花費 10-3-10-2 秒才能產生磷光 (phosphorescence) 回到基態，再重新進入循環。進入三重態的電子也可能再經歷一次系統間跨越回到單重態而放出延遲螢光 (delayed fluorescence)。上述兩種過程都造成了螢光放出的時間被減緩，單位時間放出的光子量甚低因此可視為暗態，而時常發生就會造成閃爍，也就是螢光放出亮度不穩的現象。另外，光漂白的現象為當電子進入三重態之後，螢光分子的化學活性增強，而變得容易與氧分子反應，反應後三重態的氧分子被激發為單重態，而進一步形成超氧陰離子，使得螢光分子無法再發光，此反應亦會有具生物毒性的物質產生。基於上述理由，在螢光共振能量轉移的實驗中，顯像緩衝溶液 (image buffer) 中必須包含一種三重態淬滅劑，使長時間停留在三重態的螢光分子回到單重態基態，再使用酵素型除氧系統 (Enzymatic oxygen scavenging system) 將環境中的氧氣去除，進而減少閃爍以及光漂白的現象，接下來分別說明三重態淬滅劑與酵素型除氧系統的配方。. 29.

(41) 圖二十八、螢光原理以及各能量轉移過程的時間尺度。摘錄自參考資料[45]。. (一) 三重態淬滅劑就先前的研究而言，去除三重態的機制中包含一個先經還原再氧化的機制 (reduction-oxidation mechanism)，所以 Trolox 作為三重態淬滅劑，若有其氧化態的 Trolox quinone 存在時，去除三重態的效率會較佳[46]，在配置 Trolox 時將其加入 Tris 緩衝溶液中，離心管中震盪約 30 分，溶液配置完成後溶液以 0.22μm 過濾膜過濾後，置於 37oC 之下約 12-18 小時，使其反應生成 Trolox quinone，之後以遮光保存於 4oC 冰箱中，以增強三重態淬滅劑的效果。. 圖二十九、Trolox 在含氧的環境下照光氧化為 Trolox quinone。摘錄自參考資料 [46]。. 30.

(42) (二) 酵素型除氧系統 (Enzymatic oxygen scavenging system) 如上所述，酵素型除氧系統的功用為去除環境中的氧分子，常見的酵素型除氧系統有兩種類型。有葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統 (Glucose Oxidase and Catalase, GOC) 、兒茶酸 -3,4- 雙加氧酶系統 (Protocatechuate-3,4-Dioxygenase, PCD)，以及吡喃糖氧化酶-過氧化氫酶系統 (Pyranose Oxidase and Catalase, POC)。圖三十中針對葡萄糖氧化酶、兒茶酸-3,4-雙加氧酶、以及吡喃糖氧化酶作為試劑消耗氧氣所需反應物，以及之間生成酸的莫耳數比較，以及圖三十一所示，環境中間 pH 值隨時間的下降關係[47]。此外，由於氧氣正常狀態為三重態，若是和螢光分子的三重態 (triplet state) 反應會被激發為單重態 (singlet state) 的氧分子，過氧化氫酶的加入的目的為將單重態的氧分子去除，以免其進一步造成光漂白或產生細胞毒性的產物。本實驗中所使用的除氧系統為 GOC 與 POC 系統，在兩個系統中皆需以葡萄糖做為反應物以消耗氧氣，GOC 系統在反應中造成環境中 pH 值下降較大，pH 的下降除造成螢光分子的不穩定之外，對於實驗中 DNA 的結構亦會有影響，因此不適合用於長時間的測量，由於這個情形可以在 POC 系統下被解決，因此在長時間的實驗中皆改以 POC 系統作為除氧系統。. 圖三十、各除氧系統和氧氣反應並生成酸的比例。摘錄自參考資料[47]。. 31.

