第三章 材料與方法
3.1 實驗動物
動物品系：Wistar 品系雄性大白鼠(Wistar Albino Rats)，共 120 隻 動物來源：樂斯科實驗動物公司
動物週齡：4~6 週，體重約在 180~220 g 間
飼養方式：空調房間，溫度維持 22±5 ℃，半日照環境，分籠飼養，
自由飲水及餵養標準飼料 3.2 中藥材與配製
四君子湯[27]：
組成 基源植物 藥用部位 比例
人參
Panax ginseng C. A. Mey
乾燥根 2茯苓
Poria cocos (Schw.) Wolf
菌核 2白朮
Atractylodes macrocephala Koidz.
乾燥根莖 2甘草
Clycyrrhiza uralensis Fisch.
乾燥根及根莖 1四物湯[28]：
組成 基源植物 藥用部位 比例
當歸
Angelica sinensis (Oliv.) Diels,
乾燥根 6芎藭
Ligusticum chuanxiong Hort.
乾燥根莖 1赤芍
Paeonia lactiflora Pall.
根 4地黃
Rehmannia glutinosa Libosch.
根莖 6水抽出物之製備：秤重，各藥加水煮沸1 小時，趁熱過濾(兩次)，得
濾液，真空減壓濃縮，得濃縮液。濃縮液進行冷凍乾燥 得乾燥粉末，秤重並計算產率。
基源鑑定：藥材部分委託中國醫藥大學附設醫院中藥局收集並鑑定 基源。所有生藥、抽出物、冷凍乾燥得乾燥粉末都會保 留樣品於本校中國醫學研究所樣品保存室。
四君子：生藥材總重5.2 kg，水煎取液重 21.5 kg，冷凍乾燥粉末重 1.36 kg。產率=26.15%
四物湯：生藥材總重4.8 kg，水煎取液重 20.0 kg，冷凍乾燥粉末重 1.63 kg。產率=33.96%
3.3 實驗動物組數分配
實驗動物分為3、72 與 168 小時三大組，每大組再分為偽實驗組、
肝切除對照組、Silymarin 組、四君子實驗組與四物湯組。(表 3.1)
表3.1 實驗動物組數分配
3 小時 72 小時 168 小時
偽實驗組(sham) 5 5 8
肝切除對照組 8 8 5
Silymarin 組 9 9 9
四君子實驗組 9 9 9
四物湯組 9 9 9
總數 40 40 40
3.4 實驗步驟
實驗動物適應七天後，依上表將實驗動物分為(a)(b)(c)(d)(e)五組：
組(a)為偽實驗組
組(b)為肝切除對照組
組(c)為水飛薊素(Silymarin)組 組(d)為四君子組
組(e)為四物湯組 其中，
(c)組以胃管投與水飛薊素，連續給予七天。(0.025 g/kg)
(d)組以胃管投與四君子湯，連續給予七天。(冷凍乾燥粉末 1.0 g/kg) (e)組以胃管投與四物湯，連續給予七天。(冷凍乾燥粉末 1.0 g/kg) (a)、(b)組則給予同體積之生理食鹽水(normal saline)，連續給予七天。
(b)(c)(d)(e)組於第八天進行部份肝切除手術。
(a)組切開肚皮後即縫合肚皮。
各組大鼠分別於部份肝切除手術完成後 3 小時、72 小時與 168 小 時後犧牲，並於犧牲前30 分鐘以腹腔注射 BrdU(20 mg/kg)。
3.5 2/3 部分肝切除手術步驟
1. 實驗動物以酚巴比妥(Phenobarbital)麻醉後將腹部細毛剔除，並使 其平躺於手術台上。
2. 以酒精局部消毒後，以手術刀延腹部中線處下刀。
3. 毛皮層開口由劍突軟骨至大約腹部中點。
4. 肌肉層開口則由劍突軟骨至大約肝臟下方。
開始適應七天 開始投藥七天 進行部分肝切除手術 三小時組犧牲 (n=40) 七十二小時組犧牲 (n=40) 一百六十八小時組犧牲 (n=40)
5. 稍微撐開切口並切斷 suspensory ligament 使肝臟得以下垂。
6. 以手於切口附近靈活按壓以鬆動肝臟。
7. 另一手於肝臟下方之腹部往前上方按壓，兩手靈活使力而使肝臟之 median 葉與 left lateral 葉露出切口之外。
8. 以手輕輕地取出 median 與 left lateral 葉於紗布之上。
9. 於靠近血管處剪斷另外兩條韌帶。
10. 將露出的肝葉抬起，然後以縫線於其根部血管處打上兩個死結。
11. 於紗布之上對露出的肝葉切數刀以排除血液。
12. 以紗布包裹 median 與 left lateral 葉並給予適當的拉力。
13. 從打結處前方取下肝葉。
14. 縫合肌肉層與毛皮層。
15. 隨後將實驗動物送入恢復室中恢復[61]。 3.6 實驗動物犧牲：
1. 動物犧牲 30 分鐘前由腹腔注入 20 mg/kg 的 BrdU。
2. 動物以乙醚麻醉後由頸動脈採血，並取下剩餘的肝臟秤量以計算肝 重改變率。
3. 採得的血液以 4℃離心機離心後取得血清以供生化檢測。
3.7 石蠟組織切片製作步驟：
將摘取的肝臟浸於10%中性福馬林液中固定，一星期內粗修，厚度 2-3 mm，裝入塑膠包埋盒內，經組織自動脫水機(Processor 2LE)脫 水，脫水後組織塊以石蠟包埋機(Leica, German)固定製成蠟塊，將蠟 塊以手搖切片機(Leica, RM-2145, German)切成 2
µ
m 厚，經 H&E 染 色法染色後，於一般光學顯微鏡下檢視每一種器官之組織病理變化。3.8 免疫組織化學染色(Immunohistochemistry stain)步驟：
3.8.1 PCNA 免疫組織化學染色步驟：
6. 於檢體上滴”Endogenous enzyme block, Dako”數滴，靜置 12 分鐘 後，再以Wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
7. 於檢體上滴”PCNA Primary antibody, Abcam” (以 Dako primary antibody diluent 稀釋 1300 倍)數滴，靜置 30 分鐘後，再以 wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
8. 於檢體上滴“Peroxidase labelled polymer, Dako”數滴，靜置 30 分鐘 後，再以wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
8.5)中和 2 次、各 5 分鐘。
5. 以 Wash solution 沖洗並覆蓋檢體 2 分鐘，此步驟重複兩次。
6. 於檢體上滴”Endogenous enzyme block, Dako”數滴，靜置 12 分鐘 後，再以Wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
7. 於檢體上滴”BrdU Primary antibody, Zymed” (以 Dako primary antibody diluent 稀釋 50 倍)數滴，靜置 60 分鐘後，再以 wash solution 沖洗玻片2 次、各 2 分鐘。
8. 於檢體上滴“Peroxidase labelled polymer, Dako”數滴，靜置 30 分鐘 後，再以wash solution 沖洗玻片 2 次、各 2 分鐘。
9. 於檢體上滴“DAB+, Dako”(以 Dako DAB+ substrate 稀釋 500 倍)數 滴，避光靜置約5 分鐘後，再以 DDW 沖洗玻片。
10. 檢體上滴 Hematoxylin 數滴，靜置約 5 分鐘後再以清水沖洗玻片。
11. 待檢體完全乾燥後再置入 xylene 中脫水。
12. 隨後以阿拉伯膠進行封片[62,64]。 3.9 血清生化值檢測：
經頸靜脈取得之血液於 4 ℃離心機中離心兩次，取得上清液後以 COBAS MIRA PLUS 自動生化分析儀搭配 ROCHE 試劑進行分析。
3.10 肝質量評估方法：
動物稱重、麻醉、採血與犧牲後，打開腹腔，摘取肝臟。肝臟取出 後，清除多餘組織，經生理食鹽水沖洗，擦乾後稱取肝重。殘餘肝重 比率以下列公式計算：
肝重/體重比率(liver/body weight ratio) = 殘餘肝重 / 體重 3.11 細胞計數規則：
經PCNA 或 BrdU 染色之檢體皆於 400 倍顯微鏡下觀察。隨機選取
相近之視野，並以肉眼觀察計數。BrdU 陽性細胞呈現出暗褐色細胞 核，而PCNA 陽性細胞依染色程度不同的分期標準如下：
G0期細胞之細胞核與細胞質無染色；G1 期細胞之細胞核為片狀至 均勻的淡褐色染色，細胞質則無染色；S 期細胞之細胞核為均勻的暗 褐色染色，細胞質亦無染色；G2 期細胞有瀰漫且斑點狀之細胞核與 細胞質染色；M 期細胞有瀰漫之細胞質染色[17]。
3.11.1 PCNA LI 計數：
PCNA LI(labeling index)：是專注於 S 期肝細胞數目的計數方式，
即以染有暗褐至黑色細胞核且無細胞質染色的肝細胞數量除以總肝 細胞數目 (每一檢體至少計數 1000 顆肝細胞) [17]。
3.11.2 PCNA GF 計數：
PCNA GF(growth fraction)：用於評估正處於細胞週期中的肝細胞 數，即以所有染上顏色細胞核的肝細胞(G1+S+G2+M 期)數目除以總 肝細胞數目 (每一檢體至少計數 1000 顆肝細胞) [17]。
3.11.3 BrdU LI 計數：
BrdU LI(labeling index)：即以所有染上暗褐色細胞核的肝細胞(S 期) 數目除以總肝細胞數目(每一檢體至少計數 1000 顆肝細胞)。