(43) 圖三十一、各除氧系統條件下 pH 值對時間的改變。摘錄自參考資料[47]。 (三) 緩衝溶液由於在除氧系統中，可能造成環境中 pH 值的下降，所以加入 Tris (2-Amino2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) 作為緩衝溶液，Tris 共軛酸的 pKa 值為 8.07，常在生化或細胞實驗當中作為緩衝溶液，在溶液中 pH 介於 7.1-9.1 都有足夠有效的緩衝效果，而本實驗欲將環境 pH 值維持於 7.7-7.9 之間，因此適合使用 Tris 溶液作為緩衝，使用的最終濃度為 20mM，而配方詳見表四。. 顯像緩衝溶液 (GOC 系統). 顯像緩衝溶液 (POC 系統). 藥品. 緩衝溶液中濃度. 藥品. 緩衝溶液中濃度. Trolox. 1.55 mM. Trolox. 1.55 mM. D-Glucose. 0.5 (w/w). D-Glucose. 0.5 (w/w). Glucose oxidase. 165 unit/mL. Pyranose oxidase. 2.7 unit/mL. catalase. 2170 unit/mL. catalase. 90 unit/mL. +. +. Na /K ions Tris buffer. +. 0-150 mM. +. Na /K ions. 20 mM Tris buffer 表四、顯像緩衝溶液的最終濃度。. 32. 0-150 mM 20 mM.

(44) 2.2.4 實驗方法與流程 (一) 將實驗樣品束縛於表面 (surface tethering) 為了將 2.2.2 中完成黏合反應的 DNA 置於玻片上進行研究，首先在玻片表面上注入抗生物素蛋白 (NeutrAvidin) 約兩分鐘，沖洗掉之後再將 DNA 樣品注入約兩分鐘，DNA 樣品中含有牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA) 以防 DNA 吸附於管壁造成濃度降低，再次沖洗，完成後樣品即如圖三十二所示被束縛在玻片表面，詳細的樣品濃度如表五所示。. 圖三十二、完成束縛於玻面表面的 DNA 樣品示意圖。摘錄自參考資料[44]。. 抗生物素蛋白 (NeutrAvidin). DNA 樣品. 藥品. 最終濃度. 藥品. 最終濃度. NeutrAvidin. 0.2 mg/mL. DNA Tris buffer BSA Na+ / K+ ions. 10 pM 1M 0.2 mM 0-150 mM. 表五、抗生物素蛋白以及 DNA 樣品的最終濃度。. (二) 以全內反射式顯微鏡進行短時間的影像觀測在使用全內反射式顯微鏡觀察前注入顯影緩衝溶液，DNA 樣品在全內反射式顯微鏡下，將電子放大式電荷耦合器偵測得的訊號以 smCamera 軟體記錄 (由 33.

(45) Taekjip Ha 團隊提供) 觀察圖像如圖三十三所示，分為左、右兩個畫面，同一條 DNA 在左側以及右側的相同位置中顯示，例如圖三十三中兩個紅色圈中的四條 DNA，左側為供體 (Cy3) 放出的螢光而右側為受體 (Cy5) 放出的螢光。每次短時間的拍攝記錄 30 幀 (frame) 的圖片，前 20 幀為以 532 nm 雷射激發 Cy3 染料，而後 10 幀以 638 nm 雷射激發 Cy5 染料用以檢查 Cy5 染料是否受到光漂白，將第 3-12 幀疊加並平均而得影像，並依每個分子的 ID 以及 IA 值計算當下的 EFRET 值，並蒐集大量的分子以利統計，取中間的影像平均可以避免快門以及雷射切換時造成的誤差，每幀曝光時間為 30 毫秒，考慮快門耗時，實際每幀花費時間為 31.75 毫秒。. 圖三十三、DNA 樣品在全內反射式顯微鏡的觀察圖像。. (三) 以全內反射式顯微鏡追蹤長時間分子 EFRET 值的軌跡除了短時間的影像觀測之外，我們亦使用長時間的影像錄製，並追蹤畫面下每個分子於每個時間點下的 ID 及 IA 值以計算 EFRET，在這個實驗中，我們每次的拍攝記錄 2000 至 4000 幀，每張長時間的影像觀測需耗時 1 至 2 分鐘，在此觀測模式下，我們僅以 532 nm 雷射激發 Cy3 染料，而計算供體逸漏的修正項直接由前述短時間影像觀測的實驗中取得。 34.