3.12 統計方法：
實驗數據以 SAS 軟體執行統計，以 ANOVA 進行變異數分析，以 Bonferroni (Dunn) t Tests 進行事後檢定。結果以雙尾 P<0.05 設為具統 計意義。其中於肝重/體重比、PCNA GF、PCNA LI 與 BrdU LI 中比 較各組間的差異，而於血清學檢查中僅比較各組與對照組間的差異。
第四章 結果
4.1 存活率：
實驗動物存活率 80.0 %，手術死亡數與各組死亡數列於下表(表 4.1)(表 4.2)，其中術後死亡 2 例皆於手術後一天之內。
4.2 肝重/體重比結果：
肝重/體重比是最直接也最普遍被使用來評估肝再生的方法。大鼠 經過 2/3 部分肝切除之後，約在 7~10 天時便能以代償式再生的方式 來恢復大部份的肝質量。
從本次實驗結果看來，部分肝切除 3 小時後，對照組、Silymarin 組與四物湯組的肝重/體重比基本相同，無顯著差異。但四君子湯組 則較對照組略低，且達統計意義(表 4.3)(圖 4.1)。
部分肝切除72 小時後，Silymarin 組與四君子湯組之肝重/體重比明 顯較對照組、四物湯組為高，但各組間的差異尚未達統計意義(表 4.3)(圖 4.2)。
部分肝切除 168 小時後，四君子湯組肝重/體重比最高，與對照組 間雖無顯著差異，但與 Silymarin 組和四物湯組間的差異則具有統計 意義(表 4.3)(圖 4.3)。餘肝檢體圖列於(圖 4.4)。
表4.1 手術死亡數
3 小時 72 小時 168 小時
術前死亡數 0 1 1
術中死亡數 5 8 7
術後死亡數 0 1 1
總計 5/40 10/40 9/40
表4.2 各組死亡數
3 小時 72 小時 168 小時
偽實驗組 0 0 0
對照組 0 2 2
Silymarin 組 1 3 2
四君子實驗組 2 1 3
四物湯組 2 4 2
表4.3 肝重/體重比
3 小時 72 小時 168 小時**
僞實驗組 4.3769 ± 0.00 * 3.9148 ± 0.38 3.1447 ± 0.33 ** # 對照組 1.3832 ± 0.00 * 2.6516 ± 0.54 3.1512 ± 0.39 ** # Silymarin 組 1.1831 ± 0.00 * 3.2979 ± 0.70 2.9025 ± 0.24 ** # 四君子湯組 1.0974 ± 0.00 * 3.1783 ± 0.32 3.5777 ± 0.55 ** # 四物湯組 1.2387 ± 0.00 * 2.7086 ± 0.40 2.9151 ± 0.27 #
**
肝重/體重比之數值表示為平均值±標準差；*：四君子湯組與對照組相較 p <
0.05；**：四君子湯組與 Silymarin 相較 p < 0.05；#：四君子湯組與四物湯組相 較p < 0.05
3小時
Shame Control Silymarin 四君子湯 四物湯
liver/body wt (%)
圖4.1 部分肝切除後 3 小時之肝重/體重比
Shame Control Silymarin 四君子湯 四物湯
liver/body wt (%)
圖4.2 部分肝切除後 72 小時之肝重/體重比
Shame Control Silymarin 四君子湯 四物湯
liver/body wt (%)
圖4.3 部分肝切除後 168 小時之肝重/體重比
*
** #
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(G) (H)
圖 4.4 餘肝葉檢體。3 小時：(A)對照組；(B)Silymarin 組；(C)四君子湯組；
(D)四物湯組。72 小時：(E)對照組；(F)Silymarin 組；(G)四君子湯組；(H)四物 湯組。168 小時：(I)對照組；(J)Silymarin 組；(K)四君子湯組；(L)四物湯組。
(I) (J)
(K) (L)
圖4.4 (續)
4.3 PCNA 增殖標誌結果：
實驗的結果發現，部分肝切除後 3 小時，四君子組之 PCNA GF 亦 較對照組與其他各組為低，但各組間皆未達統計意義(表 4.4)(圖 4.5)。
部分肝切除後 72 小時，四君子組之 PCNA GF 最高，但與對照組和 Silymarin 間並無統計意義。相對地，四物湯組於部分肝切除後 72 小 時之PCNA GF 較低，但僅與四君子湯組相較有達統計意義(表 4.4)(圖 4.6)。部分肝切除後 168 小時，四君子組之 PCNA GF 最高，而四物 湯組與 Silymarin 組較對照組為低，但皆未達統計之意義(表 4.4)(圖 4.7)。
PCNA LI (labeling index) 用於評估處於 S 期肝細胞數目的計數方 式。即在400 倍顯微放大下觀察，並以染有暗褐至黑色細胞核且無細 胞質染色的肝細胞數量除以總肝細胞數目(每一檢體之總肝細胞數至 少1000 顆肝細胞)。
實驗的結果發現，部分肝切除後 3 小時，對照組、Silymarin 組、
四君子組與四物湯組之 PCNA LI 相近，四君子組雖略低，但各組間 的差異尚未達統計意義(表 4.5)(圖 4.8)。部分肝切除後 72 小時，四君 子組、四物湯組與 Silymarin 組之 PCNA LI 皆較對照組為高，其中又 以四君子湯組最高，但各組間之差異依然未達統計之意義(表 4.5)(圖 4.9)。部分肝切除後 168 小時，四君子組之 PCNA LI 最高，Silymarin 組次之，對照組第三，而四物湯組則較對照組為低，但皆未達統計之 意義(表 4.5)(圖 4.10)。部分肝切除後之 PCNA IHC 染色列於後(圖 4.11)。
表4.4 PCNA GF (Groth Fraction)
3 小時 72 小時 168 小時 僞實驗組 54.90% ± 19.26% 61.66% ± 9.33% # 29.23% ± 15.30%
對照組 20.53% ± 14.87% 59.68% ± 7.32% # 32.68% ± 26.86%
Silymarin 組 20.18% ± 18.05% 61.09% ± 6.44% # 24.60% ± 20.52%
四君子湯組
05.51% ± 03.43%
70.35% ± 8.61% # 50.07% ± 19.26%四物湯組 19.09% ± 14.75% 49.31% ± 7.91% # 21.00% ± 18.40%
PCNA GF 之數值表示為平均值±標準差；#：四君子與四物湯組相較 p < 0.05
表4.5 PCNA LI (Labeling Index)
3 小時 72 小時 168 小時 僞實驗組 3.07% ± 1.83% 3.23% ± 3.84% 1.31% ± 1.74%
對照組 0.73% ± 1.49% 1.95% ± 0.67% 0.87% ± 0.92%
Silymarin 組 0.36% ± 0.54% 3.13% ± 1.45% 0.99% ± 1.71%
四君子湯組 0.20% ± 0.32% 3.87% ± 2.62% 1.76% ± 1.04%
四物湯組 0.47% ± 0.69% 2.65% ± 1.98% 0.21% ± 0.16%
PCNA LI 之數值表示為平均值±標準差
3小時
3小時
0%
2%
4%
6%
8%
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
PCNA LI
圖4.8 部分肝切除後 3 小時之 PCNA LI 值
72小時
0%
2%
4%
6%
8%
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
PCNA LI
圖4.9 部分肝切除後 72 小時之 PCNA LI 值
168小時
0%
2%
4%
6%
8%
Sham 對照組 Silymarin 四君子湯 四物湯
PCNA LI
圖4.10 部分肝切除後 168 小時之 PCNA LI 值
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(G) (H)
圖4.11 部分肝切除後之 PCNA IHC 染色。3 小時：(A)對照組；(B)Silymarin 組；(C)四君子組；(D)四物湯組。72 小時之 PCNA IHC 染色：(E)對照組；
(F)Silymarin 組；(G)四君子組；(H)四物湯組。168 小時之 PCNA IHC 染色：(I) 對照組；(J)Silymarin 組；(K)四君子組；(L)四物湯組。(200X)
S
M S
G0
G1 G2
S
G2
G0 G0
M
G1
(I) (J)
(K) (L)
圖4.11 (續)
4.4 BrdU 增殖標誌結果：
BrdU LI(labeling index) 與 PCNA LI (labeling index)類似，皆用於評 估處於S 期肝細胞數目的計數方式。即在 400 倍顯微放大下觀察，並 以染有暗褐至黑色細胞核的肝細胞數量除以總肝細胞數目(每一檢體
BrdU LI(labeling index) 與 PCNA LI (labeling index)類似，皆用於評 估處於S 期肝細胞數目的計數方式。即在 400 倍顯微放大下觀察，並 以染有暗褐至黑色細胞核的肝細胞數量除以總肝細胞數目(每一檢體