(46) (四) 恆溫實驗為了計算 (GGGGCC)4 所產生的構形其動力學的資訊，實驗架構中將與玻片有接觸的稜鏡及物鏡以電熱片加熱至 29-35oC 之間，以計算 DNA 構形在不同溫度下結構改變的狀態。. 2.4 數據處理與分析實驗所得的畫面，經由 IDL (Interactive Data Language, Exelis) 程序以校正相差並疊圖分析辨認螢光訊號位置[48]，並去除實驗中兩點以上距離過近的多分子聚集，能確保得到單點的定位，並且將 Cy3 以及 Cy5 的螢光強度、拍攝時間等資訊紀錄於檔案中，再用 Matlab (The Math Works, Inc.) 程序進行分析，得出每條 DNA 的 EFRET 值，並對每個分子依其螢光總強度 (total intensity) 做篩選，在 2.2.4 中有提及，拍攝時總共取 30 幀的影像，前 20 幀以綠光雷射激發 Cy3 染料，而後 10 幀以紅光雷射激發 Cy5 染料，圖三十四(a) 為以綠光激發的數據點作圖，橫軸為 EFRET 值而縱軸為螢光總強度，我們取其中兩條紅線中的點，因螢光總強度若過高，可能為 DNA 分子並非單體，有分子聚集的現象，並非我們欲得到的單分子資訊；螢光總強度若過低的數據，可能並非正常的螢光訊號。接著我們再如圖三十四(b) 將數據作篩選，圖中橫軸為以綠光激發而得的 EFRET 值而縱軸為以紅光激發而得的螢光總強度。在圖中左下角的聚集點中，其 EFRET 值及以紅光激發而得的螢光總強度過低，並在圖三十四(a)中有正常的螢光強度，所以這樣的數據點其意義為 Cy3 正常發光而 Cy5 染料並無發光，所以將此圖中紅線以下的數據點去除。再者，雖然這些點的 Cy5 染料並無發光，但經由綠光激發時偵測得到的紅光強度並非為零，此現象稱為供體逸漏 (donor leakage)，在圖二十中可見 Cy3 的放射波長與 Cy5 放射波長區段有小部分的重疊，此重疊使得在分光時有些 Cy3 放射出的螢光在經過分光鏡時被分到偵測紅光的區域，而此供體逸漏的現象在所有的螢光分子中都有發生，造成得到的所有數據中綠光較實際上弱，而 35.

(47) 紅光較實際上強，而導致 EFRET 值偏高，因此我們必須對 2.1.1 中 EFRET 值的算法作些微的修正如下： 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 =. 𝐼𝐴 −𝛼𝐼𝐷 𝐼𝐴 +𝐼𝐷. (式 2). 𝐼𝐴 、𝐼𝐷 ：受體、供體螢光分子放出的螢光強度。 𝛼：供體逸漏修正項我們藉去除這些 Cy5 沒有被激發但以綠光激發時紅光總強度卻不為零的分子，將此數據收集並作擬合 (fitting) 而得到供體逸漏修正項 𝛼 (圖三十四(c))，而在本實驗中，此修正項數值約為 0.2。篩選完的數據使用繪圖軟體 (Origin, OriginLab Corporation) 以直方圖 (histogram) 繪圖 (圖三十五)。在長時間分子的 EFRET 值軌跡分析中，如圖三十六所示，我們可得到 ID (綠線)、IA (紅線) 隨時間的關係變化，並將兩數值加總而得螢光總強度 (黑線)，再由上述式 2 計算 EFRET 隨時間的改變，以觀測 DNA 分子在不同時間下構形的改變狀況。在此分析中，為了除去因螢光分子不穩定的狀態而造成判斷 DNA 構形的偏差，我們首先將螢光總強度不為接近水平的軌跡圖去除，因此類軌跡圖代表著供體或受體的螢光產生閃爍的現象，或是有外來的發光物質造成干擾，再來我們將受體螢光強度降為零之後的軌跡圖移除 (圖三十七)，因此現象為受體經歷光漂白，而此處的計算出的 EFRET 値會特別高，並非真實因分子構形造成的現象。在得到長時間分子的 EFRET 值軌跡分析後，我們為了更有效地辨識分子的狀態，我們利用 Taekjip Ha 團隊開發的 HaMMy 擬合程式從長時間軌跡圖的許多雜訊中更精確地判定分子在某個時間下所處的 EFRET 値，如圖三十八所示，藍色線表示長時間軌跡圖中的 EFRET 値隨時間的變化，而綠色線為由 HaMMy 擬合程式計算出的分子在每個時間點下處在的狀態 EFRET 値，計算中設定的參數為左下角預設尋找的分子可能有的狀態數量 (number of states)，我們通常預設為 10 個狀態，並搭配 Baum-Welch 演算法進行計算[49]。. 36.

(48) 圖三十四、螢光分子的篩選以及供體逸漏校正。. 0.25. Frequency. 0.20. 0.15. 0.10. 0.05. 0.00 0.0. 0.2. 0.4. 0.6. 0.8. 1.0. EFRET 圖三十五、以直方圖 (histogram) 繪製所有分子的 EFRET 值相對數量統計圖。. 37.

(49) 圖三十六、追蹤分子在長時間下的供體及受體的螢光強度、兩者加總而得的螢光總強度以及 EFRET 隨時間變化的關係圖。. 圖三十七、長時間軌跡圖中，供體或受體表現不佳而需被移除的分子。. 38.

(50) 圖三十八、經 HaMMy 擬合程式計算長時間軌跡圖 EFRET 值隨時間變化的關係。. 39.

(51) 第三章、實驗結果與討論. 3.1 實驗設計由於 Zhou 的團隊已研究 (GGGGCC)4 形成的 G-四聯體結構，並了解其在鉀離子中產生的結構為 chair-type 的反平行結構。其詳細條件為將 0.1 mM 的單股 (GGGGCC)4 加熱至 95oC 15 分鐘，之後在含有 70 mM 的氯化鉀以及 20 mM 的磷酸鉀的緩衝溶液中 (pH=7) 長時間降溫之後做圓二色光譜或核磁共振的測量[36]。為了瞭解 (GGGGCC)n 可能的構形，以了解此序列在染色體中擴張時，可能產生的 DNA 二級結構，我們試著從已被解出的 (GGGGCC)4 著手研究，先建立 (GGGGCC)4 於 smFRET 下形成的 G-四聯體結構可測得的 EFRET 值，此外，我們也在研究時發現了，此序列在不形成 G-四聯體結構時可能摺疊形成類髮夾結構 (hairpin-like structure)，因此我們經由更換溶液的離子濃度、離子種類、G四股結構的配體、溫度等，觀察 G-四聯體隨環境變化而造成的結構改變及其熱力學、動力學、動態學的關聯性。. 圖三十九、實驗為了解 (GGGGCC)n 可能產生的 G-四聯體與類髮夾結構構形，並了解構形間的熱力學、動力學、動態學等關聯性。. 40.

(52) 3.2 (GGGGCC)4 結構鑑定為了解此 (GGGGCC)4 反平行的 G-四聯體結構在 smFRET 測量中可得的 EFRET 值為何，本實驗中使用的 (GGGGCC)4 序列如 2.2.2 節表三所示。我們將 (GGGGCC)4 置於含有各濃度鉀離子的環境中進行黏合反應，並在之後於室溫下改變鉀離子的濃度觀察構形可能產生的改變。首先，我們在無鉀離子的環境中進行黏合反應，之後漸漸地加入 10-150 mM 的鉀離子觀察序列的構形變化，我們可以從圖四十觀察到，從低鹽至高鹽時 EFRET 值的變化約介於 0.74 與 0.78 之間，加入較高濃度的鹽，雖然峰值稍微向右偏移，但若是以漂移的方式向右移動，不似有明顯的結構改變，而較可能為陽離子造成 DNA 骨架上磷酸根的負電被中和而造成構形更為緊密造成的結果[50]，因此我們不認為此處得到的 EFRET 表示了 G-四聯體的結構。由於先前在黃子芸的實驗中，(TGGAA)3 中頭對頭的類髮夾結構之下其 EFRET 值為 0.84[41]，與此實驗的峰值接近，我們猜想這可能代表了類髮夾結構的產生，圖四十一為經由 IDT (Integrated DNA Technologies) 網站所提供的 OligoAnalyzer 3.1 計算而得，此兩種可能的類髮夾結構，雖然非頭對頭的形式，但若是僅差距一或兩個核苷酸，其 EFRET 值為較 0.84 稍低的 0.78 而言的話，有其存在的可能性。. 41.

(53) (GGGGCC)4 annealed in [K+] = 0 mM. [K+]/mM 0. Frequency. 10 30 50 100 150. 0.0. 0.2. 0.4. EFRET. 0.6. 0.8. 1.0. 圖四十、(GGGGCC)4 於無鉀離子的情況下行黏合反應，並再依序注入 10-150 mM 的鉀離子偵測所得的 EFRET 圖. 圖四十一、(GGGGCC)4 序列可能產生的類髮夾結構。摘自參考資料[51]。. 42.

(54) 由於在上一個實驗中並無見到可能為 (GGGGCC)4 所產生的 G-四聯體結構，我們改以在進行進行黏合反應時即加入 10-150 mM 的鉀離子，並且在黏合反應後 DNA 的稀釋、DNA 與束縛於玻片表面、顯影緩衝溶液注入時，DNA 所處環境中的鉀離子濃度皆無時無刻保持與黏合反應時相等，藉此以觀察 (GGGGCC)4 在此條件下所產生的構形，而所得的 EFRET 分布如圖四十二所示，主要有在 0.76 與 0.52 的兩種峰值，且當鉀離子濃度越高時，EFRET = 0.52 的峰值百分比就越高。在 Zhou 團隊的實驗中，將 DNA 加熱至 95oC 再慢速地降溫至室溫，其中他們的條件中含有的鉀離子為 90mM，類似於我們在黏合反應時即加入 10-150 mM 的鉀離子，因此我們認為 EFRET = 0.52 的峰值所代表的構形即是 (GGGGCC)4 產生的 chair-type 反平行結構。在黏合反應中，我們將 DNA 加熱至 95℃維持 6 分鐘，再以-1℃/min 的速率降至 22℃，因此在不同鉀離子下的類髮夾與 G-四聯體結構的比值即可視為 G-四聯體與類髮夾結構間轉換，在 22oC 下的平衡常數，並藉由平衡常數來推算兩結構間自由能的改變量 (ΔG) (表六)。. (GGGGCC)4 annealed in [K+] = 10~150 mM. [K+]/mM 10. Frequency. 30. 50. 100. 150. 0.0. 0.2. 0.4. EFRET. 0.6. 0.8. 1.0. 圖四十二、(GGGGCC)4 於 10-150 mM 鉀離子環境中行黏合反應而成的 EFRET。. 43.

(55) 10 mM K+. 30 mM K+. 50 mM K+. 100 mM K+. 150 mM K+. G-四聯體 (G). 0.21. 0.51. 0.68. 0.83. 0.89. 類髮夾結構 (HP). 0.74. 0.43. 0.27. 0.10. 0.07. Ratio (HP/G). 3.51. 0.84. 0.39. 0.13. 0.08. ΔG /kcal mol-1. -0.74. 0.10. 0.55. 1.20. 1.48. 表六、在 10-150 mM 鉀離子的環境中行黏合反應所得的 G-四聯體與類髮夾結構占所有 EFRET 的比例以及藉[類髮夾結構] : [ G-四聯體]比值計算 G-四聯體與類髮夾結構間轉換於 22oC 下的平衡常數與自由能。. 為了確定 EFRET = 0.52 的峰值所代表的構形即為 G-四聯體結構，我們在顯影緩衝溶液中加入 PDS (全名為 Pyridostatin)，這是一種 G-四聯體的穩定劑 (Gquadruplex stabilizer)，能找到 G-四聯體並與之結合，當試圖以施力將 G-四聯體結構解開時，有 PDS 的結合的情況，比起無 PDS 結合時需要更大的力量才能將此 DNA 的二級結構解開[47]。因此我們將 PDS 加入可能含有 G-四聯體結構的 DNA 中，觀察 EFRET 值的變化情形以了解是否真的有 G-四聯體的產生。在圖四十三中我們可以觀察到，在鉀離子濃度 150 mM 的環境中行黏合反應的 (GGGGCC)4 序列，其主要在 EFRET = 0.52 的峰值，在加入 10 nM 的 PDS 一分鐘過後，漸漸地向左側偏移，並且在 20 分鐘左右時其 EFRET 的峰值約為 0.42，這代表了我們先前假設會出現的 G-四聯體結構的確與 PDS 產生結合並造成構形些微的改變，而使得我們偵測而得的 EFRET 數值向左位移，然而我們在前面預測可能是類髮夾結構，且 EFRET 在 0.78 的峰值，在加入 PDS 之後峰值的位置沒有改變，也代表著產生此結構的 DNA 無法與 PDS 結合而造成構形的變化。. 44.